四氢-β-咔啉-3-甲酸脂肪链醇酯、其制备、纳米结构、免疫抑制作用及应用

摘要

本发明涉及通式I的6种具有免疫抑制活性的脂肪链醇修饰的咔啉羧酸类似物，式中n＝6、8、10、12、14或16。本发明还涉及它们的制备方法。本发明进一步涉及它们的纳米结构。本发明通过研究所述的饱和脂肪链醇修饰的咔啉羧酸类似物对脾淋巴细胞丝裂原增殖反应的抑制作用以及对小鼠耳后心肌移植后的存活时间，进一步涉及了它们的优秀免疫抑制作用。在制备免疫抑制药物中通式I的6种具有免疫抑制活性的脂肪链醇修饰的咔啉羧酸类似物具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及通式I的6种具有免疫抑制活性的脂肪链醇修饰的咔啉羧酸类似物，式中 n＝6、8、10、12、14或16。本发明还涉及它们的制备方法。本发明进一步涉及它们的纳 米结构。本发明通过研究所述的饱和脂肪链醇修饰的咔啉羧酸类似物对脾淋巴细胞丝裂原 增殖反应的抑制作用以及对小鼠耳后心肌移植后的存活时间，进一步涉及了它们的优秀免 疫抑制作用。在制备免疫抑制药物中通式I的6种具有免疫抑制活性的脂肪链醇修饰的咔 啉羧酸类似物具有广泛的应用前景。本发明属于生物医药领域。

背景技术

数千年前，人们就曾设想用正常的器官组织来置换病变的器官组织，但20世纪前的 移植除角膜移植外，大部分是失败的。直到20世纪40年代，英国外科医生Mdewaar应用 家兔皮肤移植的实验模型，初次论证了器官组织移植中出现的排斥反应本质上是一种免疫 应答反应，从而奠定了移植免疫学的基础。80年代以后，有效的免疫抑制剂如环抱素A 及FK506等的发现及应用，使移植器官的存活时间进一步延长，但是许多有效的免疫抑制 剂有着广泛的毒性，因此，开发新型的免疫抑制剂一直是医药界的研究热点。

2-氨基-[2-(4-辛基苯基)乙基]-1，3-丙二胺盐酸盐(简称为FTY720)是一种来源于冬虫 夏草的新型免疫抑制剂。发明人认识到，从结构上看FTY720属于咔啉羧酸。根据发明人 长期从事咔啉羧酸研究的经验，它应当不同于环孢素A(CsA)、他克莫司(FK506)以及雷 帕霉素(Rapa)，而具有免疫抑制效果明显，毒副作用低等特点。发明人认为FTY720是免 疫抑制剂的优秀先导结构。

在长期研究中，发明人还认识到用饱和脂肪链醇修饰咔啉羧酸能够形成纳米结构。纳 米结构可以改善被修饰的咔啉羧酸的疗效。根据这些认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供通式I代表的6种3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3- 甲酰饱和脂肪链醇酯，式中n＝6、8、10、12、14或16。

本发明的第二个内容是提供通式I代表的6种3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3- 甲酸饱和脂肪链醇酯的制备方法，具体的包括以下步骤：

(1)在水和浓硫酸存在下，色氨酸和1，3-二羟基丙酮生成3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢 -β-咔啉-3-羧酸；

(2)在二环己基羰二亚胺、N-羟基苯并三氮唑、二氯甲烷存在下将3S-1，1-二羟甲基 -2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸与饱和脂肪醇缩合，生成3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉 -3-甲酰饱和脂肪链醇酯。

本发明的第三个内容是测定通式I代表的6种3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3- 甲酸饱和脂肪链醇酯的纳米结构。

本发明解决的第四个内容是，评价通式I代表的6种3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β- 咔啉-3-甲酸饱和脂肪链醇酯的对小鼠脾淋巴细胞对丝裂原的增殖反应的抑制作用。

本发明解决的第无个内容是，评价通式I代表的6种3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β- 咔啉-3-甲酸饱和脂肪链醇酯对小鼠耳后心肌组织移植存活时间的影响。

附图说明

图1通式I的6种3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酸饱和脂肪链醇酯的合成 路线.i)水，浓硫酸；ii)CH₂Cl₂、DCC、HOBt和NMM；2a中n＝6，2b中n＝8，2c中 n＝10，2d中n＝12，2e中n＝14，2f中n＝16.

