用于人免疫缺陷病毒(HIV)疗法的对接和锁定(DNL)构建体

摘要

本发明涉及利用包含至少一种抗-HIV治疗剂的DNL复合物在受试者中治疗HIV感染的方法和组合物，该至少一种抗-HIV治疗剂附接抗体、抗体片段或PEG。在优选的实施方案中，抗体或片段结合选自gp120、gp41、CD4和CCR5的抗原。在更优选的实施方案中，尽管已知以及可利用其他抗-HIV抗体，但抗体是P4/D10或2G12。在最优选的实施方案中，尽管已知和可利用其他抗-HIV治疗剂，但抗-HIV治疗剂是融合抑制剂，例如T20、T61、T651、T1249、T2635、CP32M或T-1444。可单独施用或者可与一种或多种另外的抗-HIV治疗剂共同施用DNL复合物。

说明书

背景

相关申请

本申请要求2010年11月3日提交的美国临时申请序列No. 61/409,740；2011年5月19日提交的61/487,956；2010年11月17 日提交的61/414,592；以及2011年2月28日提交的美国申请序列 No.13/036,820；2011年2月4日提交的13/021,302；2010年12月 15日提交的12/968,936；2010年12月18日提交的12/949,536的优 先权。各优先申请的文本以引用方式整体本文中。

发明领域

本发明涉及在受感染的受试者中用于治疗人免疫缺陷病毒(HIV) 的方法和组合物。优选地，所述方法和组合物利用通过对接和锁定 (DNL)技术制备的复合物。在特定的实施方案中，DNL复合物包含抗 体或抗体片段，其包括针对HIV包膜抗原例如抗-gp120或抗-gp41抗 体(例如P4/D10、2G12、2F5或4E10)的那些以及诸如依帕珠单抗 (epratuzumab)(抗-CD22)和米拉珠单抗(milatuzumab)(抗-CD74)的其他 目标抗体。在更特定的实施方案中，DNL复合物可包含一种或多种 试剂，例如治疗剂、诊断剂、病毒抑制剂(virostatic agent)和/或细胞毒 素剂，包括但不限于诸如阿霉素的化疗剂。使用下述的DDD(对接和 二聚化结构域)和AD(锚定结构域)结合作用可将这些试剂并入DNL 复合物，或者可使这些试剂直接与DNL复合物缀合。更优选地，DNL 复合物可包含已知具有抗-HIV活性的一种或多种试剂，例如T20(恩 夫韦地(enfuvirtide))HIV融合抑制剂。最优选地，将抗-HIV试剂并入 DNL复合物内改善试剂的药物代谢动力学性质，例如通过增加其血 清半衰期；使得可降低给药频率和/或改善功效。在可选的实施方案 中，DNL复合物可包含一种或多种聚乙二醇(PEG)部分以改善药学代 谢动力学以及降低免疫原性。可单独或联合一种或多种已知抗-HIV 试剂来使用DNL复合物。

相关技术描述

尽管使用抗-逆转录病毒疗法治疗(ART)人免疫缺陷病毒 -1(HIV-1)具有令人鼓舞的优势，但对周围血液和淋巴结的分析证明静 止性T细胞的持续储库的存在，其具有甚至在疗法终止之后多年可自 发激活的潜在原病毒(Berger等人，Proc Natl Acad Sci USA 1998，95： 11511-11513；Blankson等人，Annu Rev Med 2002，53：557-593)。

取决于它的结合特异性和效应子功能，抗体通过以下可用于抑制 HIV的感染，通过阻断病毒进入靶细胞内、引发游离病毒粒子的补体 介导的病毒裂解(Parren等人，AIDS 1999，13[Suppl A]：S137-162)，和/ 或诱导Fc受体介导的活性(Forthal和Moog，Curr Opin HIV AIDS2009， 4：388-393)，其包括用于杀死受感染的细胞、抑制和中和在抗原呈递 细胞上HIV的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，和抗体依赖性细胞介导 的病毒抑制(ADCVI)。迄今为止，用于经HIV感染的患者的免疫疗法 的抗病毒抗体的使用尚未达到它的初始前景(Hinkula等人，J Acquir  Immune Defic Syndr 1994，7：940-951；Trkola等人，Nat Med2005， 11：615-622)。

已经尝试使用各种病毒或细胞组分作为靶以用于抗体递送治疗 剂至HIV-感染的细胞(Davey等人，J Infect Dis1994，170：1180-1188； Pincus等人，J Immunol2003，170：2236-2241；Ramachandran等人，J  Infect Dis1994，170：1009-1013；Saavedra-Lozano等人，Proc Natl Acad  Sci USA2004，101：2494-2499)。已经证实在癌症患者中类似免疫毒素 具有前景(Wu和Senter，Nat Biotechnol 2005，23：1137-1146)。然而，对 治疗HIV-感染的细胞的更加有效的方法和组合物仍存在需求。

发明概述

本发明通过提供用于抑制、阻抑、检测、鉴定、定位和/或消除 HIV和/或HIV-感染的细胞的方法和组合物实现本领域尚未解决的需 求。在某些实施方案中，所述组合物和方法可利用包含结合HIV抗 原的抗体、抗体片段或者其他靶向分子的DNL复合物。HIV-结合分 子可包括但不限于亲和体(affibodies)、单克隆抗体、人源化抗体、嵌 合抗体、人抗体、抗体片段和/或抗体类似物。靶向HIV或抗原呈递 细胞的本领域已知的任何抗体或其片段可并入主题DNL复合物内， 包括但不限于P4/D10、2G12、2F5、4E10和hLL1。

在某些实施方案中，可使HIV靶向分子与一种或多种治疗和/或 诊断剂缀合。这些试剂可包括但不限于药物、前药、病毒抑制剂、毒 素、酶、寡核苷酸、放射性同位素、放射性核素、免疫调节剂、细胞 因子、标记、荧光标记、发光标记、顺磁标记、MRI标记、胶束、脂 质体、纳米粒子或其组合。在可选的实施方案中，通过如下所述的 DNL技术可使HIV靶向分子附接治疗剂。

可向已知或疑似HIV感染的患者施用DNL复合物。可通过任何 本领域已知的途径来施用，例如正位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、 动脉内、鞘内或静脉内注射。可选地，施用可以为口服、鼻子、面颊、 吸入、直肠、阴道或局部。这些施用可破坏循环中的HIV；可阻断或 预防细胞被HIV感染；可减少或消除患者中HIV-感染的细胞；和/ 或可减少或消除在之前和/或同时使用其他已知逆转录病毒疗法治疗 的患者中HIV-感染的细胞的剩余病灶。

熟练技术人员意识到，可单独或联合HIV感染的其他已知治疗 性治疗来施用主题DNL复合物，例如叠氮胸苷(azidothymidine)、其 他核苷/核苷酸逆转录抑制剂、非核苷逆转录抑制剂、HIV蛋白酶抑 制剂和/或融合抑制剂。在某些实施方案中，可联合HAART(高活性 抗-逆转录病毒疗法)来使用缀合的HIV靶向分子。许多抗-HIV治疗 剂是本领域已知的以及可使用任意这些已知试剂，包括但不限于单独 或联合使用的阿巴卡韦(abacavir)、氨多索韦(amdoxovir)、阿立他滨 (apricitabine)、阿扎那韦(atazanavir)、贝韦立马(bevirimat)、胡桐素 A(calanolide A)、CCR5、CD4、塞拉格尼(ceragenin)、可比司他 (cobicistat)、抗病毒蓝藻蛋白-N(cyanovirin-N)、地瑞那韦(darunavir)、 二芳基嘧啶类化合物(diarylpyrimidine)、去羟肌苷(didanosine)、德罗 格韦(dolutegravir)、依法韦仑(efavirenz)、埃替拉韦(elvitegravir)、艾 夫他滨(elvucitabine)、恩曲他滨(emtricitabine)、表没食子儿茶素没食 子酸酯(epigallotachen gallate)、费替那韦(festinavir)、福沙那韦 (fosamprenavir)、膦甲酸(foscarnet)、格瑞弗森(griffithsin)、格鲁博南 A(globoidnan A)、羟基脲(hydroxycarbamide)、茚地那韦(indinavir)、 KP-146、拉米夫定(lamivudine)、来非那韦(lefinavir)、来司韦林 (lersivirine)、洛匹那韦(lopinavir)、米替福新(miltefosine)、MK-2048、 奈非那韦(nelfinavir)、奈韦拉平(nevirapine)、拉西韦(racivir)、雷特格 韦(raltegravir)、利托那韦(ritonavir)、沙奎那韦(saquinavir)、塞利西利 (selicicib)、司他夫定(stafudine)、司他匹定(stampidine)、双脱氧胸苷 (stavudine)、Tat拮抗剂、替诺福韦(tenofovir)、替拉那韦(tipranavir)、 天花粉蛋白(trichosanthin)、TRIM5α、韦瑞康(vivecon)、扎西他滨 (zalcitabine)、齐多夫定(zidovudine)或齐多夫定。

主题DNL复合物可包含附接毒素或肽基融合抑制剂 (peptide-based fusion inhibitor)的多个拷贝的目标抗体或抗体片段。毒 素可具有微生物、植物或动物来源，包括但不限于蓖麻毒、相思豆毒 蛋白、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌 肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外 毒素、假单胞菌内毒素、豹蛙酶(ranpimase)(Rap)或Rap(N69Q)。肽基 融合抑制剂(Naider和Anglister，Curr Opin Struct Biol 2009，19： 473-482)包括但不限于靶向gp41的C-末端螺旋区的那些(例如，T-20、 T1249、C34、DP和西夫韦肽(sifuvirtide))或者靶向gp41的N-末端螺 旋区的那些(例如，IZN17、N38、N42、N36F10和T21)。更优选地， 这些DNL复合物展示以纳摩尔或更低浓度计的抗-HIV活性。

又一实施方案涉及用于递送诸如人工基因或siRNA的治疗性核 算种类的DNL复合物。在这些实施方案中，DNL复合物可包含附接 诸如树状高分子(dendrimer)、鱼精蛋白、组蛋白、含有组氨酸可还原 聚阳离子、阳离子梳型共聚物、壳聚糖-硫胺素焦磷酸酯、聚乙烯亚 胺或聚赖氨酸的核酸载体的一种或多种拷贝的抗-HIV抗体或其片 段。核酸结合聚合物的许多例子是本领域已知的，例如PAMAM、聚 赖氨酸、聚丙烯亚胺、聚乙烯亚胺、聚乙二醇或碳硅烷。通常，载体 分子是聚阳离子以及通过静电作用来结合核酸。如下所讨论，siRNA 或其他治疗性核酸的许多例子是本领域已知的，并且使用本文所述的 DNL复合物可将任意这些已知种类递送至靶细胞、组织、器官或病 原体。

主题(DNL)复合物包含二聚化和对接结构域(DDD)部分的至少两 个拷贝以及锚定结构域(AD)部分的至少一个拷贝。优选地，DDD部 分来自人蛋白激酶A调节亚单位蛋白(RIα、RIβ、RIIα、RIIβ)，而AD 部分来自AKAP(A-激酶锚定蛋白)。DDD部分自发形成二聚体，其然 后结合AD部分以形成DNL复合物。DNL复合物可包含并入AD和 DDD部分内的融合蛋白，但可选地AD和/或DDD部分可通过诸如 化学偶联的其他方法来共价附接效应子部分。并入DNL复合物内的 效应子可包括但不限于蛋白、肽、抗体、抗体片段、免疫调节剂、细 胞因子、白介素、干扰素、结合蛋白、肽配体、载体蛋白、毒素、诸 如豹蛙酶的核糖核酸酶、诸如siRNA的抑制性寡核苷酸、抗原或异 种抗原、诸如PEG的聚合物、酶、治疗剂、激素、细胞毒素剂、抗- 血管生成剂、促细胞凋亡试剂(pro-apoptotic agent)或已知产生生理作 用的任何其他分子。主题DNL复合物可由二聚体、三聚体、四聚体、 五聚体、六聚体或其他多聚体组成。熟练技术人员意识到，DNL技 术使得可有效和可再生形成基本上包括效应子亚单位的任意组合的 多聚体复合物。

本文也描述编码如本文所述的融合蛋白或其他DNL亚单位的分 离的核酸。其他实施方案涉及包括编码核酸序列的表达载体和/或宿 主细胞。在某些优选的实施方案中，宿主细胞可以为使用已经使其适 应在无血清培养基中细胞转化和生长的突变Bcl-2基因转化的Sp2/0 细胞系，例如使用三倍突变Bcl-2基因(T69E、S70E、S87E)。(参见， 例如，美国专利No.7,531,327、7,537,930和7,608,425，其实施例部 分各自以引用方式并入本文。)通过制备编码的蛋白或复合物的标准 技术可培养经编码DNL复合物或DNL复合物的亚单位的表达载体转 染的宿主细胞。有利地，使宿主细胞适应在无血清条件下生长和产生 蛋白。

熟练技术人员意识到，上述的DNL复合物及其用途仅为示例性， 并且用于治疗或诊断用途的DNL复合物的许多其他不同类型均包括 在本发明的范围内。

附图简述

以下附图构成本说明书的一部分，并且将其涵盖以进一步说明本 发明的特定实施方案的某些方面。通过联合本文所示的详细描述来参 考这些附图中一幅或多幅可更好地理解实施方案。

图1A.体外HIV感染的中和。通过使用HIV-1_IIIB实验室菌株孵 育不同浓度的免疫球蛋白，然后分析HIV易受感染的Jurkat T-细胞 的病毒感染来测定免疫球蛋白的中和能力。10μg/ml阿霉素-P4/D10 和未经标记的P4/D10中和的HIV-1_IIIB显著优于HIV阴性血清 (p＝0.001)。

图IB.HIV体外感染的细胞内散布的抑制。为了测试免疫球蛋白 是否能限制HIV-1感染的细胞内散布，将Jurkat T-细胞以0.2％、1％、 3％和5％经感染以及99.8％、99％、97％和95％未受感染的细胞的比 例混合。显示在使用经HIV-1_IIIB感染的3％Jurkat T-细胞和具有不同 浓度的免疫球蛋白的97％未受感染的细胞处理之后HIV-1p24产生。 结果显示为在培养物中7天之后对p24产生的抑制百分比。与未经标 记的P4/D10、对照抗体阿霉素-LL1、游离阿霉素和HIV-阴性血清相 比，0.5或0.05μg/ml的浓度下阿霉素-P4/D10具有对HIV-1p24产生 的显著更好的抑制作用(p＝0.002)。

图2.保护免于HIV-1/MuLV体内感染。使用HIV-1/MuLV感染 的脾细胞在腹膜内(i.p.)攻击小鼠(6-12/组)，并立即使用单克隆抗体 (MAb)或游离阿霉素处理。将未缀合的P4/D10Mab以100-800μg/小 鼠滴定；游离阿霉素100-400μg以及无关阿霉素-hRS7100-200μg。 所有其他处理均以100μg/小鼠给予。在攻击之后十天，收集腹膜腔 细胞以及与HIV易受感染的Jurkat T-细胞混合。在18天内每3-4天 测定在这些细胞培养物中HIV p24产生。显示在使用100μg的Mab 或游离阿霉素处理之后具有p24阳性细胞培养物的小鼠的百分比。仅 来自使用100μg阿霉素-P4/D10处理的小鼠的细胞没有感染性HIV， 这与所有其他组显著不同(p＝0.0001)。

图3.Hex-hA20结合的分析。(A)显示Hex-hA20的竞争性ELISA 对于结合WR2比维妥珠单抗(veltuzumab)具有更高的抗体亲抗原性 (avidity)。在竞争性结合固定化的维妥珠单抗的WR2的存在下，将 Hex-hA20(o)或维妥珠单抗(^■)在不同浓度下孵育。相对mAb浓度绘制 抑制的百分比，并使用软件生成EC₅₀值。(B)如使用PE-缀 合的抗-人Fab(PE-抗-Fab)或者PE-缀合的抗-人Fc(PE-抗-Fc)通过流 式细胞术测定对Daudi细胞的结合。在4℃下进行所有孵育和洗涤。 将Daudi细胞以1x10⁶细胞/mL混悬在1％BSA-PBS中以及使用 Hex-hA20、维妥珠单抗或拉贝珠单抗(labetuzumab)孵育1小时。使用 1％BSA-PBS洗涤细胞，使用PE-抗-Fab或PE-抗-Fc的1∶200稀释物 孵育30分钟，再洗涤一次，然后在PCA上分析。(C)使用 放射性碘化Hex-hA20(^■)、维妥珠单抗(^▲)或利妥昔单抗(rituximab)(○) 以及Raji细胞来进行Scatchard分析。(D)由Daudi或Raji细胞离解。 使用R-藻红蛋白人IgG标记试剂盒(Invitrogen Corp.)经PE 标记Hex-hA20(·)、维妥珠单抗(^■)和利妥昔单抗(^▲)。将细胞混悬在 CM(使用1x10⁶细胞/mL补充有10％FBS的无酚红RPMI1640)中， 并且在室温下各使用65nmol/L的PE-标记的抗体孵育5x10⁵细胞30 分钟。使用CM洗涤细胞两次以去除非结合的抗体，在37℃下在1 μmol/L C_H1-DDD2-Fab-hA20的存在下将其混悬在1.5mL的CM中， 并在上多时间点下分析细胞结合的PE-标记的抗体。 通过使用软件的非线性回归来测定离解半衰期。

图4.细胞增殖的抑制。(A)通过Raji、Ramos或Daudi的4-d MTS 分析来测定体外抗增殖。使用Hex-hA20(o)、维妥珠单抗(^▲)或者维妥 珠单抗+山羊抗-人Fc(^■)来处理细胞。也使用Hex-hA20+山羊抗-人 来处理Daudi细胞。简言之，将细胞以5,000细胞/孔放置在完 全的RPMI1640中的96-孔板中。将以范围为2x10^-8至6.4x 10^-12mol/L的最终浓度与山羊-抗人Fc交联的Hex-hA20、维妥珠单抗 或维妥珠单抗的五倍系列稀释物一式三份加入孔中。将板孵育4天， 此后将20μL的CELLTITER水性单溶液试剂(Aqueous One  Solution Reagent)(Promega Corp.)加入，并继续孵育另外的4小时，此 后在490nm下读板。(B)通过Ramos(左)或Raji(右)的活细胞计数分析 来测定体外抗增殖。将细胞以1x10⁵细胞/mL接种在T-烧瓶中，并 使用规定浓度的维妥珠单抗、Tri-hA20、Tetra-hA20或Hex-hA20处 理。在5天内通过流式细胞术每日一次测定活细胞密度(VCD)。在第 3天，将培养物以1∶2分开以维持对数生长。在规定浓度下将细胞绘 制为在第3、4和5天时测定的活细胞/毫升。