图22a的透射电镜照片.

图32b的透射电镜照片.

图42c的透射电镜照片.

图52d的透射电镜照片.

图62e的透射电镜照片.

图72f的透射电镜照片.

缩略术语

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们 仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)

将L-色氨酸6.12g(30mmol)，加于100mL水中，冰水浴中缓慢滴加浓硫酸至色氨酸 全部溶解，加入3.24g(36mmol)1，3-二羟基丙酮。24h后反应液变浑浊，可观察到有固体 物质析出，减压过滤并用蒸馏水清洗多次得5.73g(69％)标题化合物。ESI-MS(m/e)：275[M -H]^-

实施例2制备3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-OC₈H₁₇(2a)

将0.83g(3.00mmol)3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸和0.78g(6.00 mmol)CH₃(CH₂)₆CH₂OH溶于20ml二氯甲烷，超声助溶。冰浴下向得到的溶液中加入0.45 g(3.00mmol)N-羟基苯并三氮唑(HOBt)和0.93g(4.50mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)。 冰浴下用N-甲基吗啉(NMM)，调pH 8-9。冰浴条件下搅拌1h，再室温搅拌12h，TLC(二 氯/甲醇＝20∶1)显示产物点生成。滤除二环己基脲(DCU)，滤液补加50ml二氯甲烷。得到 的溶液依次用饱和NaHCO₃水溶液洗、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO₄水溶液洗和饱和 NaCl水溶液洗。有机相用无水Na₂SO₄干燥、过滤、滤液减压浓缩至干。经硅胶柱层析(石 油醚∶丙酮＝5∶1)纯化得0.19g(16％)标题化合物，无黄色胶状物。ESI-MS(m/e)389[M+H]⁺. Mp 116-117℃.¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)：δ/ppm＝8.81 (s，1H)，7.52(d，J＝7.2Hz，1H)，7.34(d，J＝8.1Hz，1H)，7.19-7.09(m，2 H)，4.25-4.15(m，3H)，3.98-3.14(m，6H)，3.21-2.80(m，1H)，2.85-2.23(m，1 H)，1.72-1.65(m，2H)，1.42-1.24(m，10H)，0.89(t，J＝13.2Hz，3H).

实施例3制备3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-OC₁₀H₂₁(2b)

按照实施例2的方法由由1.38g(5.00mmol)3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3- 羧酸和1.19g(7.50mmol)CH₃(CH₂)₈CH₂OH制得，所得化合物经经硅胶柱层析(石油醚∶ 丙酮＝5∶1)纯化得0.35g(17％)标题化合物，为黄色胶状物。ESI-MS(m/e)415[M-H]^-.Mp 112-113℃.¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)：δ/ppm＝8.75(s， 1H)，7.52(d，J＝7.5Hz，1H)，7.34(d，J＝7.8Hz，1H)，7.19-7.09(m，2H)， 4.27-4.12(m，2H)，4.02-3.73(m，5H)，3.20-3.13(m，2H)，2.84-2.75(m，1H)， 1.72-1.65(m，2H)，1.48-1.19(m，14H)，0.90(t，J＝5.7Hz，3H).

实施例4制备3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-OC₁₂H₂₅(2c)

按照实施例2的方法由1.38g(5.00mmol)3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸 和1.39g(7.50mmol)CH₃(CH₂)₁₀CH₂OH制得，所得化合物经经硅胶柱层析(石油醚∶丙酮 ＝5∶1)纯化得0.28g(13％)标题化合物，为黄色胶状物。ESI-MS(m/e)443[M-H]^-.Mp 115-117℃.¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)：δ/ppm＝8.75(s， 1H)，7.52(d，J＝7.5Hz，1H)，7.33(d，J＝8.1Hz，1H)，7.19-7.09(m，2H)， 4.27-4.12(m，2H)，4.00-3.73(m，5H)，3.20-3.13(m，2H)，2.84-2.75(m，1H)， 1.72-1.68(m，2H)，1.48-1.21(m，18H)，0.90(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例5制备3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-OC₁₄H₂₉(2d)

按照实施例2的方法由1.38g(5.00mmol)3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸 和2.14g(10.00mmol)CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH制得，所得化合物经经硅胶柱层析(石油醚∶丙酮 ＝5∶1)纯化得0.26g(11％)标题化合物，为黄色胶状物。ESI-MS(m/e)471[M-H]^-.Mp 114-115 ℃.¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)：δ/ppm＝8.66(s，1H)， 7.52(d，J＝7.5Hz，1H)，7.35(d，J＝7.8Hz，1H)，7.21-7.09(m，2H)，4.24-4.18 (m，2H)，4.04-3.70(m，4H)，3.20-3.14(m，1H)，2.85-2.76(m，3H)，1.73-1.69 (m，2H)，1.50-1.19(m，21H)，0.90(t，J＝6.6Hz，3H).

实施例6制备3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-OC₁₆H₃₃(2e)

按照实施例2的方法由1.38g(5.00mmol)3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸 和1.82g(7.5mmol)CH₃(CH₂)₁₄CH₂OH制得，所得化合物经经硅胶柱层析(石油醚∶丙酮＝ 5∶1)纯化得0.25g(9.8％)黄色胶状物。ESI-MS(m/e)499[M-H]^-.Mp 109-111℃.¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)：δ/ppm＝8.73(s，1H)，7.52(d，J＝7.5 Hz，1H)，7.35(d，J＝7.8Hz，1H)，7.19-7.09(m，2H)，4.22-4.15(m，2H)， 4.01-3.72(m，5H)，3.20-3.13(m，1H)，2.84-2.75(m，1H)，1.72-1.68(m，2H)， 1.48-1.20(m，26H)，0.90(t，J＝6.9Hz，3H).

实施例7制备3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰-OC₁₈H₃₇(2f)

按照实施例2的方法由1.38g(5.00mmol)3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-羧酸 和2.03g(7.5mmol)CH₃(CH₂)₁₆CH₂OH制得，所得化合物经经硅胶柱层析(石油醚∶丙酮＝ 5∶1)纯化得0.24g(9.2％)黄色胶状物。ESI-MS(m/e)527[M-H]^-.Mp 106-107℃.¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)：δ/ppm＝8.66(s，1H)，7.53(d，J＝7.5 Hz，1H)，7.35(d，J＝8.1Hz，1H)，7.21-7.12(m，2H)，4.24-4.18(m，2H)， 4.03-3.69(m，4H)，3.20-3.13(m，1H)，2.85-2.76(m，1H)，1.73-1.69(m，2H)， 1.48-1.18(m，26H)，0.90(t，J＝6.6Hz，3H).

实验例13S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰饱和脂肪醇酯2a-f对小鼠脾淋巴 细胞丝裂原增殖的抑制作用

脱颈处死小鼠，无菌取脾，用200目钢网和注射器芯研磨，用HANK’S液洗两次，1500 转/分条件下离心10分钟，计数后用完全RPMI-1640培养液配成脾细胞5×10⁶/mL的细胞 悬液，加100μL细胞悬液于96孔培养板中(每空含5×10⁵个细胞)。每孔加20μL刀豆 蛋白，终浓度为5μg/mL，若丝裂原为脂多糖，则脂多糖终浓度为20μg/mL。该96孔培 养板置于体积分数为0.05的CO₂饱和湿度的培养箱内37℃培养4h。4h后按预设的浓度 梯度加入待测、经灭菌处理的2a-f(1×10^-4，8×10^-5，5×10^-5，2×10^-5，1×10^-5，8×10^-6， 5×10^-6，1×10^-6)，每个浓度3个复孔，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒。同时设不 含化合物对照孔和只含同量培养液无丝裂原的细胞空白孔。各个孔均重复3次(n＝3)。培养 48h后用MTT法检测化合物对脾淋巴细胞的抑制作用。