图5(A)通过连接蛋白(Nexin)(左)测定的细胞凋亡，其 显示在使用0.5nmol/L(黑色柱子)或5nmol/L(灰色柱子)的维妥珠单 抗、Tri-hA20、Tetra-hA20或Hex-hA20孵育24-h之后在Raji中诱导 的早期细胞凋亡细胞(膜联蛋白(Annexin)V-PE阳性/7-AAD阴性)的百 分比。通过在Hex-hA20(5nmol/L)、维妥珠单抗(5nmol/L)或抗-IgM(5 μg/mL)的存在下培养的Raji细胞的多半胱天冬酶(右)测定 细胞凋亡，并在使用SR-VAD-FMK染色之后在3、7、16和24小时 处分析。将细胞以2x10⁵细胞/mL接种在新鲜培养基中，以及在37 ℃下使用规定的浓度下的各测试物品孵育至多24小时，并将孔一式 两份处理以用于分析。(B)在人补体的存在下测定在Daudi 细胞中Hex-hA20(o)、依帕珠单抗□()、维妥珠单抗(■)或 CH₃-AD2-IgG-hA20(●)的CDC(左)。相对纳摩尔浓度的log值绘制补 体对照的百分比(与仅使用补体处理的细胞相比在测试样品中活细胞 的数目)。使用Daudi作为靶细胞以及来自两供体的新鲜分离的周围 血液单核细胞作为效应细胞来测定5μg/mL的Hex-hA20、维妥珠单 抗、依帕珠单抗或拉贝珠单抗的ADCC(右)。通过向仅含有靶细胞的 孔加入去污剂来生成100％裂解基准。条线图显示由两供体各自获得 的裂解的百分比。

图6.在人淋巴瘤异种移植模型中Hex-hA20的功效。(A)在第0 天将Daudi细胞(1.5x10⁷)静脉(i.v.)注射至SCID小鼠内。在第1和8 天，给予多组小鼠(n＝9-10)两不同剂量(30或6μg)的Hex-hA20或者 等摩尔量的维妥珠单抗(12.4或2.4μg)。(B)如材料和方法中所述，在 施用对小鼠IL-2受体特异的具有抗小鼠Gr-1腹水和TMβ-1mAb的 Raji细胞之前使SCID小鼠耗竭NK细胞和嗜中性粒细胞。在第0天， 将Raji细胞(1x10⁶)静脉注射至耗竭和未耗竭的小鼠内。在第3、5、 7和11天静脉给予Hex-hA20(465μg)或者维妥珠单抗(200μg)，而给 予对照组盐水。

图7.IgG-(T20)₄DNL复合物的示意图。(A)AD2(SEQ ID NO：4) 和DDD2(SEQ ID NO：2)部分的氨基酸序列。(B)DDD2-接头-聚-组氨 酸-T20部分的氨基酸序列(SEQ ID NO：99)。(C)IgG-AD2和DDD2-T20 亚单位以及DNL复合物的结构。

图8.P4/D10抗体的(A)Vκ链(SEQ ID NO：100)和(B)V_H链(SEQ  ID NO：101)的氨基酸序列。CDR序列标有下划线。

图9A.嵌合的P4/D10(cP4/D10)抗体轻和重链可变区的核苷酸和 氨基酸序列。嵌合抗体的氨基酸可变区序列与鼠P4/D10抗体的那些 相同。(A)嵌合的Vκ链的DNA序列(SEQ ID NO：102)。(B)嵌合的Vκ 链的氨基酸序列(SEQ ID NO：103)。(C)嵌合的V_H链的DNA序列(SEQ  ID NO：104)。(D)嵌合的V_H链的氨基酸序列(SEQ ID NO：105)。

图10.cP4/D10和P4/D10的结合的比较。(A)与涂覆在微量滴定 板上HIV包膜蛋白gpl60的结合的ELISA分析。(B)与gp120的V-3 肽结合的ELISA分析。

图11.如在第9天处通过p24抗原ELISA测定的，在PBMC中 通过h734-(T20)₄、DDD2-T20和T20对HIV-1₆₉₂₀复制的 抑制。(A)以μg/mL计的测试物品的浓度用于x轴。(B)当将测试物品 的摩尔浓度用于x轴时，揭示与DDD2-T20以及T20相比较的 h734-(T20)₄较好效能。

图12.比较用于中和HIV的P4/D10、cP4/D10、h734-(T20)₄和 hLL2-(T20)₄的效能。(A)以50TCID₅₀给药暴露于HIV-1_IIIB的Jurkat T 细胞。(B)以100TCID₅₀给药暴露于HIV-1_IIIB的Jurkat T细胞。(C)以 50 TCID₅₀给药暴露于以HIV-1₆₇₉₄的PBMC。(D)以100TCID₅₀给药 暴露于HIV-1₆₇₉₄的PBMC。

图13.在30天的时间段内通过SAHA的潜伏病毒激活之后在 PBMC中HIV-1的中和。(A)通过p24抗原捕获来监控HIV-1。(B) 通过HIV-阳性培养物的数目来监控HIV-1。(C)在第30天处在使用各 种试剂处理的细胞中病毒阳性培养物显示为培养基处理的对照的百 分比。

图14.hLL2-(T20)₄的血清稳定性。在注射hLL2-(T20)₄之后30- 分钟、6-h、24-h和72-h处由小鼠收集的血清样品中完整hLL2-(T20)₄和所有含有hLL2种类的浓度，比较在注射hLL2之后相同时间点处 由小鼠收集的血清样品中hLL2的浓度。

发明详述

在本申请中引用的所有文件或文件的一部分，包括但不限于专 利、专利申请、文章、书籍和论文，以引用方式明确在此整体并入。

定义

如本文所使用，“一个(a)”或“一种(an)”可表示一种或多于一 种事物。

如本文所使用，术语“和”以及“或”可用于表示连接词或转折 连词。即，除非另有说明，两术语应当理解为等同“和/或”。

如本文所使用，“约”是指在数字的正或负10％内。例如，“约 100”可表示在90和110之间的任意数字。

如本文所述，“抗体”是指全长(即，天然存在或通过正常免疫 球蛋白基因片段重组方法形成)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或者 免疫活性(即，特异性结合)部分或者免疫球蛋白分子的类似物，类似 于抗体片段。

“抗体片段”是诸如F(ab)₂、F(ab′)₂、Fab、Fv、sFv等的抗体的 一部分。无论是何种结构，抗体片段结合通过完整抗体识别的相同抗 原。术语“抗体片段”也包括通过结合特异性抗原以形成复合物的类 似抗体作用的任意合成或遗传工程蛋白。例如，抗体片段包括由可变 区组成的分离的片段(例如由重和轻链的可变区组成的“Fv”片段)、 其中轻和重可变区通过肽接头(“scFv蛋白”)连接的重组单链多肽分 子，以及由模拟高可变区的氨基酸残基组成的最小识别(CDR)单元。

“治疗剂”是用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的例 子包括抗体、抗体片段、药、病毒抑制剂、毒素、酶、核酸酶、激素、 免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合 物、光活性试剂、染料和放射性同位素。其他示例性治疗剂和使用方 法公开在美国专利申请公开No.20050002945、20040018557、 20030148409和20050014207中，其各自以引用方式并入本文。

本文所使用的“中和抗体”或“中和抗体片段”是指与感染剂(例 如病毒)反应和抑制它的感染性的抗体或片段。

“诊断剂”是用于诊断疾病的原子、分子或化合物。可使用的诊 断剂包括但不限于放射性同位素、染料(例如具有生物素-链亲和素复 合物)、造影剂、荧光化合物或分子，以及用于磁共振成像(MRI)的增 强剂(例如，顺磁离子)。

“免疫缀合物”是分子(例如，抗体组分)与原子、分子或高阶结 构(higher-ordered structure)(例如，与载体、治疗剂或诊断剂)结合的缀 合物。

“裸抗体”是未与任何其他试剂缀合的抗体。

“载体”是能够与治疗剂或诊断剂缔合以便于递送这些试剂至靶 向细胞的原子、分子或高阶结构。载体可包括脂质(例如，能够形成 高阶结构的两亲性脂质)、多糖(例如葡聚糖)、蛋白、肽、肽类似物、 肽衍生物或其他高阶结构，例如胶束、脂质体或纳米粒子。在某些实 施方案中，例如通过在蛋白或肽中使用D-氨基酸取代天然存在的L- 氨基酸可设计载体抵抗蛋白水解或其他酶促降解。

如本文所使用，术语“抗体融合蛋白”是指重组产生的抗原结合 分子，其中使具有相同或不同特异性的两种或更多种相同或不同scFv 或抗体片段连接。融合蛋白的效价表明融合蛋白对单个抗原或表位具 有多少个结合臂(binding arm)或位点；即，单价、二价、三价或多价。 抗体融合蛋白的多价表示在与抗原结合中它可利用多种相互作用，因 而增加对抗原结合的抗体亲抗原性。特异性表明抗体融合蛋白能够结 合多少抗原或表位；即，单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。 使用这些定义，诸如IgG的天然抗体为二价，因为它具有两个结合臂， 但为单特异性，因为它结合一个表位。单特异性、多价融合蛋白具有 对于表位的多于一个结合位点，但仅结合一个这种表位，例如与相同 抗原反应的具有两个结合位点的双特异抗体(diabody)。融合蛋白可包 含单个抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性组合，或者相同抗 体组分的多个拷贝。融合蛋白可另外包含抗体或抗体片段以及治疗 剂。适合这些融合蛋白的治疗剂的例子包括免疫调节剂(“抗体-免疫 调节剂融合蛋白”)和毒素(“抗体-毒素融合蛋白”)。一种优选的毒 素包含核糖核酸酶(RNA酶)，优选为重组RNA酶。

如果施用的量为生理上显著的，则据认为，以“治疗有效量”施 用本文所述的抗体或免疫缀合物制剂或组合物。如果它的存在导致接 受哺乳动物的生理上可检测改变，则试剂为生理上显著的。尤其，如 果它的存在降低、抑制或消除HIV-感染的细胞或者降低、抑制或消 除未受感染的细胞的HIV感染，则抗-HIV抗体制剂为生理上显著的。

如果接受患者可容忍它的施用，则据认为，组合物为“药学上可 接受的载体”。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上可接受的载体的一个例 子。其他合适的载体是本领域众所周知的。参见，例如， REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(Mack  Publishing Co.1995)，以及Goodman和Gilman的THE  PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS(Goodman等人 编辑，Macmillan Publishing Co.，New York，1980和2001版)。

使用的缩略语为：

ABS，含有150mM氯化钠的醋酸钠缓冲剂；

ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；

DNL，对接和锁定；

DTT，二硫苏糖醇；

ELISA，酶联免疫吸附测定法；

ART，抗逆转录病毒疗法；

HIV，人免疫缺陷病毒；

MAb或mAb，单克隆抗体；

MuLV，鼠白血病病毒；

PBMC，周围血液单核细胞；

TCID₅₀，50％组织培养感染剂量

使用DNL方法以制备大量多聚体构建体(参见，例如，美国专利 No.7,521,056、7,527,787、7,534,866、7,550,143和7,666,400，其实 施例部分各自以引用方式并入本文。DNL方法能够以非常高的再现 性和效率接合在稳定复合物中几乎任何目标效应子亚单位。通常， DNL利用由cAMP-依赖性蛋白激酶调节亚单位衍生的二聚化和对接 结构域(DDD)序列以及由各种AKAP蛋白中任意衍生的锚定结构域 (AD)序列之间的特异性和高亲合力结合作用。可使DDD和AD肽附 接任意蛋白、肽或其他分子。因为DDD序列自发二聚化和结合AD 序列，所以DNL技术使得可在可附接DDD或AD序列的任意选择 的分子之间形成复合物。尽管标准DNL复合物包含具有附接一个 AD--连接的分子的两个DDD-连接的分子的三聚体，但在复合物结构 中变化使得可形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和其他 多聚体。

在一些实施方案中，DNL复合物可包含两种或更多种抗体、抗 体片段或融合蛋白，其结合相同抗原的不同表位或者结合两种或更多 种不同抗原。DNL复合物也可包含一种或多种其他效应子，例如蛋 白、肽、免疫调节剂、细胞因子、白介素、干扰素、结合蛋白、肽配 体、载体蛋白、毒素、诸如豹蛙酶的核糖核酸酶、诸如siRNA的抑 制性寡核苷酸、诸如PEG的聚合物、酶、治疗剂、激素、细胞毒素 剂、抗-血管生成剂、促细胞凋亡试剂或任意其他分子或聚集体。

DNL方法利用出现在cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚 单位以及A-激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定结构域(AD)之间的特异性 蛋白/蛋白质相互作用(Baillie等人，FEBS Letters.2005；579：3264. Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。在通过第二信 使cAMP与R亚单位的结合触发的研究最好的信号转导途径之一中 起着中心作用的PKA是在1968年首先由兔骨骼肌中分离出来的 (Walsh等人，J.Biol.Chem.1968；243：3763)。全酶的结构由通过R亚 单位保持非活性形式的两个催化亚单位组成(Taylor，J.Biol.Chem. 1989；264：8443)。发现PKA的同工酶具有两类R亚单位(RI和RII)， 并且各类型具有α和β同种型(Scott，Pharmacol.Ther.1991；50：123)。 因此，PKA调节亚单位的四种同种型为RIα、RIβ、RIIα和RIIβ。仅 将R亚单位作为稳定的二聚体分离，并且显示二聚化结构域由前44 个氨基末端残基组成(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6：222)。 cAMP与R亚单位的结合导致广谱性丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性 催化亚单位释放，通过经其与AKAP的对接的PKA的区室化使该活 性催化亚单位针对选择的底物定向(Scott等人，J.Biol.Chem. 1990；265；21561)。

自从第一种AKAP、微管相关蛋白-2在1984年被表征以来 (Lohmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984；81：6723)，位于包括 质膜、微丝细胞骨架、核、线粒体和内质网的各种亚细胞位点的超过 50种AKAP经识别在酵母至人的种属中具有不同结构(Wong和Scott， Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。对于PKA的AKAP的AD为 14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等人，J.Biol.Chem.1991；266： 14188)。在个体AKAP之间的AD的氨基酸序列非常不同，其RII二 聚体所报道的亲合力的范围为2至90nM(Alto等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA.2003；100：4445)。AKAP仅结合二聚的R亚单位。对于人 RIIα，AD结合通过23个氨基末端残基形成的疏水表面(Colledge和 Scott，Trends Cell Biol.1999；6：216)。因此，人RIIα的二聚化结构域 和AKAP结合结构域均位于相同N-末端的44个氨基酸序列内 (Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6：222；Newlon等人，EMBO J. 2001；20：1651)，在本文中其称为DDD。

我们已经开发平台技术以利用人PKA调节亚单位的DDD以及 AKAP的AD作为用于对接以下称为A和B的任意两实体至非共价 复合物内的接头组件的极佳对，通过在策略位置处引入半胱氨酸残基 至DDD和AD内以便于形成二硫键可进一步将该非共价复合物锁定 至DNL复合物内。“对接和锁定”途径的一般方法如下。通过连接 DDD序列至A的前体来构建实体A，得到以下称为a的第一组分。 因为DDD序列作用于二聚体的自发形成，A因而由a₂组成。通过连 接AD序列与B的前体来构建实体B，得到以下称为b的第二组分。 在a₂中含有的DDD的二聚基序生成用于结合在b中含有的AD序列 的对接位点，因而使得a₂和b容易缔合以形成由a₂b组成的二元、 三聚复合物。经二硫桥键共价固定两实体的随后反应使得该结合事件 不可逆，因为初始结合作用应当使得活性硫醇基团位于DDD和AD 上至更加接近(Chmura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98：8480) 以位点特异性连接，所以基于有效局部浓度的原理其非常有效地发 生。使用接头、衔接子组件和前体的各种组合，可产生和使用不同化 学计量的大量DNL构建体，包括但不限于二聚、三聚、四聚、五聚 和六聚DNL构建体(参见，例如，U.S.No.7,550,143、7,521,056、 7,534,866、7,527,787和7,666,400)。

通过远离两前体的官能团来附接DDD和AD，也预期这些位点 特异性连接保存两前体的原来的活性。该方法本质上为模块化的，并 可能应用以位点特异性和共价连接大量物质，包括肽、蛋白、抗体、 抗体片段和具有大量活性的其他效应子部分。利用在以下实施例部中 描述的构建AD和DDD缀合的效应子的融合蛋白方法，可将几乎任 何蛋白或肽并入DNL构建体内。然而，技术并不受限制，并可利用 其他缀合方法。

已知制备融合蛋白的各种方法(包括核酸合成、杂交和/或扩增) 以制备编码目标融合蛋白的合成双链核酸。通过标准分子生物技术可 将这些双链核酸插入表达载体内以用于融合蛋白制备(参见，例如 Sambrook等人，Molecular Cloning，A laboratory manual，第2版， 1989)。在这些优选的实施方案中，可使AD和/或DDD部分附接效 应子蛋白或肽的N-末端或C-末端。然而，熟练技术人员意识到，取 决于在它的生理活性中涉及的效应子部分以及一部分效应子部分的 化学性质，AD或DDD部分与效应子部分附接位置可变化。使用本 领域已知技术可进行各种效应子部分的位点特异性附接，例如使用二 价交联试剂和/或其他化学缀合技术。

在AD和DDD部分中结构-功能关系

对于不同类型的DNL构建体，可利用不同的AD或DDD序列。 以下提供示例性DDD和AD序列。

DDD1

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID  NO：1)

DDD2

CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID  NO：2)

AD1

QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：3)

AD2

CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO：4)

熟练技术人员意识到，DDD1和DDD2基于蛋白激酶A的人RIIα 同种型的DDD序列。然而，在可选的实施方案中，如以下DDD3、 DDD3C和AD3所例证，DDD和AD部分可基于蛋白激酶A的人RIα 形式的DDD序列以及对应AKAP序列。

DDD3

SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK (SEQ ID NO：5)

DDD3C

MSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEE AK(SEQ ID NO：6)

AD3

CGFEELAWKIAKMIWSDVFQQGC(SEQ ID NO：7)

在其他可选的实施方案中，在DNL复合物的结构中可利用AD 和/或DDD部分的其他序列变体。例如，仅有人PKA DDD序列的四 种变体，其对应于PKA RIα、RIIα、RIβ和RIIβ的DDD部分。RIIα DDD 序列是以上公开的DDD1和DDD2的基础。以下显示四种人PKA  DDD序列。DDD序列表示RIIα的残基1-44、RIIβ的1-44、RIα的 12-61以及RIβ的13-66。(注意，DDD1的序列由人PKA RIIα DDD 部分稍作修饰。)

PKA RIα

SLRECELYVQKHNIQALLKDVSIVQLCTARPERPMAFLREYFEKLEKEEAK (SEQ ID NO：8)

PKA RIβ

SLKGCELYVQLHGIQQVLKDCIVHLCISKPERPMKFLREHHFEKLEKEENRQILA (SEQ ID NO：9)

PKA RIIa

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVGQQPPDLVDFAVEYFTRLREARRQ(SEQ ID  NO：10)

PKA RIIβ

SIEIPAGLTELLQGFTVEVLRHQPADLLEFALQHFTRLQQENER(SEQ ID  NO：11)

AD和DDD结构域的结构-功能关系是研究的主题。(参见，例如， Burns-Hamuro等人，2005，Protein Sci 14：2982-92；Carr等人，2001， J Biol Chem276：17332-38；Alto等人，2003，Proc Natl Acad Sci USA  100：4445-50；Hundsrucker等人，2006，Biochem J396：297-306；Stokka 等人，2006，Biochem J400：493-99；Gold等人，2006，Mol Cell  24：383-95；Kinderman等人，2006，Mol Cell24：397-408，其全部文本 各自以引用方式并入本文。)

例如，Kinderman等人(2006，Mol Cell24：397-408)检查AD-DDD 结合作用的晶体结构，并推断人DDD序列含有对二聚体形成或 AKAP结合均重要的大量保守的氨基酸残基，其在以下SEQ ID NO：1 标有下划线。(参见Kinderman等人的图1，2006，其以引用方式并入 本文。)熟练技术人员意识到，在设计DDD序列的序列变体中，人们 最好避免改变任何标有下划线的残基，但对二聚化和AKAP结合并 不那么关键的残基可进行保守氨基酸取代。

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：1)

如以下更加详细所讨论，保守氨基酸取代的特征在于各20种常 见L-氨基酸。因此，基于Kinderman(2006)的数据和保守氨基酸取代， 在表1中显示基于SEQ ID NO：1的潜在可选的DDD序列。在设计表 1中，仅考虑到高保守氨基酸取代。例如，带电荷的残基仅取代相同 电荷的残基；具有小侧链的残基被小尺寸的残基取代；羟基侧链仅被 其他羟基取代等。因为脯氨酸对氨基酸二级结构的独特作用，所以没 有其他残基取代脯氨酸。即使利用这些保守型取代，但对于44个残 基的肽仍有超过两千万可能的可选的序列 (2x3x2x2x2x2x2x2x2x2x2x2x2x2x2x4x2x2x2x2x2x4x2x4)。少数这些 潜在可选的DDD部分序列显示在以下SEQ ID NO：12至SEQ ID NO： 31中。熟练技术人员意识到，通过标准技术可构建在DDD部分的种 类内可选分类的几乎不受限制的数量，例如使用市售肽合成仪或者众 所周知的定位诱变技术。通过诸如公开在Alto等人(2003，Proc Natl  Acad Sci USA100：4445-50)中的标准结合分析也可容易地测定氨基酸 取代对AD部分结合的作用。

表1.在DDD1(SEQ ID NO：1)中保守氨基酸取代。如SEQ ID NO：90 所公开的共有序列。

THIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：12)

SKIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：13)

SRIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：14)

SHINTPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：15)

SHIQIPPALTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：16)

SHIQIPPGLSELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：17)

SHIQIPPGLTDLLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：18)

SHIQIPPGLTELLNGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：19)

SHIQIPPGLTELLQAYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：20)

SHIQIPPGLTELLQGYSVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：21)

SHIQIPPGLTELLQGYTVDVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：22)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLKQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：23)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRNQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：24)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQNPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：25)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPELVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：26)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVDFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：27)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFLVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：28)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFIVEYPTRLREARA(SEQ ID NO：29)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFVVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：30)

SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVDYFTRLREARA(SEQ ID NO：31)

Alto等人(2003，Proc Natl Acad Sci USA 100：4445-50)进行各种 AKAP蛋白的AD序列的生物信息分析以设计具有对DDD结合常数 为0.4nM的称为AKAP-IS(SEQ ID NO：3)的RII选择性AD序列。将 AKAP-IS序列设计为AKAP与PKA结合的肽拮抗剂。在其中取代倾 向于降低与DDD结合的AKAP-IS序列中残基在以下SEQ ID NO：3 中标有下划线。熟练技术人员意识到，在设计AD序列的序列变体中， 人们最好避免改变任何标有下划线的残基，但对DDD结合并不那么 关键的残基可进行保守氨基酸取代。表2显示在AKAP-IS的序列 (AD1，SEQ ID NO：3)中潜在保守氨基酸取代，其类似于在以上表1中 所显示的DDD1(SEQ ID NO：1)。

即使使用这些保守型取代，对17个残基AD1(SEQ ID NO：3)肽 序列仍有超过三万五千种可能的可选的序列 (2x3x2x4x3x2x2x2x2x2x2x4)。少数这些潜在可选的AD部分序列显示 在以下SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：49中。再次，基于Alto等人(2003) 的数据，通过熟练技术人员可制备、测试和使用在可能AD部分序列 的种类内的大量类别。注意，Alto(2003)的图2显示基于实际结合实 验可进行的更大数量的潜在氨基酸取代，同时保留与DDD部分的结 合活性。

AKAP-IS

QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：3)

表2.在AD1(SEQ ID NO：3)中的保守氨基酸取代。如SEQ ID NO：91 所公开的共有序列。

NIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：32)

QLEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：33)

QVEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：34)

QIDYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：35)

QIEFLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：36)

QIETLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：37)

QIESLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：38)

QIEYIAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：39)

QIEYVAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：40)

QIEYLARQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：41)

QIEYLAKNIVDNAIQQA(SEQ ID NO：42)

QIEYLAKQIVENAIQQA(SEQ ID NO：43)

QIEYLAKQIVDQAIQQA(SEQ ID NO：44)

QIEYLAKQIVDNAINQA(SEQ ID NO：45)

QIEYLAKQIVDNAIQNA(SEQ ID NO：46)

QIEYLAKQIVDNAIQQL(SEQ ID NO：47)

QIEYLAKQIVDNAIQQI(SEQ ID NO：48)

QIEYLAKQIVDNAIQQV(SEQ ID NO：49)

Gold等人(2006，Mol Cell24：383-95)利用结晶学和肽筛选以开发 SuperAKAP-IS序列(SEQ ID NO：50)，其表现出与RI同种型相比对 PKA的RII同种型的五阶数量级的更高选择性。标有下划线的残基表 明相对AKAP-IS序列的氨基酸取代的位置，其增加与RIIα的DDD 部分的结合。在该序列中，N-末端Q残基编号为残基数4以及C-末 端A残基是残基数20。可在其中进行取代以影响对RIIα的亲合力的 残基为残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等人，2006)。据预 估，在某些可选的实施方案中，SuperAKAP-IS序列可取代AKAP-IS AD部分序列以制备DNL构建体。其他可取代AKAP-IS AD序列的 可选的序列显示在SEQ ID NO：51-53中。与AKAP-IS序列相关的取 代标有下划线。据预计，与在SEQ ID NO：4中所显示的AD2序列一 样，AD部分也可包括另外的N-末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C- 末端残基甘氨酸和半胱氨酸。

SuperAKAP-IS

QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQ ID NO：50)

可选的AKAP序列

QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：51)

QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：52)

QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：53）

Gold等人的图2公开来自以下所示的各种AKAP蛋白的另外的 DDD-结合序列

RII-特异性AKAP

AKAP-KL

PLEYQAGLLVQNAIQQAI(SEQ ID NO：54)

AKAP79

LLIETASSLVKNAIQLSI(SEQ ID NO：55)

AKAP-Lbc

LIEEAASRIVDAVIEQVK(SEQ ID NO：56)

RI-特异性AKAP

AKAPce

ALYQFADRFSELVISEAL(SEQ ID NO：57)

RIAD

LEQVANQLADQIIKEAT(SEQ ID NO：58)

PV38

FEELAWKIAKMIWSDVF(SEQ ID NO：59)

双特异性AKAP

AKAP7

ELVRLSKRLVENAVLKAV(SEQ ID NO：60)

MAP2D

TAEEVSARIVQVVTAEAV(SEQ ID NO：61)

DAKAP1

QIKQAAFQLISQVILEAT(SEQ ID NO：62)

DAKAP2

LAWKIAKMIVSDVMQQ(SEQ ID NO：63)

Stokka等人(2006，Biochem J 400：493-99)也开发在SEQ ID  NO：64-66所显示的AKAP与PKA结合的肽竞争剂。肽拮抗剂称为 Ht31(SEQ ID NO：64)、RIAD(SEQ ID NO：65)和PV-38(SEQ ID  NO：66)。Ht-31肽表现出对PKA的RII同种型的更高亲合力，而RIAD 和PV-38显示对RI更高亲合力。

Ht31

DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO：64)

RIAD

LEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO：65)

PV-38

FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQ ID NO：66)

Hundsrucker等人(2006，Biochem J 396：297-306)开发又其他 AKAP与PKA结合的其他肽竞争剂，其具有对PKA的RII形式的 DDD的低至0.4nM的结合常数。各种AKAP拮抗肽的序列提供在 Hundsrucker等人的表1中，将其转载于以下表3中。AKAPIS展示 合成RII亚单位-结合肽。所有其他肽均由指定AKAP的RII-结合结 构域衍生。

表3.AKAP肽序列

肽序列

AKAPIS            QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：3)

AKAPIS-P          QIEYLAKQIPDNAIQQA(SEQ ID NO：67)

Ht31              KGADLIEEAASRIVDAVIEQVKAAG(SEQ ID NO：68)

Ht31-P            KGADLIEEAASRIPDAPIEQVKAAG(SEQ ID NO：69)

AKAP7δ-wt-pep    PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：70)

AKAP7δ-L304T-pep PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：71)

AKAP7δ-L308D-pep PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：72)

AKAP7δ-P-pep     PEDAELVRLSKRLPENAVLKAVQQY(SEQ ID NO：73)

AKAP7δ-PP-pep    PEDAELVRLSKRLPENAPLKAVQQY(SEQ ID NO：74)

AKAP7δ-L314E-pep PEDAELVRLSKRLVENAVEKAVQQY(SEQ ID NO：75)

AKAP1-pep         EEGLDRNEEIKRAAFQIISQVISEA(SEQ ID NO：76)

AKAP2-pep         LVDDPLEYQAGLLVQNAIQQAIAEQ(SEQ ID NO：77)

AKAP5-pep         QYETLLIETASSLVKNAIQLSIEQL(SEQ ID NO：78)

AKAP9-pep         LEKQYQEQLEEEVAKVIVSMSIAFA(SEQ ID NO：79)

AKAP10-pep        NTDEAQEELAWKIAKMIVSDIMQQA(SEQ ID NO：80)

AKAP11-pep        VNLDKKAVLAEKIVAEAIEKAEREL(SEQ ID NO：81)

AKAP12-pep        NGILELETKSSKLVQNIIQTAVDQF(SEQ ID NO：82)

AKAP14-pep        TQDKNYEDELTQVALALVEDVINYA(SEQ ID NO：83)

Rab32-pep         ETSAKDNINIEEAARFLVEKILVNH(SEQ ID NO：84)

参照AKAP IS序列(SEQ ID NO：3)通过标记下划线来标示在不同 AKAP蛋白的AD结构域之间高度保守的残基。除了添加C-末端丙 氨酸残基之外，残基与Alto等人(2003)观察到的相同。(参见 Hundsrucker等人(2006)的图4，其以引用方式并入本文。)对RII DDD 序列具有特别高亲合力的肽拮抗剂的序列是AKAP-IS、 AKAP7δ-wt-pep、AKAP7δ-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep中那些。

AKAP-IS

QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：3)

Carr等人(2001，J Biol Chem 276：17332-38)检查在来自人和非人 蛋白的不同AKAP-结合DDD序列之间序列同源性的程度以及识别在 DDD序列中残基，其在不同DDD部分中表现为最高保守。通过参照 SEQ ID NO：1的人PKA RIIαDDD序列标记下划线来如下标示这些。 通过斜体字进一步标示特别保守的残基。残基与通过Kinderman等人 (2006)表明的对与AKAP蛋白的结合重要的那些重叠，但不相同。熟 练技术人员意识到，在设计DDD的序列变体中，最优选避免改变最 保守的残基(斜体字表示)，并且也优选避免改变保守的残基(标记下划 线)，对于既未标记下划线也未斜体表示的残基可考虑保守氨基酸取 代。

基于Carr等人(2001)的数据，对DDD1(SEQ ID NO：1)序列的保 守氨基酸取代的修饰集合显示在表4中。即使使用取代序列的该减少 集合，仍有超过65,000种在未过度实验下通过熟练技术人员可制备、 测试和使用的可能的可选的DDD部分序列。熟练技术人员可容易得 到如表1和表2以上所公开的这些可选的DDD氨基酸序列。

表4.在DDD1(SEQ ID NO：1)中的保守氨基酸取代。如SEQ ID  NO：92所公开的共有序列。

熟练技术人员意识到，使用在领域中标准的技术和仅常规实验， 可利用在DDD或AD氨基酸序列中这些和其他氨基酸取代以制备在 AD或DDD部分的种类内可选的类别。

氨基酸取代

在可选的实施方案中，所公开的方法和组合物可涉及具有一种或 多种经取代的氨基酸残基的蛋白或肽的制备和用途。例如，可如上所 讨论修饰用于制备DNL构建体的DDD和/或AD序列。

熟练技术人员意识到，通常，氨基酸取代通常涵盖使用相对类似 性质的另一氨基酸取代氨基酸(即，保守氨基酸取代)。各种氨基酸的 性质以及氨基酸取代对蛋白结构和功能的作用是本领域大量研究和 知识的主题。

例如，可考虑氨基酸的亲水指数(Kyte & Doolittle，1982，J.Mol. Biol.，157：105-132)。氨基酸的相关亲水特性作用于所得蛋白的二级 结构，其反过来定义蛋白与其他分子的相互作用。基于其疏水性和电 荷特征已经指定各氨基酸的亲水指数(Kyte & Doolittle，1982)，这些 为：异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、 半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、 苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、 组氨酸(-3.2)、谷氨酸盐(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬 酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)以及精氨酸(-4.5)。在进行保守型取代中，优 选使用亲水指数在±2内的氨基酸；更优选±1内；并且甚至更优选± 0.5内。

氨基酸取代也可考虑到氨基酸残基的亲水性(例如，美国专利No. 4,554,101)。已经指定氨基酸残基的亲水性值：精氨酸(+3.0)、赖氨酸 (+3.0)、天冬氨酸(+3.0)、谷氨酸盐(+3.0)、丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺 (+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5.+-.1)、 丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、缬氨酸 (-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、 色氨酸(-3.4)。优选使用类似亲水性的其他氨基酸来取代氨基酸。

其他考虑包括氨基酸侧链的尺寸。例如，通常并不优选使用诸如 甘氨酸或丝氨酸的紧凑侧链、使用诸如色氨酸或酪氨酸的庞大侧链来 取代氨基酸。也考虑各种氨基酸残基对蛋白二级结构的作用。通过经 验研究，已经测定不同氨基酸残基对蛋白结构域采用α-螺旋、β-折叠 或反转二级结构的趋向的作用，并且这在本领域为已知的(参见，例 如，Chou & Fasman，1974，Biochemistry，13：222-245；1978，Ann.Rev. Biochem.，47：251-276；1979，Biophys.J.，26：367-384)。

基于这些考虑和广泛经验研究，已经构建保守氨基酸取代的表 格，并且在本领域为已知。例如：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天冬 氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸 和异亮氨酸。可选地：Ala(A)leu、ile、val；Arg(R)gln、asn、lys； Asn(N)his、asp、lys、arg、gln；Asp(D)asn、glu；Cys(C)ala、ser； Gln(Q)glu、asn；Glu(E)gln、asp；Gly(G)ala；His(H)asn、gln、lys、 arg；Ile(I)val、met、ala、phe、leu；Leu(L)Val、met、ala、phe、ile； Lys(K)gln、asn、arg；Met(M)phe、ile、leu；Phe(F)leu、val、ile、 ala、tyr；Pro(P)ala；Ser(S)、thr；Thr(T)ser；Trp(W)phe、tyr；Tyr (Y)trp、phe、thr、ser；Val(V)ile、leu、met、phe、ala。

对氨基酸取代的其他考虑包括残基是否位于蛋白的内部或者是 否暴露于溶剂中。对于内部残基，保守型取代包括：Asp和Asn；Ser 和Thr；Ser和Ala；Thr和Ala；Ala和Gly；Ile和Val；Val和Leu； Leu和Ile；Leu和Met；Phe和Tyr；Tyr和Trp。(参见，例如，在 rockefeller.edu处的PROWL网站。)对于暴露残基的溶剂，保守型取 代包括：Asp和Asn；Asp和Glu；Glu和Gln；Glu和Ala；Gly和 Asn；Ala和Pro；Ala和Gly；Ala和Ser；Ala和Lys；Ser和Thr； Lys和Arg；Val和Leu；Leu和Ile；Ile和Val；Phe和Tyr。(同前) 已经构建各种矩阵以辅助选择氨基酸取代，例如PAM250评分矩阵、 Dayhoff矩阵、Grantham矩阵、McLaclan矩阵、Doolittle矩阵、Henikoff 矩阵、Miyata矩阵、Fitch矩阵、Jones矩阵、Rao矩阵、Levin矩阵 和Risler矩阵(同上)。

在测定氨基酸取代中，人们也可考虑分子间或分子内键的存在， 例如在带正电荷的残基(例如，His、Arg、Lys)以及带负电荷残基(例 如，Asp、Glu)之间形成离子键(盐桥)或者在相邻的半胱氨酸残基之间 形成二硫键。

在编码的蛋白序列中使用任何其他氨基酸取代任意氨基酸的方 法是众所周知的，并且为熟练技术人员的常规实验事项，例如通过定 位诱变的技术或者通过合成和组装编码氨基酸取代以及剪切至表达 载体构建体内的寡核苷酸。

抗体

各种实施方案可涉及结合HIV的一种或多种抗原或者表位的抗 体和/或抗体片段。在优选的实施方案，抗原或表位是暴露于诸如HIV 包膜蛋白的HIV-感染的细胞的表面上。可选地，抗原或表位可以为 展示在HIV-感染的细胞的表面上的一种。制备和使用各种基于抗体 的构建体和片段的技术是本领域众所周知的。制备和特征化抗体的方 法也是本领域众所周知的(参见，例如，Harlowe和Lane，1988， Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory)。使用 的抗体也可由大量已知来源中市售。例如，大量分泌抗体的杂交瘤系 获自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC， Manassas，VA)。