按照公式“抑制率＝(D对照-D含药)/D对照×100％”计算不同浓度的化合物对脾 淋巴细胞增殖的抑制作用，根据细胞相对生存率和化合物的浓度绘制细胞生长曲线，利 用该生长曲线求得半数抑制率(^DxIC50)。结果列入表1和表2，结果表明本发明的3S-1，1- 二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰饱和脂肪链醇酯2a-f对小鼠脾淋巴细胞增殖有明确的 抑制作用。

表12a-f对刀豆蛋白诱导的小鼠T细胞增殖的抑制作用

表22a-f对脂多糖诱导的小鼠B细胞增殖的抑制作用

实验例23S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9-四氢-β-咔啉-3-甲酰饱和脂肪链醇酯2a-f对小鼠耳后 心肌组织移植存活的影响

受体小鼠经10％乌拉坦(10毫克/10克体重)腹腔注射麻醉。1％新洁尔灭酊耳廓局部消 毒，剃毛，持眼科剪于耳廓背侧中线之前1/3处作一与耳廓中线垂直处作一3-4毫米长的 切口，勿损伤耳廓静脉。持镊子向耳尖方向钝性分离皮下组织，使之成一管腔。将新生供 鼠置于碎冰中一分钟后用75％酒精皮肤消毒，剖胸摘取心脏。将心脏置于PBS液内搏动 1-2次以排空心腔余血。移植时，用刀片把供心纵向剖成为基本等大二半，肌纤维成一斜 面。将心肌组织移植填入受体鼠耳腔内，将皮肤切口缝合一针。(心肌组织的离体时间不 超过2分钟)用手指轻按局部，使移植物与受鼠之周围组织贴紧。移植术后当天给药。2a-f 每日腹腔注射给药0.2mL，剂量为1μmol/kg，连续给药15天。阳性对照坏孢菌素A每日 腹腔注射给药0.2mL，剂量为2.5μmol/kg，连续给药15天。空白对照生理盐水每日腹腔 注射给药0.2mL，连续给15天。术后第六日起每天记录移植心肌组织的心电信号。测试 异位心电图时，正负电极分别置于移植心脏两侧，接地极连接在小鼠后肢。术后十五天结 束观察、统计移植心脏成活时间。结果列入表3，结果表明本发明的3S-1，1-二羟甲基-2，3，4，9- 四氢-β-咔啉-3-甲酰饱和脂肪链胺2a-f可有效延长小鼠耳后心肌组织移植存活时间。结果 列入表3。结果表明，1μmol/kg剂量的2a-f治疗小鼠移植心脏成活平均时间与2.5μmol/kg 剂量的环孢菌素A治疗小鼠移植心脏成活平均时间没有显著性差异。它们有相同的疗效。

表3小鼠耳后心肌组织移植实验评价结果

n＝12；a)与生理盐水比较P＜0.05.

实验例3不同剂量2d对小鼠耳后心肌组织移植存活的影响

用实施例2的方法，选取10.0μmol/kg、1.0μmol/kg和0.01μmol/kg三种剂量考察2d 的剂量效应关系。结果表明，2d的小鼠耳后心肌组织存活时间用显示剂量依赖性(表4)。

表42d的剂量效应关系

n＝12，a)与1.0μmol/kg组及0.01μmol/kg组比P＜0.05；b)与0.01μmol/kg组比较P＜0.05；c)与

生理盐水比较P＞0.05.

实施例112a-f的自主装性能评价

将2a-f配成浓度为1×10^-12mg/mL的乙醇溶液，然后将此溶液滴在铜网上，挥发干 溶剂后在JEM-1230透射电子显微镜下观察纳米球的形态。测定表明，2a-f形成规则的纳 米结构。