单克隆抗体

尽管优选的实施方案可涉及P4/D10抗体的使用，但可获得、制 备和/或使用其他抗-HIV抗体。已经报道针对HIV的各种抗体，并且 在某些实施方案中，可利用任何这些已知抗-HIV抗体。例如， 4E10(Rosa等人，Immunity 2：163-73，2005)；2F5(Bryson等人，Protein  and Peptide Letters；8：413-18，2001)；3D6(Ruker等人，Ann.NY Acad. Sci.646：212-19，1991)；C37(Cao等人，DNA and Cell Biology， 12：836-41，2004)；1ACY，1F58，1GGGC(Berry等人，Proteins， 45：281-82，2001)；2G12(Armbruster等人，J.Antimicrob.Chemother. 54：915-20，2004)，其各自以引用方式并入本文。在可选的实施方案中， 通过使用诸如在美国专利4,196,265中示例的那些的众所周知的技术 可容易地制备单克隆抗体。通常，该技术包括使用选择的免疫原组合 物来免疫合适的动物。优选诸如小鼠和大鼠的啮齿类的细胞。更优选 小鼠，最优选BALB/c小鼠，这是由于其最常使用，并且通常给予稳 定融合的更高百分比。

在免疫之后，选择可能产生抗体的体细胞，具体而言B-淋巴细 胞(B-细胞)用于MAb生成方案中。这些细胞可由活检的脾脏、扁桃 体或淋巴结或者由周围血液样品中获得。通常，使一组动物免疫，并 且取出具有最高抗体滴度的动物的脾脏，并通过注射器使脾脏均匀来 获得脾脏淋巴细胞。通常，来自经免疫的小鼠的脾脏含有约5x10⁷至2x10⁸个淋巴细胞。

然后使来自经免疫的动物的产生抗体的B-淋巴细胞与永生骨髓 瘤细胞的细胞(通常与经免疫的动物为相同种类之一)融合。适合在产 生杂交瘤的融合工序中使用的骨髓瘤细胞系优选为不产生抗体，具有 高融合效率，以及导致不能在仅支持所需融合的细胞(杂交瘤)生长的 某些选择性培养基中生长的酶缺陷。

如本领域技术人员所已知，可使用大量骨髓瘤细胞中任一种。例 如，在经免疫的动物为小鼠时，人们可使用P3-X63/Ag8、 P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、 MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul；对于大鼠，人们可使用 R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210；并且U-266、 GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6全部可用于与细胞融 合相关。

生成产生抗体的脾脏或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂交物的方 法通常包括在促进细胞膜的融合的一种或多种试剂(化学或电)的存 在下使体细胞与骨髓瘤细胞以2∶1比率混合，但可分别使用约20∶1 至约1∶1的比率。已描述使用仙台病毒(Sendai virus)以及使用诸如 37％(v/v)PEG的聚乙二醇(PEG)的那些的融合方法。电场诱导融合方 法的使用也是合适的。

融合工序通常在约1x10^-6至1x10^-8的低频率下产生活杂交物。 然而，这并未导致问题，因为通过在选择性培养基中培养，活的、融 合的杂交物由亲本、未融合的细胞(特别是通常继续不明确分化的未 融合骨髓瘤细胞)分化。选择性培养基通常为含有阻断在组织培养基 中核苷酸的从头合成的试剂的一种培养基。示例性试剂为氨基蝶呤、 氨甲蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤阻断嘌呤和嘧啶的从头 合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。在使用氨基蝶呤或氨甲蝶呤时， 使用次黄嘌呤和胸腺嘧啶来补充培养基作为核苷酸的来源(HAT培养 基)。在使用重氮丝氨酸处，使用次黄嘌呤来补充培养基。

优选的选择培养基是HAT。仅能够操作核苷酸补救途径的细胞 能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞缺乏补救途径的关键酶，例 如，次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPRT)，因而它们不能存活。B-细胞 可操作该途径，但它们在培养物中具有有限的生存期间，并且通常在 约两周死亡。因此，在选择性培养基中能存活的细胞仅有由骨髓瘤和 B-细胞形成的那些杂交物。

该培养提供杂交瘤的种群，由其选择特异性杂交瘤。通常，通过 在微量滴定板中通过单克隆稀释来培养细胞，随后测试用于所需反应 性的单独的克隆上清液(在约两至三周后)来进行杂交瘤的选择。测定 法应当敏感、简单和快速，例如放射免疫测定法、酶免疫测定法、细 胞毒性测定法、噬菌斑测定法、斑点免疫结合测定法等。

然后将选择的杂交瘤连续稀释以及克隆至单独的产生抗体的细 胞系内，然后该克隆物可被无限增殖以提供MAb。可以两基本途径 采用细胞系以用于MAb产生。可将杂交瘤的样品注射(通常至腹膜腔 内)至用于提供初始融合的体细胞和骨髓瘤细胞的类型的组织相容性 动物内。注射的动物长出分泌通过融合的细胞杂交物产生的特异性单 克隆抗体的肿瘤。然后可将诸如血清或腹水的动物体液抽出以提供高 浓度的MAb。也可将单独的细胞系体外培养，其中MAb被天然分泌 至培养基内，由此可容易地获得高浓度。如果需要，使用过滤、离心 和诸如HPLC或亲和层析的各种层析方法可将通过各种方式产生的 MAb进一步纯化。

抗体片段的产生

所要求保护的方法和/或组合物的一些实施方案可涉及抗体片 段。通过常规方法通过全部抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化可获得 这些抗体片段。例如，通过使用胃蛋白酶的抗体的酶裂解可产生抗体 片段以提供表示为F(ab′)₂的5S片段。使用硫醇还原剂以及任选地由 二硫键裂解所得的巯基的保护基团可进一步裂解该片段以产生3.5S Fab′单价片段。可选地，使用胃蛋白酶的酶裂解产生两个单价Fab片 段以及Fc片段。制备抗体片段的示例性方法公开于美国专利No. 4,036,945；美国专利No.4,331,647；Nisonoff等人，1960，Arch.Biochem. Biophys.，89：230；Porter，1959，Biochem.J.，73：119；Edelman等人， 1967，METHODS IN ENZYMOLOGY，422页(Academic Press)；以及 Coligan等人(编辑)，1991，CURRENT PROTOCOLS IN  IMMUNOLOGY，(John Wiley & Sons)。

也可使用诸如分离重链的裂解抗体的其他方法以形成单价轻-重 链片段、片段的进一步裂解或者其他酶、化学或遗传技术，只要片段 结合通过完整抗体识别的抗原。例如，Fv片段包含V_H和V_L链的缔 合。如Inbar等人，1972，Proc.Nat′1.Acad.Sci.USA，69：2659所述， 该缔合可以为非共价的。可选地，通过分子间二硫键可使可变链连接 或者通过诸如戊二醛的化学物质可使其交联。参见Sandhu，1992，Crit. Rev.Biotech.，12：437。

优选地，Fv片段包含通过肽接头连接的V_H和V_L链。通过构建 包含DNA序列的结构基因来制备这些单链抗原结合蛋白(sFv)，该 DNA序列编码通过寡核苷酸接头序列连接的V_H和V_L结构域。将结 构基因插入表达载体内，该表达载体随后被引入诸如大肠杆菌的宿主 细胞内。重组宿主细胞合成具有桥接两个V结构域的接头肽的单一 多肽链。制备sFv的方法是本领域众所周知的。参见Whitlow等人， 1991，Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：97；Bird等 人，1988，Science，242：423；美国专利No.4,946,778；Pack等人，1993， Bio/Technology，11：1271；以及Sandhu，1992，Crit.Rev.Biotech.， 12：437。

抗体片段的另一形式为单一结构域抗体(dAb)，其有时称作单链 抗体。制备单一结构域抗体的技术是本领域众所周知的(参见，例如， Cossins等人，Protein Expression and Purification，2007，51：253-59； Shuntao等人，Molec Immunol 2006，43：1912-19；Tanha等人，J.Biol. Chem.2001，276：24774-780)。通过标准免疫技术由诸如骆驼、羊驼或 美洲驼可获得单一结构域抗体。(参见，例如，Muyldermans等人， TIBS26：230-235，2001；Yau等人，J Immunol Methods 281：161-75， 2003；Maass等人，J Immunol Methods324：13-25，2007)。它们可具有 强效抗原结合能力，并且可与难以到达常规V_H-V_L对的新型表位相互 作用。((Muyldermans等人，2001)。羊驼血清IgG仅含有约50％骆驼 科重链IgG抗体(HCAb)(Maass等人，2007)。使用诸如TNF-α的已知 抗原可免疫羊驼，并且可将结合和中和靶抗原的单一结构域抗体分离 (Maass等人，2007)。已经识别几乎扩增所有羊驼抗体编码序列的PCR 引物，并且可将其用于构建单一结构域噬菌体展示文库，通过本领域 众所周知的标准生物淘选技术可将其用于抗体片段分离(Maass等人， 2007)。

在某些实施方案中，可改变抗体或者诸如抗体的Fc部分的抗体 片段的序列以最佳化它们生理特征，例如在血清中半衰期。在蛋白中 取代氨基酸序列的方法是本领域广泛已知的，例如通过定位诱变(例 如Sambrook等人，Molecular Cloning，A laboratory manual，第2版， 1989)。在优选的实施方案，改变可包括添加或去除在Fc序列中的一 种或多种糖基化位点(例如，美国专利No.6,254,868，其实施例部分 以引用方式并入本文)。在其他优选的实施方案中，可制备在Fc序列 中特异性氨基酸取代(例如，Hornick等人，2000，J Nucl Med 41：355-62；Hinton等人，2006，J Immunol 176：346-56；Petkova等人 2006，Int Immunol 18：1759-69；美国专利No.7,217,797)。

嵌合和人源化抗体

嵌合抗体是重组蛋白，其中诸如人抗体的可变区被诸如包括小鼠 抗体的互补性决定区(CDR)的小鼠抗体的可变区替代。当向受试者施 用时，嵌合抗体表现出降低的免疫原性和增加的稳定性。构建嵌合抗 体的方法是本领域众所周知的(例如，Leung等人，1994，Hybridoma 13：469)。

通过转染来自小鼠免疫球蛋白的重和轻可变链的小鼠CDR至人 抗体的对应可变结构域内可使嵌合的单克隆抗体人源化。也使用人 FR序列替代在嵌合的单克隆抗体中小鼠构架区(FR)。为了保存人源 化单克隆的稳定性和抗原特异性，通过小鼠对应物残基可替代一种或 多种人FR残基。人源化单克隆抗体可用于受试者的治疗性治疗。通 过CDR序列的选择的修饰也可增加靶的人源化抗体的亲合力 (WO0029584A1)。制备人源化单克隆抗体的技术是本领域众所周知 的。(参见，例如，Jones等人，1986，Nature，321：522；Riechmann等 人，Nature，1988，332：323；Verhoeyen等人，1988，Science，239：1534； Carter等人，1992，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，89：4285；Sandhu，Crit. Rev.Biotech.，1992，12：437；Tempest等人，1991，Biotechnology9：266； Singer等人，J.Immun.，1993，150：2844)。

其他实施方案可涉及非人灵长类抗体。在Goldenberg等人，WO 91/11465(1991)、以及在Losman等人，Int.J.Cancer46：310(1990) 中可找到在狒狒中用于产生治疗使用的抗体的一般技术。

人抗体

在另一实施方案中，抗体可以为人单克隆抗体。可由已经工程化 以产生应答抗原性攻击的特异性人抗体的转基因小鼠中获得这些抗 体。在该技术中，将人重和轻链基因座的元件引入源于胚胎干细胞系 的小鼠菌株，其含有内源性重链和轻链基因座的靶向破坏。转基因小 鼠可合成对人抗原特异的人抗体，并可将小鼠用于产生分泌人抗体的 杂交瘤。由转基因小鼠获取人抗体的方法由Green等人，Nature Genet. 7：13(1994)；Lonberg等人，Nature 368：856(1994)；以及Taylor等人， Int.Immun.6：579(1994)描述。

使用重组途径或者经人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物来 产生完整人抗体的方法是本领域已知的(例如，Mancini等人，2004， New Microbiol.27：315-28；Conrad和Scheller，2005，Comb.Chem.High  Throughput Screen.8：117-26；Brekke和Loset，2003，Curr.Opin. Phamacol.3：544-50，其各自以引用方式并入本文)。据预计，这些完 整人抗体表现出比嵌合或人源化抗体甚至更少的副作用，并且其体内 基本上用作内源性人抗体。在某些实施方案中，所要求保护的方法和 工序可利用通过这些技术制备的人抗体。

在一种选择中，噬菌体展示技术可用于生成人抗体(例如， Dantas-Barbosa等人，2005，Genet.Mol.Res.4：126-40，其以引用方式 并入本文)。由正常人或表现出诸如HIV感染或AIDS的特定疾病状 态的人中生成人抗体。由疾病个体构建人抗体的优势在于可使循环抗 体所有组成部分(repertoire)偏向针对疾病相关抗原的抗体。

在该方法的一个非限制性例子中，Dantas-Barbosa等人(2005)构 建来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。通常，全部 RNA由循环血液淋巴细胞获得(同前)。由μ和链抗体所有组成部分克 隆重组Fab，并将其插入噬菌体展示文库内(同前)。将RNA转变为 cDNA，并使用针对重和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物将其用于 制备Fab cDNA文库(Marks等人，1991，JMol.Biol.222：581-97，其以 引用方式并入本文)。根据Andris-Widhopf等人(2000，在：Phage  Display Laboratory Manual；Barbas等人(编辑)，第一版，Cold Spring  Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY pp.9.1至9.22，其以 引用方式并入本文)来进行文库构建。使用限制性核酸内切酶来消化 最终Fab片段，并将其插入噬菌体基因组以制备噬菌体展示文库。通 过诸如生物淘选的标准噬菌体展示方法可筛选这些文库。熟练技术人 员意识到，该技术仅为示例性的，并且可利用通过噬菌体展示来制备 和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。

在另一选择中，使用如上所讨论的标准免疫方案，可将经遗传工 程化以产生人抗体的转基因动物用于生成针对基本上任何免疫原性 靶的抗体。这些系统的非限制性例子为Abgenix(Fremont，CA)的 (例如，Green等人，1999，J.Immunol.Methods231： 11-23)。在和类似动物中，小鼠抗体基因失活，并被功 能性人抗体基因替代，而小鼠免疫系统的剩余部分仍然完整。

使用包含一部分人IgH和Igκ基因座(包括大部分可变区序列以 及附加基因和调节序列)的种系配置的YAC(酵母人工染色体)来转化 可将人可变区全部组成部分用于生成产生抗体的B细 胞，通过已知技术可将其处理至杂交瘤内。使用靶抗原免疫的 通过正常免疫应答产生人抗体，通过如上所讨论的标准 技术可将其收获和/或制备。可获得各种菌株，其分别 能够产生不同种类的抗体。通过化学交联或者其他已知方法可使这些 人抗体偶联其他分子。已经显示，转基因产生的人抗体具有治疗潜能， 同时保留正常人抗体的药物代谢动力学性质(Green等人，1999)。熟 练技术人员意识到，所要求保护的组合物和方法并不限于使用 系统，而是可利用经遗传工程化以产生人抗体的任何转 基因动物。

HIV中和抗体

在某些实施方案中，优选能够抑制HIV的感染性的中和抗体或 其片段。本领域已知各种HIV中和抗体，并可使用任意这些已知抗 体或其片段，包括但不限于P4/D10、2G12(例如，Joos等人，Antimicrob  Agents Chemother 2006，50：1773-79)、4E10(Joos等人，2006)、2F5(Joos 等人，2006)、b12(例如，Wu等人，J Virol 2006，80：2585)、X5(Moulard 等人，Proc Natl Acad Sci 2002，99：6913-18)或其任意组合。在使用多 特异性抗体或片段时，熟练技术人员意识到，可使结合相同或不同 HIV表位的多种抗体或片段联合。尽管优选针对HIV包膜蛋白(gp120) 和/或gp41的抗体，但熟练技术人员意识到，可利用其他HIV靶抗原 以开发靶向HIV-感染的细胞的抗体或其片段。在一些情况下，可利 用结合联合T-细胞抗原(例如，CD4、CCR5和/或CXCR4)的一种或 多种HIV抗原的抗体或片段。

融合蛋白

各种实施方案可涉及融合蛋白。这些分子通常具有所有或者大部 分在N-或C-末端处连接至所有或一部分第二多肽或蛋白的肽。例如， 融合可利用来自其他种类的前导序列以使可在异源性宿主中重组表 达蛋白。另一可使用融合包括附接诸如抗体或片段的免疫活性结构域 至诸如肽或蛋白毒素或酶的治疗剂。融合的又一可使用形式可包括附 接用于纯化诸如FLAG表位所使用的部分(Prickett等人，1989， Biotechniques 7：580-589；Castrucci等人，1992，J Virol66：4647-4653)。 生成融合蛋白的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，通过使用 功能性交联剂的化学附接；通过完整融合蛋白的从头合成；或者通过 使编码第一蛋白或肽的DNA序列附接编码第二蛋白或肽的DNA序 列，随后为表达完整融合蛋白可制备这些蛋白。

免疫缀合物

在各个实施方案中，可将DNL复合物的抗-HIV抗体、抗体片段 或其他靶向分子直接缀合至一种或多种治疗剂。示例性治疗剂可选自 细胞毒素剂、药物、毒素、放射性核素、酶、激素、细胞因子或其他 免疫调节剂。

使用的治疗剂可包括以下一种或多种：aplidin、阿扎立平 (azaribine)、阿那曲唑(anastrozole)、氮胞苷(azacytidine)、博来霉素 (bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、薯司他丁-1(bryostatin-1)、白消 安(busulfan)、刺孢霉素(calicheamycin)、喜树碱(camptothecin)、10- 羟基喜树碱、亚硝脲氮芥(carmustine)、西乐葆(celebrex)、苯丁酸氮芥 (chlorambucil)、页氯氨铂(cisplatin)、伊立替康(irinotecan)(CPT-11)、 SN-38、卡铂(carboplatin)、克拉屈滨(cladribine)、环磷酰胺 (cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、 更生霉素(dactinomycin)、道诺霉素葡糖苷酸(daunomycin  glucuronide)、道诺红菌素(daunorubicin)、阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素 (2-pyrrolinodoxorubicine)(2P-DOX)、氰基-吗啉代阿霉素 (cyano-morpholino doxorubicin)、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸 (epirubicin glucuronide)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷(etoposide)、 依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、氟尿苷(floxuridine)(FUdR)、 3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨(fludarabine)、氟他胺 (flutamide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、吉 西他滨(gemcitabine)、羟基脲、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺 (ifosfamide)、L-天冬酰胺酶、甲酰四氢叶酸、洛莫司汀(lomustine)、 氮芥、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、氨甲蝶呤、 米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素 (mitomycin)、米托坦(mitotane)、丁酸苯酯、丙卡巴肼(procarbazine)、 喷司他丁(pentostatin)、PSI-341、司莫司汀(semustine)、链佐星 (streptozocin)、紫杉烷类、硫鸟嘌呤(thioguanine)、硫涕巴(thiotepa)、 替尼泊苷(teniposide)、托泊替康(topotecan)、乌拉莫司汀(uracil  mustard)、velcade、长春花碱、长春瑞滨(vinorelbine)、长春新碱、蓖 麻毒、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、豹蛙酶、rapLRl、DNA酶I、葡 萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单 胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、反义寡核苷酸、干扰RNA或其组合。

通过诸如至在它们侧链中含有胺、羧基、硫醇或羟基的氨基酸残 基的共价附接可缀合。各种常规接头可用于该目的，例如，二异氰酸 酯、二异硫氰酸酯、双(羟基琥珀酰亚胺)酯、碳二亚胺、马来酰亚胺 -羟基琥珀酰亚胺酯、戊二醛等。试剂与HIV靶向分子的缀合优选与 未经修饰的结构相比未显著影响结合活性或特异性。此外，可使细胞 毒性和/或病毒抑制剂首先与聚合载体偶联，然后使其与HIV靶向分 子缀合。对于该方法，参见Ryser等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 75：3867-3870，1978，U.S.4,699,784和U.S.4,046,722，其以引用方式 并入本文。

通过用于连接抗体与脂质、糖类、蛋白、放射性核素或其他原子 和分子的已知方法可制备本文所述的缀合物。例如，可使本文所述的 HIV靶向分子连接一种或多种本文所述的载体(例如，脂质、聚合物、 脂质体、胶束或纳米粒子)以形成缀合物，然后可将其共价、非共价 或者另外并入治疗或诊断剂。可选地，可使本文所述的任何HIV靶 向分子与本文所述的一种或多种治疗或诊断剂直接缀合。

例如，可使用¹³¹I放射性标记HIV靶向分子，并使其与脂质缀合， 使得所得缀合物可形成脂质体。脂质体可并入一种或多种治疗(例如， 诸如FUdR-dO的药物)或诊断剂。脂质体和胶束的形成在本领域为已 知的。参见，例如，Wrobel和Collins，Biochimica et Biophysica Acta (1995)，1235：296-304；Lundberg等人，J.Pharm.Pharmacol.(1999)，51： 1099-1105；Lundberg等人，Int.J.Pharm.(2000)，205：101-108； Lundberg，J.Pharm.Sci.(1994)，83：72-75；Xu等人，Molec.Cancer Ther. (2002)，1：337-346；Torchilin等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，U.S.A.(2003)， 100：6039-6044；U.S.5,565,215；U.S.6,379,698；以及U.S. 2003/0082154。

也已经描述由聚合物、二氧化硅或金属形成的纳米粒子或纳米 囊，其可用于药物递送或显像。参见，例如，West等人，Applications  of Nanotechnology to Biotechnology(2000)，11：215-217；U.S. 5,620,708；U.S.5,702,727；以及U.S.6,530,944。已经描述用于形成 治疗或诊断剂的靶向载体的抗体或结合分子与脂质体的缀合。参见， 例如，Bendas，Biodrugs(2001)，15：215-224；Xu等人，Mol.Cancer Ther (2002)，1：337-346；Torchilin等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A(2003)， 100：6039-6044；Bally，等人，J.Liposome Res.(1998)，8：299-335； Lundberg，Int.J.Pharm.(1994)，109：73-81；Lundberg，J.Pharm. Pharmacol.(1997)，49：16-21；Lundberg，Anti-cancer Drug Design(1998)， 13：453-461。也参见1999年6月9日提交的U.S.6,306,393、U.S.序 列No.10/350,096、U.S.序列No.09/590,284和U.S.序列No. 60/138,284。所有这些参考文献均以引用方式并入本文。

可将多种诊断和治疗剂有利地用于形成HIV靶向分子的缀合物， 或者可使它们与结合在HIV靶向分子上识别位置的半抗原连接。诊 断剂可包括放射性同位素、在MRI中使用的增强剂或者用于超声成 像的造影剂，以及荧光化合物。如它们与蛋白或肽的附接方法，许多 合适的显影剂是本领域已知的(参见，例如，美国专利5,021,236和 4,472,509，其均以引用方式并入本文)。某些附接方法包括使用金属 螯合络合物(采用例如，诸如DTPA的有机螯合剂)附接蛋白或肽(美国 专利4,472,509)。

为了使HIV靶向分子荷载放射性金属或顺磁离子，可能必须首 先使它与载体反应，用于结合放射性金属或顺磁离子的螯合基团的多 个拷贝已经与该载体附接。这些载体可以为聚赖氨酸、多糖或者具有 可结合螯合基团的衍生的或可衍生的聚合材料，例如，已知用于该目 的乙二胺四醋酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、 冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟(polyoxime)等。使用以最小化聚集和免疫 反应性损耗的方式的标准化学方法使含有螯合物的载体与HIV靶向 分子偶联。

可应用制备这些缀合物的其他、较不常见方法和试剂公开在U.S. 4,824,659中，其以引用方式整体并入本文。特别有用的金属螯合物 组合包括以60至4,000keV的一般能量范围的与诊断性同位素使用 的2-苄基-DTPA和它的一甲基和环己基类似物。一些可使用的诊断 性核素可包括：¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、 ⁹⁴Tc、^94mTc、^99mTc或¹¹¹In。当连同本文所述HIV靶向分子和载体使 用时，与诸如锰、铁和钆的非放射性金属络合的相同螯合物可用于 MRI。将诸如NOTA、DOTA和TETA的大环的螯合物与各种金属和 放射线金属使用，最特别地分别使用镓、钇和铜的放射性核素。通过 使环尺寸适合目标金属可非常稳定地制备这些金属螯合复合物。可使 用诸如用于络合²²³Ra的大环聚醚的其他环类型的螯合物。

治疗剂包括诸如化疗药，例如长春花生物碱、蒽环霉素 (anthracycline)、表鬼臼毒素、紫杉烷类、抗代谢物、烷化剂、抗生素、 Cox-2抑制剂、抗有丝分裂物质、抗血管生成剂和促凋亡剂，特别是 阿霉素、氨甲蝶呤、紫杉酚(taxol)、CPT-11、camptothecan以及来自 这些和其他种类的细胞毒素剂的其他物质。其他细胞毒素剂包括氮芥 类、烷基磺酸盐、亚硝基脲类、三氮烯类、叶酸类似物、嘧啶类似物、 嘌呤类似物、铂配位络合物等。合适的细胞毒素剂描述在 REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(Mack  Publishing Co.1995)，以及在GOODMAN AND GILMAN′S THE  PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，第7版 (MacMillan Publishing Co.1985)，以及这些出版物的修订版中。诸如 实验药物的其他合适的细胞毒素剂是本领域技术人员已知的，并且使 用本领域已知的方法可使其与本文所述的HIV靶向分子缀合。

另一类治疗剂由发射α-粒子(例如²¹²Pb、²¹²Bi、²¹³Bi、²¹¹At、²²³Ra、 ²²⁵Ac)、β-粒子(例如³²P、³³P、⁴⁷Sc、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、¹¹¹Ag、 ¹²⁵I、¹³¹I、¹⁴²Pr、¹⁵³Sm、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁶Dy、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、 ¹⁸⁹Re)或者俄歇电子(Auger electron)(例如¹¹¹In、¹²⁵I、⁶⁷Ga、¹⁹¹Os、^193mPt、 ^195mPt、^195mHg)的放射性核素组成。使用如上所述用于诊断剂的方法 可使用一种或多种以上放射性核素来标记HIV靶向分子。

在某些实施方案中，使用的治疗剂可包含一种或多种聚集体抑制 剂。聚集体是大的细胞内复合物，据认为，其由应答错折叠蛋白而形 成(参见，例如，Heath等人，J.Cell Biol.153：449-55，2001；Johnstone 等人，J.Cell Biol.143：1883-98，1998；Wileman，Science312：875-78， 2006)。最近，据表明，聚集体可在病毒颗粒的组装中起着作用(Heath 等人，2001；Wileman，2006)。聚集体抑制剂因而可用于阻断或抑制 新的感染性病毒颗粒由经HIV或其他病毒感染的细胞中形成。各种 聚集体抑制剂为已知的，例如ALLN、诺考达唑(nocodazole)、秋水仙 碱(colchicine)和长春花碱(Johnston等人，1998)、其他微管抑制剂 (Gerdes和Katsanis，Hum.Molec.Genet.14：R291-300，2005)、硼替佐米 ()(Catley等人，Blood108：3441-49，2006)、tubacin、组蛋 白脱乙酰基酶抑制剂(Corcoran等人，Curr.Biol.14：488-92，2004)，并 且可使用任何这些已知聚集体抑制剂。

在各个实施方案中，可使一种或多种免疫调节剂与抗-HIV抗体 或片段缀合。可选地，如下所述，可使免疫调节剂附接AD或DDD 部分以用于并入DNL复合物内。如本文所使用，术语“免疫调节剂” 包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴细胞毒素和诸如白介素的血细 胞生成因子、集落刺激因子、干扰素(例如，干扰素-α、-β和-γ)以及 称为“S1因子”的干细胞生长因子。合适的免疫调节剂部分的例子 包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素-γ、TNF-α等。

术语“细胞因子”是通过一种细胞群体释放的蛋白或肽的通用术 语，其作为细胞内介体作用于另一细胞。如本文所广泛使用，细胞因 子的例子包括淋巴因子、单核因子、生长因子和传统多肽激素。生长 激素涵盖在细胞因子内，例如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素 和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛 素；弛激素原(prorelaxin)；糖蛋白激素，例如促滤泡激素(FSH)、促 甲状腺激素(TSH)和促黄体生成激素(LH)；肝脏生长因子；前列腺素； 成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳素；OB蛋白；肿瘤坏死因 子-α和-β；缪勒氏管抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促 性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白 (integrin)；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，例如NGF-β；血小 板生长因子；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样 生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素例如 干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)； 粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)， 例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、 IL-10、IL-11、IL-12；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、 IL-21、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、kit-配体或FLT-3、 血管增生抑制素(angiostatin)、血小板反应蛋白、内皮他丁(endostatin)、 肿瘤坏死因子和LT。如本文所使用，术语细胞因子包括来自天然来 源或者来自重组细胞培养物的蛋白以及天然序列细胞因子的生物活 性等同物。

趋化因子通常用作化学引诱物以募集免疫效应细胞至趋化因子 表达的位点。可以有利地联合诸如细胞因子基因表达特定趋化因子基 因，从而增强其他免疫系统组分至治疗位点的募集。趋化因子包括但 不限于RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。熟练技术人员 意识到，某些细胞因子也已知具有化学引诱物作用，并且也可归类于 术语趋化因子下。类似地，术语免疫调节剂和细胞因子在它们各自成 员上重叠。

含有可检测标记(例如，荧光分子)或者抑制病毒和/或细胞毒素剂 (例如，放射性碘)的合适的肽可以共价、非共价或者另外与HIV靶向 分子缔合。例如，通过合并光活性试剂或染料至HIV靶向分子上可 获得治疗可使用的缀合物。通过导向合适的光线至病变，对可见光敏 感的诸如荧光染料的荧光组合物和其他色原或者诸如卟啉的染料用 于检测和治疗病变。在治疗中，这称为光辐射、光线疗法或光动力学 治疗。参见Jori等人(编辑)，PHOTODYNAMIC THERAPY OF  TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto1985)；van den  Bergh，Chem.Britain(1986)，22：430。而且，使单克隆抗体与光活化染 料偶联以完成光线疗法。参见Mew等人，J.Immunol.(1983)，130： 1473；同前，Cancer Res.(1985)，45：4380；Oseroff等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(1986)，83：8744；同前，Photochem.Photobiol.(1987)，46：83； Hasan等人，Prog.Clin.Biol.Res.(1989)，288：471；Tatsuta等人，Lasers  Surg.Med.(1989)，9：422；Pelegrin等人，Cancer(1991)，67：2529。

HIV融合抑制剂

HIV融合抑制剂描述在PCT专利申请公开No.WO2007045463 中，其全部文本以引用方式并入本文。通常，通过人免疫缺陷病毒(HIV) 对细胞的感染受到细胞膜被感染和病毒膜融合的过程影响。病毒包膜 糖蛋白复合物(gp120/gp41)与位于待感染的细胞膜上的细胞表面受体 相互作用。gp120与联合诸如CCR-5或CXCR-4的共受体(co-receptor) 的诸如CD4受体的结合导致gp120/gp41复合物的构象改变。由于该 构象改变，gp41蛋白能够插入靶细胞膜内。该插入是膜融合过程的 开始。

由于天然存在的多态性，已知在不同HIV菌株之间gp41蛋白的 氨基酸序列不同。但相同结构域构造可被识别，融合信号、两个七价 重复结构域(HR1、HR2)和跨膜结构域。融合(或基因融合(fusogenic)) 结构域参与细胞膜的插入和崩解。由gp41的HR1或HR2结构域推 断的具有氨基酸序列的肽是摄取HIV至细胞内的有效体外和体内抑 制剂(参见，例如美国专利No.5,464,933、5,656,480、6,258,782、 6,348,568、6,656,906)。例如，T20、HR2肽和T651(美国专利No. 6,479,055)是强效HIV感染的抑制剂。通过例如氨基酸取代或化学交 联尝试增强由HR2衍生的肽的功效(Sia等人，2002，PNAS USA 99：14664-14669；Otaka等人，2002，Angew.Chem.Int.41：2937-2940)。

在美国专利No.5,464,933、5,656,480、6,013,263、6,017,536、 6,020,459、6,093,794、6,060,065、6,258,782、6,348,568、6,479,055、 6,656,906；和PCT专利申请公开No.WO1996/19495、WO1996/40191、 WO1999/59615、WO2000/69902和WO2005/067960中找到示例性 抗-基因融合肽，其实施例部分各自以引用方式并入本文。熟练技术 人员意识到，利用以下实施例所述的技术，可将任何这些HIV融合 抑制剂并入主题DNL复合物内。

干扰RNA

在某些实施方案中，可利用DNL复合物以递送siRNA或干扰 RNA种类。可使siRNA、干扰RNA或治疗基因附接并入DNL构建 体内的载体部分。已经报道siRNA的各种载体部分，并可使用任何 已知载体。载体的非限制性例子包括鱼精蛋白(Rossi，2005，Nat  Biotech23：682-84；Song等人，2005，Nat Biotech23：709-17)；树状高 分子，例如PAMAM树状高分子(Pan等人，2007，Cancer Res. 67：8156-8163)；聚氮丙啶(Schiffelers等人，2004，Nucl Acids Res 32：e149)；聚丙烯亚胺(Taratula等人，2009，J Control Release 140：284-93)；聚赖氨酸(Inoue等人，2008，J Control Release126：59-66)； 含有组氨酸可还原聚阳离子(Stevenson等人，2008，J Control Release 130：46-56)；组蛋白H1蛋白(Haberland等人，2009，Mol Biol Rep26： 1083-93)；阳离子梳型共聚物(Sato等人，2007，J Control Release 122：209-16)；聚合物胶束(美国专利申请公开No.20100121043)；以及 壳聚糖-硫胺素焦磷酸酯(Rojanarata等人，2008，Pharm Res 25：2807-14)。熟练技术人员意识到，通常，聚阳离子蛋白或聚合物用 作siRNA载体。熟练技术人员进一步意识到，siRNA载体也可用于 携带其他寡核苷酸或核酸种类，例如反义寡核苷酸或短DNA基因。

许多siRNA种类由已知来源市售，例如Sigma-Aldrich(St Louis， MO)、Invitrogen(Carlsbad，CA)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz， CA)、Ambion(Austin，TX)、Dharmacon(Thermo Scientific，Lafayette， CO)、Promega(Madison，WI)、Mirus Bio(Madison，WI)和 Qiagen(Valencia，CA)以及许多其他来源。siRNA种类的其他公开可获 得来源包括在斯德哥尔摩生物信息中心(Stockholm Bioinformatics  Centre)的siRNAdb数据库、MIT/ICBP siRNA数据库、Broad研究所 的RNAi Consortium shRNA文库以及NCBI的探针数据库。例如，在 NCBI Probe数据库中有30,852种siRNA种类。熟练技术人员意识到， 对于任何目标基因，已经设计siRNA种类，或者人们可容易地使用 公开市售软件工具设计。已经报道其他已知siRNA种类，例如， IKK-γ(美国专利7,022,828)；VEGF、Fit-1和Flk-1/KDR(美国专利 7,148,342)；Bcl2和EGFR(美国专利7,541,453)；CDC20(美国专利 7,550,572)；转导素(β)-样3(美国专利7,576,196)；KRAS(美国专利 7,576,197)；碳酸酐酶II(美国专利7,579,457)；补体组分3(美国专利 7,582,746)；白介素-1受体-相关激酶4(IRAK4)(美国专利7,592,443)； 存活素(美国专利7,608,7070)；超氧化物歧化酶1(美国专利 7,632,938)；MET原癌基因(proto-oncogene)(美国专利7,632,939)； IGF-1R(美国专利7,638,621)；ICAM1(美国专利7,642,349)；补体因子 B(美国专利7,696,344)；p53(7,781,575)；以及载脂蛋白B(7,795,421)。 使用主题DNL复合物可递送这些已知siRNA种类。

包含豹蛙酶(Rap)的免疫毒素

核糖核酸酶，尤其是Rap(Lee，Exp Opin Biol Ther2008；8：813-27) 和它的偏碱性变体、amphinase(Ardelt等人，Curr Pharm Biotechnol 2008：9：215-25)是强效细胞毒素剂(Lee和Raines，Biodrugs2008； 22：53-8)。Rap是开始由美洲豹蛙(Rana pipiens)的卵母细胞分离的104 个氨基酸的单链核糖核酸酶。Rap表现出对各种细胞系体外抑制细胞 和细胞毒性作用，以及体内抗肿瘤活性。两栖动物核糖核酸酶通过受 体介导的胞吞进入细胞，并且一旦内化至细胞溶质内，则选择性降解 tRNA，导致对蛋白合成的抑制和诱导细胞凋亡。在没有不恰当免疫 应答下可将Rap向患者重复施用，其可逆肾毒性报道为剂量限制性 (Mikulski等人，J Clin Oncol2002；20：274-81；Int J Oncol1993； 3：57-64)。

如首先由LL2-豹蛙酶(Newton等人，Blood2001；97：528-35)，包 含Rap和鼠抗-CD22单克隆抗体(MAb)的化学缀合物，以及随后由 2L-Rap-hLL1-γ4P，包含Rap和人源化抗-CD74MAb的融合蛋白(Stein 等人，Blood2004；104：3705-11)所证实，Rap与靶向抗体或抗体片段 的缀合或融合是有前景的增强其效能的途径。

用于生成2L-Rap-hLL1-γ4P的方法使得我们可开发通常称为 2L-Rap-X的一系列结构类似的免疫毒素，其全部由两个Rap分子组 成，各自通过挠性接头连接至目标抗体(X)的一条L链的N-末端。通 过使用称为Rap(Q)的Rap的非糖基化形式来替代Rap，我们也已经 生成另一系列的称为2LRap(Q)-X的相同设计的免疫毒素，该Rap(Q) 表示在Asn69处可能糖基化位点改变为Gin(或者Q，单字母代码)。 对于两个系列，我们制备IgG作为IgG1(γ1)或IgG4(γ4)，并且为了预 防IgG4半分子的形成(Aalberse和Schuurman，Immunology 2002；105：9-19)，我们转化在IgG4的铰链区(S228)中丝氨酸残基为脯 氨酸(γ4P)。在Rap的N-末端处焦谷氨酸残基需要RNA酶为完全功 能性(Liao等人，Nucleic Acids Res2003；31：5247-55)。

熟练技术人员意识到，适合在本发明中使用的细胞毒性RNA酶 部分包括具有天然豹蛙酶结构的多肽及其所有酶活性变体。这些分子 有利地具有N-末端焦谷氨酸残基，其对于RNA酶活性为必要的并且 基本上不会被哺乳动物RNA酶抑制剂所抑制。通过克隆和限制合适 的序列或者使用聚合酶链反应(PCR)的DNA扩增可制备编码天然细 胞毒性RNA酶的核酸。由Ardelt等人，J.Biol.Chem.，256：245(1991) 中可获得美洲豹蛙酶的氨基酸序列，并且通过类似于在hLL2人源化 中使用的整体V-基因组装方法可基因合成编码天然豹蛙酶的cDNA 序列或其保守修饰的变化形式。(Leung等人，Mol.Immunol.，32：1413， 1995)。制备细胞毒性RNA酶变体的方法是本领域已知的，并在操作 者的技术范围内。

如以下实施例中所述，使用DNL技术可制备靶向抗体的Rap缀 合物。DNL Rap-抗体构建体显示强效细胞毒性活性，可使其靶向疾 病相关的细胞。

配制和施用

可将DNL构建体进一步配制以获得包括一种或多种药学上合适 的赋形剂、一种或多种另外的成分或这些的一些组合的组合物。通过 已知方法可将这些完成以制备药学上可使用的剂量，由此将活性成分 组合在具有一种或多种药学上合适的赋形剂的混合物中。无菌磷酸盐 缓冲盐水是药学上合适的赋形剂的一个例子。其他合适的赋形剂是本 领域技术人员众所周知的。参见，例如，Ansel等人， PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY  SYSTEMS，第5版(Lea&Febiger1990)，以及Gennaro(编辑)， REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，(Mack  Publishing Company1990)，及其修订版。

施用本文所述组合物的一种途径为胃肠外注射。在胃肠外施用 中，将组合物配制在与药学上可接受赋形剂缔合的单位剂量可注射形 式中，例如溶液、混悬物或乳剂。这些赋形剂固有无毒以及无治疗作 用。这些赋形剂的例子为盐水、林格氏溶液、葡聚糖溶液和汉克斯溶 液(Hank′s solution)。也可使用诸如固定油和油酸乙酯的非水性赋形 剂。优选的赋形剂是在盐水中5％葡聚糖。赋形剂可含有微量的添加 剂，例如增强等张性和化学稳定性的物质，包括缓冲剂和防腐剂。也 涵盖包括口服施用的其他施用方法。

通过诸如快速推注注射或连续输液可将包含DNL复合物的配制 的组合物用于静脉内施用。用于注射的组合物可以单位剂型呈现，例 如在安瓿或多次给药容器中，其具有添加的防腐剂。组合物也可采用 在油性或水性媒介物中混悬物、溶液或乳剂的形式，并可含有诸如混 悬、稳定和/或分散剂的配制试剂。可选地，在使用之前，组合物可 以在与诸如无菌无热原水的合适媒介物配制的粉末形式中。

可以溶液形式施用组合物。溶液的pH应当为pH5至9.5，优选 pH6.5至7.5。其配制物应当在具有诸如磷酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷 -HCl或醋酸盐等的合适药学上可接受的缓冲剂的溶液中。缓冲剂浓 度应当在1至100mM的范围内。配制的溶液也可含有50至150mM 的浓度的诸如氯化钠或氯化钾的盐。也可包括诸如甘油、白蛋白、球 蛋白、去污剂、明胶、鱼精蛋白或者鱼精蛋白的盐的有效量的稳定剂。 如果使用抗-HIV抗体的人源化形式，则通常每两至三天或者每周一 次进行配制的组合物的系统施用。常见施用为肌肉注射或者静脉内输 液。

可皮下或通过其他胃肠外途径来施用组合物。而且，通过连续输 液或者通过单次或多次快速推注可施用。可将用于抗体或免疫缀合物 的方法应用于本文所述的组合物。通常，人施用免疫缀合物、融合蛋 白或裸抗体的剂量取决于多种因素，例如患者的年龄、体重、高度、 性别、一般健康条件以及既往病史。通常，尽管如果条件要求也可施 用更低或更高剂量，但提供接受者活性成分的理想剂量为约1mg/kg 至20mg/kg的范围作为单一静脉内输液量。如果需要，可重复该剂 量，例如，4-10周内每周一次，优选8周内每周一次，并且更优选为 4周内每周一次。也可以更低频率给药，例如数月内每隔一周一次。 只要适当调节剂量和时间表，可通过各种胃肠外途径来给予剂量。

用于控制免疫缀合物或抗体的持续作用时间的药物方法可应用 于本文所述的配制的组合物。通过使用诸如聚(乙烯-共-醋酸乙烯酯) 的基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酐共聚物的基质的用于复合或 吸收免疫缀合物或裸抗体的生物相容性聚合物可得到控制释放制剂。 参见Sherwood等人，Bio/Technology(1992)，10：1446。从这些基质的 释放速率取决于DNL复合物的分子量、在基质内DNL复合物的量以 及分散颗粒的尺寸。参见Saltzman等人，Biophys.J(1989)，55：163； Sherwood等人，见上。其他固体剂型描述在Ansel等人， PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY  SYSTEMS，第5版(Lea&Febiger1990)，和Gennaro(编辑)， REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack  Publishing Company1990)，及其修订版。

连接放射性核素的DNL复合物可有效地治疗。在已经测定出 DNL复合物位于受试者中一个或多个感染位置处之后，注射更高剂 量的标记的组合物，通常为¹³¹I的每次给药的20mCi至150mCi；⁹⁰Y 的每次给药的5mCi至30mCi；或者¹⁸⁶Re的每次给药的5mCi至20 mCi，其各自基于70kg患者体重。可静脉内、动脉内、淋巴管内、 鞘内或腔内(即，胃肠外)注射，并且可重复进行。对于一些疗法，可 有利地多次、分开剂量施用，这因而提供较高的毒性剂量，而通常不 会导致对正常组织的辐射成比例增加。

试剂盒

一些实施方案可涉及实施所要求保护的方法的试剂盒。试剂盒可 包括DNL构建体。可将试剂盒组件包装在含有适合重构的组合物的 无菌、冻干配制物的诸如小瓶的容器内。试剂盒也可含有适合于重构 和/或稀释其他试剂的一种或多种缓冲剂。可使用的其他容器包括但 不限于：小袋、盘子、盒子、管子等。可将试剂盒组件无菌包装和保 存在容器内。可包括的另外的组件是针对使用试剂盒人员的说明书。

实施例

涵盖以下例子以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应 当理解，在随后实施例中公开的技术代表在本发明的实施中发现运用 良好的技术，因而可认为其构成它实施的优选方式。然而，鉴于本公 开，本领域技术人员理解，在未违背本发明的精神和范围下，可对所 公开的具体实施方案进行许多改变，并仍获得同样或类似结果。

实施例1.使用缀合的抗-HIV抗体对HIV体外和体内感染的抑 制

概述

使针对HIV的包膜抗原的鼠单克隆抗体(MAb)(P4/D10)与常见抗 癌药物、阿霉素缀合，并体外和体内针对感染性病毒和受感染的细胞 测试。使用游离病毒(中和)或HIV-感染的细胞(抑制)来孵育P4/D10 抗体，并通过p24捕获酶联免疫吸附测定法来测定所得感染。在 HIV-1/MuLV小鼠攻击模型中，测定缀合物抑制体内感染的能力。

阿霉素-缀合的P4/D10中和HIV-1_IIIB以及消除在体外受感染的 Jurkat细胞中细胞内散布和HIV复制。它也以比游离抗体所需低八倍 的浓度保护小鼠免受HIV-1_IIIB/MuLV攻击，而游离药物或无关缀合 物对照未观察到作用。这些结果表明：通过P4/D10抗体使阿霉素集 中至HIV-感染的细胞，显著(p＝0.0001)有助于HIV消除。

在该研究中，我们使阿霉素、具有已知药理、毒理和在患者中抗 肿瘤活性的抗癌蒽环霉素与针对HIV-1外包膜gp120(第三可变环区) 开发的中和和ADCC介导单克隆抗体(MAb)缀合。

体外测试与阿霉素缀合的P4/D10抗体通过去除来自腹膜内腔的 受同系基因细胞感染的HIV-1/MuLV(鼠白血病病毒)来消除在非受感 染的细胞之间和在小鼠模型中HIV-1-受感染的细胞的功效。抗-gp120 抗体、P4/D10中和HIV-1病毒以及介导ADCC(Broliden等人，1990)。 也已经将它的未缀合的形式用于晚期HIV-1感染个体的I-期临床研究 中，其中它降低HIV抗原的时间段延长(Hinkula等人，1994)。本研 究首次检查与游离MAb、游离药物和与阿霉素类似缀合的无关抗体 hRS7相比在临床前HIV模型中药物缀合形式的P4/D10的组合(Stein 等人，Int J Cancer1993，55：938-946)和hLL1Griffiths等人，Clin  Cancer Res2003，9：6567-6571；Sapra等人，Clin Cancer Res2005， 11：5257-5264)。

材料和方法

抗体和药物缀合。根据Griffiths等人(2003)进行阿霉素与IgG1κ 抗-gp120抗体P4/D10(Broliden等人，1990)和对照抗体的缀合以及具 有马来酰亚胺基团的双功能性阿霉素腙衍生物的制备。简言之，使用 约2.2mM最终DTT浓度，对应相对抗体的38倍摩尔过量的还原剂， 经在含有5mM EDTA的PBS(pH7.5)中DTT(二硫苏糖醇)使约9 mg/ml的最终浓度的抗体P4/D10、hLL1(人源化抗-CD74)和hRS7(人 源化抗-EGP-1)轻度还原。在37℃下将溶液孵育40分钟。将还原的 MAb在含有150mM NaCl和2mM EDTA的50mM醋酸钠缓冲剂 (pH5.3)中G50/80的离心柱(spin-column)上纯化。通过 埃尔曼测定法(Ellman′s assay)来测定在抗体上生成的硫醇基团的数 量。对于缀合，使在6.5mg/ml下轻度还原的抗体与双功能性阿霉素 混合。将孵育物保存在冰上15分钟，然后在0.1M醋酸钠(pH6.5)中 G50/80的离心柱上纯化，随后通过在相同缓冲剂中平衡的Bio-Beads SM2(Bio-Rad，Hercules，CA)的短柱。通过测定吸收率来分析产物的阿 霉素/MAb取代比率。

将来自HIV感染患者的产生GMP的大量IgG(HIVIgG)(Guay等 人AIDS2002，16：1391-1400)用作阳性对照，并将来自HIV阴性个体 的血清用作阴性对照。包括游离阿霉素以及与阿霉素类似缀合的抗癌 人源化MAb LL1和RS7作为缀合的P4/D10抗体的对照。

HIV-1中和测定法。将阿霉素P4/D10、未经标记的P4/D10、HIV 免疫球蛋白(HIVIgG)和HIV-阴性血清与HIV-1分离HIV-1_IIIB(LAI)混 合，并且在将50,000Jurkat T-细胞/孔加入之前在37℃下孵育1小时。 在孵育1小时之后，使用培养基洗涤细胞，并将新的完全培养基加入 (200μl/孔)。在培养7天之后，通过p24捕获ELISA(酶联免疫吸附测 定法)来测定产生的p24的量，并计算对HIV-1p24的产生的抑制百 分比。

HIV-1体外抑制。通过混合5-10x10⁶细胞与100x TCID₅₀HIV-1_IIIB以及在37℃下孵育1小时，使用HIV-1_IIIB来感染Jurkat T细 胞。将细胞在培养基中洗涤，并在37℃下孵育。每隔三天，更换培 养基，并检查上清液中p24产生。当接近100％的细胞被感染时，将 不同比例的HIV-1_IIIB感染的细胞与未感染的细胞混合。使用抗体、血 清或100至0.00001μg/ml的游离阿霉素的系列稀释物来处理细胞。 在37℃下培养7天之后，测定HIV-1p24抑制以及收集来自之前使用 0.1-10μg/ml的阿霉素-P4/D10、未缀合的P4/D10以及0.05-0.5mg/ml HIV-阴性血清处理的细胞的上清液，并将其转染至新鲜JurKat T-细胞 以测试感染性HIV在开始培养后3、7、10、12和15天是否通过p24 ELISA识别。

HIV-1/MuLV攻击模型。使用HIV-1_IIIB感染具有遗传整合的 MuLV基因组的人T-细胞系，CEM-1B，其导致具有HIV-1基因组和 MuLV包膜的假病毒的产生(Adang等人，PNAS USA1999， 96：12749-753；Hinkula等人，Cells Tissues Organs2004，177：169-184)。 将这些病毒上清液用于感染来自HLA-A201的C57B1/6xDBA Fl K^b/d小鼠转基因的脾细胞。使用HIV-1_IIIB/MuLV感染的脾细胞腹膜内攻 击等基因小鼠，并立即腹膜内给予缀合的抗体、游离抗体或游离阿霉 素。在攻击之后十天，处死小鼠，并收集腹膜腔细胞。沉淀腹膜腔细 胞，并加至在24-孔板中生长的1x10⁶HIV易受感染的Jurkat T-细胞 或人PBMC。由这些继代培养物，每3-4天将上清液去除，并加入新 鲜培养基。通过p24ELISA测定3周内从上清液中回收的感染性HIV 的量。

统过分析。为了比较抗-gp120MAb和对照抗体的体外HIV-1中 和能力，使用学生t检验和非参数克鲁斯卡尔-瓦里斯检验 (non-parametric Kruskal-wallis test)。使用非参数曼-惠特尼 U(Mann-Whitney U)和克鲁斯卡尔-瓦里斯检验来进行使用不同抗体 处理的各组小鼠之间统计比较。当获得的p值＜0.05时，则认为该差 异具显著性。使用版本4.0a(Software，San  Diego，CA)来进行非参数单因素方差分析(one-way ANOVA test)，并 将其用于比较各研究组之间HIV-1分离和p24抗原阳性的比较。

结果

在最终纯化的缀合物中通过轻度还原在各抗体上生成的硫醇基 团的数目以及阿霉素/MAb取代比率的范围介于8.8(P4/D10，hRS7)至 9.4(hLL1)之间，其得到约9的药物分子/IgG比率。高压液相色谱分 析显示：缀合物和天然MAb具有零至最小聚集(数据未显示)的类似 保留时间。

可在阿霉素-缀合的P4/D10MAb以及未缀合的P4/D10MAb或 HIVIgG抗体之间显示在游离HIV-1病毒(图1A)的HIV-1中和能力中 无显著差异。然而，在中和HIV-1_IIIB上，所有抗HIV-1特异性抗体 均显著优于阴性对照血清(p＝0.001)。

当使3％HIV-1_IIIB感染的Jurkat细胞与97％未受感染的细胞混合 时，在0.5或0.05μg/ml的浓度下的阿霉素-P4/D10介导比游离 P4/D10、阿霉素-缀合的对照抗体、hLL1或游离阿霉素显著(p＝0.002) 更强对HIV-1感染的细胞内散布的抑制(图1B)。在所有其他浓度的 经感染和未受感染的细胞下均观察到类似结果。令人特别感兴趣的 是，相比由作为中和剂的阿霉素-P4/D10所获得的作用，似乎更加有 力地抑制感染的细胞内散布。而且，在使用高剂量的阿霉素-P4/D10 处理的培养物中无法找到感染性病毒，因为在将来自这些细胞培养物 的上清液转移至未经感染的Jurkat细胞之后未检测到p24产生(数据 未显示)。从游离HIV-1病毒的中和结合尚无法预测在阿霉素-P4/D10 和未缀合的P4/D10之间作用的显著差异(图1A)。

为了测试阿霉素-P4/D10抗体体内功效，将等基因HIV/MuLV- 感染的细胞连同缀合物腹膜内给予小鼠。类似之前的研究，在10天 之后收获腹膜腔细胞，并在所有对照中证实感染性HIV(Hinkula等人， 2004)。阿霉素-P4/D10抗体完全保护小鼠免受HIV-1感染的初级淋巴 细胞的攻击(p＝0.0001)(图2)。在攻击和使用100μg的阿霉素-P4/D10 抗体处理之后未从腹膜腔细胞中回收感染性HIV。当使用100μg的 未缀合的P4/D10抗体处理小鼠时，对于p24产生，所有均为阳性。 仅当剂量增加八倍、至800μg未缀合的P4/D10/小鼠时，观察到单独 的抗体的完全保护。在100-200μg的剂量或100-400μg的剂量的游 离阿霉素下没有任何阿霉素-缀合的对照抗体(hLL1或hRS7)提供任 何保护。

概述

阿霉素-P4/D10能够体外以及在实验性体内攻击模型中消除 HIV-1感染的细胞。未缀合的P4/D10MAb介导针对HIV-1感染的靶 细胞的ADCC以及中和HIV-1(Broliden等人，1990；Hinkula等人， 1994)的能力可以无毒方式增强其作为药物免疫缀合物的功效。

类似地，利用以下实施例中所公开的组合物和方法，可将有效的 抗-HIV免疫缀合物并入DNL复合物内。

实施例2.对接和锁定(DNL)构建体的制备

DDD和AD融合蛋白

DNL技术可用于制备包含几乎任何抗体、抗体片段、免疫调节 剂、细胞因子、PEG部分、毒素或其他效应子部分的二聚体、三聚体、 四聚体、六聚体等。对于某些优选的实施方案，可将抗-HIV抗体或 抗体片段以及HIV抑制剂制备为包含二聚化和对接结构域(DDD)或 者锚定结构域(AD)序列的融合蛋白。尽管在优选实施方案中，DDD 和AD部分可以为作为融合蛋白的效应子部分，但熟练技术人员意识 到，存在其他缀合方法，例如化学交联、点击化学反应(click chemistry  reaction)等。

技术是非限制性，并可将使用的任何蛋白或肽制备为用于并入 DNL复合物内的AD或DDD融合蛋白。在利用化学交联时，AD和 DDD缀合物可包含使用本领域已知任何交联技术可交联至AD或 DDD序列的任何分子。

表达载体

将质粒载体pdHL2用于制备大量抗体和基于抗体的构建体。参 见Gillies等人，J Immunol Methods(1989)，125：191-202；Losman等 人，Cancer(Phila)(1997)，80：2660-6。双顺反子哺乳动物表达载体引 导IgG的重和轻链的合成。载体序列与许多不同的IgG-pdHL2构建 体几乎相同，其差异仅存在于可变结构域(V_H和V_L)序列中。使用本 领域技术人员已知的分子生物工具，可将这些IgG表达载体转化至 Fab-DDD或Fab-AD表达载体内。

为了生成Fab-DDD表达载体，使用编码铰链的前4个残基、14 个残基Gly-Ser接头和诸如人RIIα的前44个残基(称为DDD1，SEQ ID  NO：1)的DDD部分的序列替代铰链、重链的CH2和CH3结构域的编 码序列。为了生成Fab-AD表达载体，使用编码铰链的前4个残基、 15个残基Gly-Ser接头和诸如称为AKAP-IS的17个残基合成AD(简 称AD1，SEQ ID NO：3)的AD部分的序列替代铰链、IgG的CH2和 CH3结构域的序列，使用生物信息和肽阵列技术来生成该AD部分， 并显示其以亲合力(0.4nM)结合RIIα二聚体。参见Alto,等人Proc.Natl. Acad.Sci.，U.S.A(2003)，100：4445-50。

如下所述，设计两种穿梭载体以便于转移IgG-pdHL2载体至 Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体。

CH1抗体结构域的制备

通过使用pdHL2质粒载体作为模板的PCR来扩增CH1抗体结构 域。左侧PCR引物由CH1结构域和SacII限制性核酸内切酶位点的 上游(5′)端组成，其是CH1编码序列的5′。右侧引物由编码铰链的前 4个残基的序列(PKSC，SEQ ID NO：85)组成，其后为四个甘氨酸和丝 氨酸，其最后两个密码子(GS)包含Bam HI限制性位点。将410bp PCR 扩增引物克隆至PCR克隆载体(Inc.)内，并筛 选克隆物以用于在T7(5′)定向中插入。

合成双链体寡核苷酸以编码前面为接头肽的11个残基的DDD1 的氨基酸序列，其前两个密码子包含BamHI限制性位点。终止密码 子和EagI限制性位点附接至3′端。以下显示编码的多肽序列。

GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：86)

合成在它们3′端上重叠30个碱基对的称为RIIA1-44顶部和 RIIA1-44底部的两种寡核苷酸，并使其联合以包含174bp DDD1序 列的中心154个碱基对。使寡核苷酸退火，并使用Taq聚合酶进行引 物延伸反应。在引物延伸之后，通过PCR扩增双链体。将扩增引物 克隆至内，并筛选以用于在T7(5′)定向中插入。

合成双链体寡核苷酸以编码前面为接头肽的11个残基的AD1的 氨基酸序列，该接头肽具有包含BamHI限制性位点的前两个密码子。 终止密码子和EagI限制性位点附接至3′端。以下显示编码的多肽序 列。

GSGGGGSGGGGSQEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：87)

合成和退火称为AKAP-IS顶部和AKAP-IS底部的编码以上肽序 列的两互补重叠寡核苷酸。通过PCR扩增双链体。将扩增引物克隆 至载体内，并筛选以用于在T7(5′)定向中插入。

接合DDD1与CH1

使用BamHI和NotI限制性酶将编码DDD1序列的190bp片段 由切除，然后使其接合至在CH1-中相同位点内以 生成穿梭载体CH1-DDD1-

接合AD1与CH1

使用BamHI和NotI将含有AD1序列的110bp片段由切除，然后将其接合至在CH1-中相同位点内以生成穿梭载 体CH1-AD1-

克隆CH1-DDD1或CH1-AD1至基于pdHL2的载体内

使用该模型设计，可将CH1-DDD1或CH1-AD1并入在pdHL2 载体中任何IgG构建体内。通过由pdHL2中去除SacII/EagI限制性片 段(CH1-CH3)以及使用由穿梭载体分别切除的CH1-DDD1 或CH1-AD1的SacII/EagI片段代替它，使用以上构建体之一来替代 全部重链恒定结构域。

h679-Fd-AD1-pdHL2的构建

h679-Fd-AD1-pdHL2是产生具有AD1的h679Fab的表达载体， 所述AD1通过由14个氨基酸残基组成的挠性Gly/Ser肽间隔子与Fd 的CH1结构域的羧基末端偶联。通过使用由具有SacII和EagI的 CH1-AD1-SV3穿梭载体切除的CH1-AD1片段代替SacII/EagI片段来 将含有h679的可变结构域的基于pdHL2的载体转变为 h679-Fd-AD1-pdHL2。679抗体是对组胺琥珀酰甘氨酸(HSG)特异的 半抗原-结合抗体(参见，例如，美国专利No.7,429,381、7,563,439)。

h679-Fab-AD1的制备和纯化

通过使用Sal I限制性核酸内切酶消化使h679-Fd-AD1-pdHL2载 体直线化，并通过电穿孔将所述载体转染至Sp/EEE骨髓瘤细胞内。 双顺反子表达载体引导h679κ轻链和h679Fd-AD1的合成和分泌，使 该它们联合以形成h679Fab-AD1。在电穿孔之后，将细胞接种在96- 孔组织培养平板中，并使用0.05μM氨甲蝶呤(MTX)来选择转染子克 隆物。通过使用经BSA-IMP260(HSG)缀合物涂覆的微量滴定板的 ELISA和使用HRP-缀合的山羊抗-人Fab的检测来筛选用于蛋白表达 的克隆物。通过测定由注入稀释的培养基样品获得的初始斜率，将使 用HSG(IMP239)传感器芯片(sensorchip)的BIAcore分析用于测定产 率。最高处生成克隆物具有约30mg/L的初始产率。通过单步骤 IMP291亲和层析将总计230mg的h679-Fab-AD1由4.5升的滚瓶培 养物中纯化。在荷载至IMP291-affigel柱之前，通过超滤将培养基浓 缩约10倍。使用PBS将柱子洗涤至基线，并使用1M咪唑、1mM  EDTA、0.1M NaAc(pH4.5)来洗脱h679-Fab-AD1。洗脱物的SE-HPLC 分析显示具有与50kDa蛋白(未显示)的保留时间一致的单尖峰。通过 还原SDS-PAGE分析(未显示)证实代表h679-AD1的多肽成分的仅两 条带。

C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2的构建

C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是产生包含融合蛋白 C-DDD1-Fab-hMN-14的两个拷贝的稳定二聚体的表达载体，其中 DDD1在CH1的羧基末端处通过挠性肽间隔子来连接hMN-14Fab。 通过使用SacII和EagI限制性核酸内切酶消化，将用于制备hMN-14 IgG的质粒载体hMN-14(I)-pdHL2转化为C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2 以去除CH1-CH3结构域和插入由具有SacII和EagI的 CH1-DDD1-SV3穿梭载体切除的CH1-DDD1片段。

将相同技术用于制备诸如hLL1、hLL2、hPAM4、hR1、hRS7、 hMN-14、hMN-15、hA19、hA20和许多其他抗体的大量已知抗体的 Fab表达的质粒。通常，抗体可变区编码序列存在于pdHL2表达载体 中，并将表达载体转化以用于制备如上所述的AD--或DDD-融合蛋白。 使包含任意这些抗体的Fab片段的AD-和DDD-融合蛋白以每一种 AD-融合蛋白中两种DDD-融合蛋白的合适比率联合以生成包含第一 抗体的两个Fab片段和第二抗体的一个Fab片段的三聚DNL复合物。

C-DDD1-Fab-hMN-14的制备和纯化

通过电穿孔将C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2载体转染至Sp2/0源 的骨髓瘤细胞内。C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是双顺反子表达载体， 其引导hMN-14κ轻链和hMN-14Fd-DDD1的合成和分泌，使它们以 形成C-DDD1-hMN-14Fab。通过与DDD1结构域相互作用，融合蛋 白形成稳定的同型二聚体。

在电穿孔之后，将细胞接种在96-孔组织培养平板中，并使用0.05 μM氨甲蝶呤(MTX)选择转染子克隆物。通过使用经WI2(大鼠抗-id 单克隆抗体至hMN-14)涂覆的微量滴定板的ELISA以及使用HRP- 缀合的山羊抗-人Fab检测来筛选用于蛋白表达的克隆物。最高处产 生C-DDD1-Fab-hMN14Fab克隆物的初始产率为60mg/L。通过使用 AD1柱的亲和柱层析可纯化分泌的C-DDD1-Fab-hMN14。AD1-C是 由AD1序列和羧基末端半胱氨酸残基组成的合成肽，在巯基与氯乙 酸酐的反应之后将其用于偶联肽与Affigel。在中性pH下使含有DDD 的二聚体结构特异性结合AD1-C-Affigel树脂，并在低pH(例如，pH 2.5)下可将其洗脱。

通过样品的SE-HPLC分析来测定C-DDD1-Fab-hMN-14的结合 活性，其中将测试物品与各种量的WI2混合。通过以0.75∶1的摩尔 比混合WI2Fab和C-DDD1-Fab-hMN-14制备的样品显示三个峰，其 归因于非结合的C-DDD1-Fab-hMN14(8.71分钟)、结合一个WI2Fab 的C-DDD1-Fab-hMN-14(7.95分钟)和结合两个WI2Fab的 C-DDD1-Fab-hMN14(7.37分钟)(未显示)。当分析含有4的摩尔比的 WI2Fab和C-DDD1-Fab-hMN-14的样品时，仅观察到在7.36分钟处 单峰(未显示)。这些结果表明：hMN14-Fab-DDD1为二聚以及具有两 个活性结合位点。竞争性ELISA证实C-DDD1-Fab-hMN-14结合具有 类似hMN-14IgG，但比单价hMN-14Fab(未显示)显著更强的抗体亲 抗原性的CEA。

C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2

C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是产生C-DDD2-Fab-hMN-14的表达 载体，其具有通过14个氨基酸残基Gly/Ser肽接头附接hMN-14的 Fd的羧基末端的DDD2的二聚化和对接结构域序列(SEQ ID NO：2)。 分泌的融合蛋白由通过DDD2结构域的非共价相互作用连接至一起 的hMN-14Fab的两个相同拷贝构成。

如下将表达载体工程化。合成制备包含DDD2的一部分接头肽 和残基1-13的编码序列的两重叠、互补寡核苷酸。将寡核苷酸退火 以及使用T4PNK将其磷酸化，得到在5′和3′端上与分别使用限制性 核酸内切酶BamHI和PstI消化的DNA的接合相容的突出端。

使双链体DNA接合至通过使用BamHI和PstI的消化制备的穿 梭载体CH1-DDD1内以生成穿梭载体 CH1-DDD2使用SacII和EagI由CH1-DDD2切 除507bp片段，并使其与通过使用SacII和EagI的消化制备的IgG 表达载体hMN-14(I)-pdHL2接合。最终表达构建体称为 C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。已经利用类似技术以生成大量不同人源 化抗体的Fab片段的DDD2-融合蛋白。

h679-Fd-AD2-pdHL2

设计h679-Fab-AD2以与C-DDD2-Fab-hMN-14配对。 h679-Fd-AD2-pdHL2是产生h679-Fab-AD2的表达载体，其具有通过 14个氨基酸残基Gly/Ser肽接头附接CH1结构域的羧基末端的AD2 的锚定结构域序列(SEQ ID NO：4)。AD2具有在AD1的锚定结构域序 列的前面的一个半胱氨酸残基以及另一在AD1的锚定结构域序列的 后面的另一半胱氨酸残基。

如下工程化表达载体。合成制备包含AD2和一部分接头序列的 编码序列的两重叠、互补寡核苷酸(AD2顶部和AD2底部)。将寡核 苷酸退火以及使用T4PNK将其磷酸化，得到在5′和3′端上与分别使 用限制性核酸内切酶BamHI和SpeI消化的DNA的接合相容的突出 端。

使双链体DNA接合至通过使用BamHI和SpeI的消化制备的穿 梭载体CH1-AD1-内以生成穿梭载体CH1-AD2- 使用SacII和EagI限制性酶由穿梭载体切除含有CH1和AD2编码序 列的429个碱基对片段，并将其接合至使用那些相同酶消化制备的 h679-pdHL2载体内。最终表达载体是h679-Fd-AD2-pdHL2。

C-H-AD2-IgG-pdHL2表达载体的产生

制备质粒穿梭载体以便于转变任意IgG-pdHL2载体至 C-H-AD2-IgG-pdHL2载体内。使用pdHL2载体作为模板以及Fc BglII 左侧和Fc Bam-EcoRI右侧引物来扩增Fc(CH2和CH3结构域)的基因。 将扩增引物克隆在PCR克隆载体中。使用XbaI和BamHI 限制性酶由中切除Fc插入片段，并与通过使用XbaI和 BamHI消化h679-Fab-AD2-pdHL2制备的AD2-pdHL2载体来接合以 生成穿梭载体Fc-AD2-pdHL2。

Fc BglII左侧

5’-AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG-3’(SEQ ID NO：88)

Fc Bam-EcoRI右侧

5’-GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’(SEQ ID NO：89)

为了转化任意IgG-pdHL2表达载体至C-H-AD2-IgG-pdHL2表达 载体，将861bp BsrGI/NdeI限制性片段由前者中切除，并使用由 Fc-AD2-pdHL2载体切除的952bp BsrGI/NdeI限制性片段替代。BsrGI 切割CH3结构域以及NdeI切割表达盒的下游(3′)。

实施例3.TF2DNL复合物的生成

通过使C-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2反应来获得称为 TF2的三聚DNL复合物。如下生成小试批次的TF2，具有＞90％产率。 以1.4∶1摩尔比将蛋白L-纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)与 h679-Fab-AD2(60mg)混合。在含有1mM EDTA的PBS中总蛋白浓 度为1.5mg/ml。随后步骤包括TCEP还原、HIC层析、DMSO氧化 和IMP291亲和层析。在加入TCEP之前，SE-HPLC并未显示a₂b形 成的任何证据(未显示)。5mM TCEP的加入快速导致与预期为二元结 构的157kDa蛋白一致的a₂b复合物的形成(未显示)。通过IMP291 亲和层析将TF2纯化至接近均质(未显示)。IMP291是含有HSG半抗 原的合成肽，679Fab结合至该HSG半抗原(Rossi等人，2005，Clin  Cancer Res11：7122s-29s)。IMP291非结合的部分的SE-HPLC分析表 明a₄、a₂和游离κ链从产物中去除(未显示)。

通过测定法来测定TF2的功能性。将TF2、 C-DDD1-hMN-14+h679-AD1(用作非共价a₂b复合物的对照样品)或 C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作非还原a₂和b组分的对照样品)稀 释至1μg/ml(总蛋白)，并使其通过经HSG固定的传感器芯片。TF2 的应答约为两种对照样品的两倍，这表明在对照样品中仅 h679-Fab-AD组分结合以及保留在传感器芯片上。随后注入WI2IgG， hMN-14的抗-个体基因型抗体表明仅TF2具有如通过另外信号应答 表示的与h679-Fab-AD紧密相关的DDD-Fab-hMN-14组件(未显示)。 由固定在传感器芯片上WI2与TF2的结合所致的应答单元的另外增 加对应两个完全功能性结合位点，其各自由C-DDD2-Fab-hMN-14的 一个亚单位构成。通过TF2结合WI2的两个Fab片段的能力证实这 个(未显示)。

TF2的血清稳定性

使用评价人血清中TF2的稳定性。将TF2稀释至新 鲜人血清中0.1mg/ml，并在37℃下5％CO₂下孵育数天。将每日样 品稀释至1∶25，然后通过使用IMP239HSG传感器芯片的来分析。WI2IgG的注入用于定量完整和完全活性TF2的量。比较血 清样品和由储液直接稀释的对照样品。TF2在血清中高度稳定，7天 后保留98％的其双特异性结合活性(未显示)。

实施例4.来自多种抗体的AD-和DDD-连接的Fab和IgG融合 蛋白的制备

使用在前述实施例中所述的技术，构建在表5中所示IgG和Fab 融合蛋白，并将其并入DNL复合物内。保留亲本抗体和DNL复合物 的抗原结合特征的融合蛋白表现出对并入抗体或抗体片段的抗原结 合活性。

表5.包含IgG或Fab的融合蛋白

熟练技术人员意识到，可应用DNL技术以制备包含抗体、抗体 片段和/或诸如抗-HIV治疗剂的其他治疗剂的多聚体复合物。本文的 实施例表明：在与亲本抗体相比，抗体或其片段可并入DNL复合物 内而减损任何抗体结合特征。

实施例5.多价DNL复合物的制备和使用

单特异性或双特异性的多价抗体可改善包括单一单克隆抗体 (mAb)的当前治疗干预的功效。多价抗-CD20抗体抗体由维妥珠单抗 (hA20，参见美国专利No.7,151,164、7,435,803、7,919,273)生成。我 们应用DNL方法以制备称为Hex-hA20的六价、抗-CD20抗体，其 包含六个Fab和一个Fc。我们显示，Hex-hA20保留在脂筏(lipid raft) 中与CD20缔合的所有六个Fab的结合活性、受感染的抗体依赖性细 胞介导的细胞毒性，但未保留补体-依赖性细胞毒性，并且在亚纳摩 尔浓度下体外抑制Daudi、Raji和Ramos细胞的增殖而无需交联抗体 (Rossi等人，2008，Cancer Res68：8384-92)。此外，Hex-hA20诱导强 同型粘附以及在刺激钙动员上无效(同前)。因此，如分别通过利妥昔 单抗和托西莫单抗(tositumomab)所证实，Hex-hA20表现出归因于类 型I和类型II抗-CD20mAb的生物性质。尽管Hex-hA20具有短血清 半衰期，在具有肿瘤的小鼠中与等同剂量下维妥珠单抗相比，它显示 抗肿瘤功效(同前)。

也应用DNL方法以生成没有Fc区、Tri-hA20和Tetra-hA20的 两种其他多价抗-CD20抗体，所述多价抗-CD20抗体分别包含三和四 个维妥珠单抗的Fab。类似于Hex-hA20，将这些纯化至接近均质， 并显示其在体外具有强效抗增殖活性(同前)，因而表明需要在细胞表 面上簇集三个或更多个CD20分子以诱导生长抑制。

材料和方法

细胞系。Daudi、Raji和Ramos购自美国模式培养物保藏所。将 Sp/ESF，经工程化以在无血清培养基中生长的Sp2/0-Ag14的变体用 作转染的宿主细胞。

Hex-hA20的生成。通过使用SacII和EagI切除C_H1-铰链-C_H2-C_H3结构域的编码序列以及使用由使用相同酶由 C-DDD2-hMN-14-pdHL2表达载体(如在以上实施例2中所述)切除的 编码C_H1-DDD2的507-bp序列将它替换，由 C_H3-AD2-IgG-hA20-pdHL2来生成编码C_H1-DDD2-Fab-hA20的表达载 体。通过使用SalI的消化将各30μg的表达载体 CH₃-AD2-IgG-hA20-pdHL2或C_H1-DDD2-Fab-hA20-pdHL2直线化， 并通过电穿孔(450V，25μF)转染至Sp/ESF(2.8x10⁶细胞)内。pdHL2 载体含有用于二氢叶酸还原酶的基因，因而使得可克隆选择以及使用 氨甲蝶呤(MTX)来基因扩增。在转染之后，将细胞接种在96-孔板中， 并在含有0.2μmoI/L MTX的培养基中选择。通过使用经WR2(大鼠 抗-个体基因型抗体至维妥珠单抗)涂覆的96-孔微升平板的夹心 ELISA来筛选克隆物的C_H3-AD2-IgG-hA20或C_H1-DDD2-Fab-hA20 产率以捕获融合蛋白，使用辣根过氧化物酶-缀合的山羊抗-人IgG F(ab′)₂来检测该融合蛋白。使给予最高信号的孔扩张，并最终用于制 备。

将C_H3-AD2-IgG-hA20和C_H1-DDD2-Fab-hA20在滚瓶中制备，通 过亲和层析分别在蛋白A和蛋白L上纯化，并保存在PBS中。为了 生成Hex-hA20，在室温下使用1mmol/L还原的谷胱甘肽来处理 C_H1-DDD2-Fab-hA20(134mg)和C_H3-AD2-IgG-hA20(100mg)的混合物 16小时，随后为2mmol/L氧化的谷胱甘肽处理24小时，由此通过 蛋白A纯化Hex-hA20。通过使C_H3-AD2-IgG-hA20与 C_H1-DDD2-Fab-hMN-14反应类似地制备DNL-20/14。

Tetra-hA20和Tri-hA20的生成。通过在SUPERDEX^TM-200柱上 纯化C_H1-DDD2-Fab-hA20的四聚形式来获得Tetra-hA20。通过使 C_H1-DDD2-Fab-hA20的二聚形式与如在h679-Fab-AD2的以上实施例 2中制备的C_H1-AD2-Fab-hA20共价连接来获得Tri-hA20。

竞争性ELISA。使用5μg/mL下维妥珠单抗将微量滴定板涂覆过 夜，并使用含有2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS阻断1小时。将连续 稀释一式三份的Hex-hA20和维妥珠单抗各自与1nmol L下WR2混 合，并添加至涂覆的孔中。使用过氧化物酶缀合的山羊抗-大鼠IgG 和O-苯二胺二盐酸盐定量结合的WR2。

流式细胞术。使用生产商试剂、方案和软件在PCA(Guava Technologies，Inc.)上通过流式细胞术进行细胞凋亡、活细 胞计数、细胞结合和解离率测定。

Scatchard分析。通过使用软件(Software， Inc.)由放射性碘化样品和Raji细胞获得的饱和结合数据的非线性回 归分析获得结合位点的最大数目/细胞和明显亲合力常数。样品一式 三份进行。如通过与WR2的结合所测定，各放射标记制剂的免疫活 性为90％或更大。

细胞增殖测定法。使用通过代谢活性细胞化学还原至甲臜 (formazan)内的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4- 磺苯基)-2H-四唑(MTS)来测定体外细胞毒性，并且所得颜色强度与活 细胞数目成比例。

CDC。将细胞以5x10⁴细胞接种在50μl/孔的黑色96-孔微升平 板中，并在37℃和5％CO₂下在人补体(1∶20最终稀释)的存在下使用 测试和对照mAb的连续稀释物(浓度范围，3.33x10^-8至2.6x 10^-10mol/L)来孵育2小时。然后使用VYBRANT^TM Cell Metabolic  Assay Resazurin试剂盒(Invitrogen)来定量活细胞。对照包括经0.25％ Triton X-100处理的细胞(100％裂解)和经单独的补体处理的细胞(背 景)。

ADCC。在37℃和5％CO₂下使用5μg/mL的各测试样品一式三 份孵育Daudi细胞30分钟。然后在预定最佳效应子下将由健康志愿 者中获得的新鲜分离的周围血液单核细胞添加至50∶1的靶比率。在 4-h孵育之后，通过CYTOTOX-ONE^TM(Promega)来评估细胞裂解物。

钙动员。使用Becton Dickinson和FlowJo程序(Tree  Star，Inc.)在荷载有20μmol/L Fluo-3AM(Invitrogen)的Ramos细胞中 测定细胞内钙。对于所有样品，在添加包括离子霉素和作为阳性对照 的抗-人IgM的各测试样品之前获得60秒的基线。为了评估交联的作 用，使用1μg/mL维妥珠单抗、利妥昔单抗或托西莫单抗进一步孵育 细胞15分钟，并使用合适的第二抗体(最终50μg/mL)来刺激。

同型粘附。使用在1nmol/L下维妥珠单抗、Tri-hA20、Tetra-hA20 或Hex-hA20处理Daudi细胞(1.5x10⁶/mL)20小时，然后使用反向物 相-对比显微镜来检查。根据Polyak和Deans(2002，Blood99：3256-62) 来半定量计分结果。

动物研究。在雌性Swiss-Webster天然鼠中进行药物代谢动力学 分析，并使用放射性碘化样品比较静脉或皮下(s.c.)给予的Hex-hA20 和维妥珠单抗。在具有肿瘤的SCID小鼠中评估体内功效，如所述 (Hernandez-Ilizaliturri等人，2003，Clin Cancer Res9：5866-73)进行以下 修改来进行自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞的耗竭。简言之，在接 种Raji细胞之前，使小鼠接受抗小鼠Gr-1腹水(100μL)和TMβ-l mAb(100μg)的腹膜内注射1天，并在第6、13和20天每周接受更多 三次的抗小鼠Gr-1腹水的腹膜内注射以维持嗜中性粒细胞耗竭，通 过由一只经处理和一只未经处理的小鼠中在第3、13和20天时取样 的血液样品的荧光-激活的细胞分类分析来证实。当出现后肢麻痹或 者如果它们垂死，则将认为已经屈服于疾病进展的小鼠人道处死。另 外，如果小鼠损耗＞20％的初始体重，则将它们处死。使用Kaplan-Meier 绘制(时序检验)和软件来分析存活曲线。

结果

通过DNL制备的六价抗体。通过在氧化还原条件下混合 C_H1-DDD2-Fab-hA20与C_H3-AD2-IgG-hA20，随后纯化蛋白A可容易 地获得Hex-hA20。以良好产率制备C_H1-DDD2-Fab-hA20和 C_H3-AD2-IgG-hA20作为在骨髓瘤细胞中融合蛋白，随后分别通过蛋 白L和蛋白A来纯化培养上清液。

通过还原SDS-PAGE的Hex-hA20的纯度显示组成性多肽的仅三 条带(数据未显示)。由于未观察到对应C_H3-AD2-IgG-hA20的单体形 式的带，Hex-hA20的非还原性SDS-PAGE分析证实它的共价结构(未 显示)。通过MALDI-TOF质谱测定法测定Hex-hA20的分子质量为 368,475Da，其与来自构成性多肽的推导的氨基酸序列的Hex-hA20 的362kDa的计算分子量相符。

结合分析。如通过竞争性ELISA(图3A)所示，Hex-hA20具有比 维妥珠单抗高3倍的抗体亲抗原性，这表明六个Fab组件中至少三个 或更多个能够同时结合WR2抗个体基因型抗体。通过流式细胞术比 较在肝脏细胞上与维妥珠单抗与CD20的结合相比的Hex-hA20与 CD20的结合。当通过PE-抗-Fab探测时，Hex-hA20导致比维妥珠单 抗大40％至50％的荧光强度(图3B)。相反，观察的具有PE-抗-Fc的 Hex-hA20的信号比维妥珠单抗的要低。这些结果与具有比维妥珠单 抗多四个Fab、但仅一个Fc类似维妥珠单抗的Hex-hA20一致。

通过与Raji细胞的结合的Scatchard分析提供Hex-hA20的更高 效价和抗体亲抗原性的另外的证据(图3C)，其显示：Hex-hA20的缔 合常数[～3.9x10⁸(mol/L)^-1]比维妥珠单抗[～1x10⁸(mol/L)^-1]显著高～4 倍(P＜0.0001)，而F检验判断出利妥昔单抗和维妥珠单抗的饱和结合 曲线类似(P＝0.1859)。更重要地，据发现，由Hex-hA20获得的最大 结合位点数(B_max)计算的每细胞的受体数目为维妥珠单抗所获得的 ～1/4(～100,000比对～437,5000)，这表明因为相同数目的CD20分子需 要如维妥珠单抗所需的三倍数量以占有它们，所以Hex-hA20的所有 六个Fab均能够在细胞表面上结合CD20。由解离率测定所获得的数 据(图3D)也表明Hex-hA20比维妥珠单抗离解慢～3倍，该维妥珠单抗 离解比利妥昔单抗慢～2倍至3倍(Glennie等人，2007，Mol Immunol 44： 3823-37)。

抗增殖活性。基于MTS分析(图4A)，Hex-hA20强烈抑制在三 种Burkitt淋巴瘤细胞系(Raji、Ramo和Daudi)中增殖，其分别具有 0.064、0.15和0.15nmol/L的EC₅₀。相反，在缺乏交联抗体下仅在＞10 nmol/L下维妥珠单抗显示在所有三种细胞系中可检测效能。如所预 期，维妥珠单抗与山羊抗-人Fc的交联导致对增殖的显著抑制。对于 Hex-hA20，交联不会进一步增加在Daudi中的效能。另外的实验通 过活细胞计数比较在5天内Hex-hA20、Tri-hA20和Tetra-hA20对细 胞增殖的作用。Raji和Ramos的代表性结果显示在图4B中，其显示 在低至0.5nmol/L的浓度下在未交联下Tri-hA20、Tetra-hA20和 Hex-hA20抑制50％或更多细胞增殖的能力。获得Daudi的类似结果 (数据未显示)。细胞计数分析也显示，当使用Ramos评估3天时， Hex-hA20((EC₅₀＝0.17nmol/L)比抗-B1(EC₅₀＝4.65nmol/L)相对更强 效。

细胞凋亡和半胱天冬酶(caspase)和钙的作用。使用在0.5或5 nmol/L下三种多价抗-CD20构建体来处理Raji细胞，并在24小时之 后使用连接蛋白测定法来分析(图5A，左)。使用Tri-hA20、 Tetra-hA20或Hex-hA20处理导致与二价维妥珠单抗(6-9％)和未经处 理的对照(3％)相比更多细胞早期细胞凋亡(12-16％)。使用Daudi和 Ramos细胞获得可比较的结果(数据未显示)。

使用多半胱天冬酶测定法在24小时时间段内也评估 使用5nmol/L Hex-hA20或维妥珠单抗处理的Raji细胞的细胞凋亡程 度(图5A，右)。对于Hex-hA20和维妥珠单抗，在24小时处结果分 别为17％和6％，其与通过连接蛋白测定的那些相一致。

在Ramos中测定Z-VAD-FMK(广谱半胱天冬酶抑制剂)对由 Hex-hA20诱导的细胞凋亡的作用，并且结果(未显示)表明在100 μmol/L处Z-VAD-FMK完全抑制通过抗人IgM诱导的细胞凋亡，但 不抑制通过Hex-hA20诱导的细胞凋亡，这表明Hex-hA20出现半胱 天冬酶-依赖性和半胱天冬酶-非依赖性途径。尽管间接通过抗原结合 的维妥珠单抗与第二抗体的交联或者直接通过Hex-hA20的多价接合 可假设性获得CD20簇集，但前者而非后者导致细胞内钙水平的快速 上升(未显示)。

效应子功能。使用人补体和Daudi细胞来体外评估CDC活性(图 5B，左)。维妥珠单抗表现出强效CDC活性。令人惊讶的是，Hex-hA20 不能在Daudi细胞中诱导CDC。因为C_H3-AD2-IgG-hA20以类似维妥 珠单抗的效能诱导CDC，通过加入小AD2肽的维妥珠单抗的羧基末 端的修饰不会影响CDC，这表明尽管Hex-hA20具有结合Clq的能力， 但加入四个Fab-DDD2基团明显抑制补体固定(数据未显示)。 Hex-hA20和维妥珠单抗具有可比较的ADCC(图5B，右)。因此， Hex-hA20的Fc诱导ADCC。

同型粘附。Hex-hA20、Tetra-hA20和Tri-hA20诱导Daudi细胞 的同型粘附，这导致具有中等尺寸至大尺寸的聚集体的＞50％的细胞， 而在相同条件下，观察到的维妥珠单抗的细胞聚集程度类似于未经处 理对照的细胞聚集程度(未显示)。

CD20/Hex-hA20的膜定位。使用霍乱毒素亚单位B-Alexa Fluor 488作为神经节苷脂GM-1(一种常见脂筏标志物)的报道分子，使用免 疫荧光显微术来检查与维妥珠单抗或Hex-hA20结合后在细胞表面处 CD20的分布。使用维妥珠单抗或Hex-hA20对Daudi细胞的孵育导 致形成具有标点斑点(punctuate spot)的膜补丁或帽，其与通过霍乱毒 素亚单位B获得的显像极佳地匹配，这表示在脂筏中CD20的定位(未 显示)。尽管观察到的荧光图谱类似，但维妥珠单抗似乎形成比 Hex-hA20更大和更系的补丁(未显示)。

血清稳定性。据发现，Hex-hA20具有如维妥珠单抗在血清中相 同稳定性，在11天之后其维持86％结合活性(未显示)。这些结果类 似于之前所报道的双特异性Tri-Fab复合物的那些结果(Rossi等人， 2006，Proc Natl Acad Sci USA103：6841-6)。

药物代谢动力学分析。使用放射性碘化制剂，据发现，当静脉给 予时，Hex-hA20比维妥珠单抗快～4.5倍清除，这导致与维妥珠单抗 相比慢3.7-倍的Hex-hA20的平均停留时间(127小时比对472小时)。 当皮下给予时，Hex-hA20(T_1/2～3天)以比维妥珠单抗远远更快的速率 清除(T_1/2＞9天)，两者具有24小时的相同T_max(未显示)。然而，相比 于维妥珠单抗，C_max仅为Hex-hA20的一半高度(12.9nmol/比对25.7 nmol/L)。

体内功效。在使用Daudi模型的多剂量研究中，使用30μg(q7dx2) 和6μg(q7dx2)的Hex-hA20来处理小鼠。如在图6A中所示，当与盐 水对照相比时，两处理导致显著改善平均存活时间(MST)(21天比对 66.5和42；P＜0.0001)。尽管在高剂量下给予Hex-hA20和维妥珠单 抗的小鼠之间未观察到存活率的显著差异，但似乎接受低剂量的 Hex-hA20的小鼠具有比接受等同剂量的维妥珠单抗的那些小鼠显著 更低的MST(P＝0.0044)。

我们也检查使用Raji模型下效应细胞对抑制肿瘤生长的作用(图 6B)。在耗竭NK细胞和嗜中性粒细胞的那些动物中，在盐水对照和 经维妥珠单抗或Hex-hA20处理的小鼠之间没有差异(所有三组均为 MST＝17天)。相反，接受Hex-hA20或维妥珠单抗的未耗竭的小鼠 具有比盐水对照显著改善的存活率(P＝0.0034)，对于Hex-hA20、维 妥珠单抗和未经处理者分别具有59、41和19天的MST。重要的是， 在该较高摩尔等同剂量下观察到Hex-hA20比维妥珠单抗更好的处理 结果(P＝0.05)(465μg Hex-hA20比对200μg维妥珠单抗)。

讨论

Tri-hA20而非维妥珠单抗能够强效体外抑制CD20阳性细胞的增 殖的事实与在Tri-hA20中所有三种Fab能够同时结合CD20的模型 一致，这导致CD20的簇集以及信号转导开始，其导致我们推导出抗 -CD20抗体所需的3的最小效价有效地诱导在没有交联下生长抑制。

基于在某些体外测定法中它们的功效，已由Cragg及同事(Cragg 等人，2003，Blood 101：1045-52)分类抗-CD20mAb为通过利妥昔单抗 代表的类型I或者通过托西莫单抗代表的类型II。我们注意到， Hex-hA20表现出可归因于类型II(例如，对CDC和钙动员阴性；对 抗增殖、细胞凋亡和同型粘附阳性)和类型I(例如，对至脂筏的运输 阳性)的生物性质。因此，转化类型I抗-CD20mAb至类型II的一种 有效方法可通过使类型I mAb多效价来实现。信号转导途径的初步研 究表明Hex-hA20诱导半胱天冬酶-依赖性以及半胱天冬酶-非依赖性 细胞凋亡。鉴定与CD20与Hex-hA20或Tri-hA20的结合相关的亚细 胞事件的另外研究在进行中，其可明确揭示解释具有明确组成的多价 抗-CD20抗体的抗增殖效能的分子因子。

这些结果证实通过DNL方法制备的多价抗体产生更有效能。熟 练技术人员意识到，使用相同技术可构建包含诸如P4/D10、2G12、 2F5或4E10的一种或多种抗-HIV抗体或其片段的多价DNL复合物。

实施例6.聚乙二醇化DNL复合物

在某些实施方案中，可将PEG部分并入DNL复合物内以例如提 供效应子部分的可再生和均质聚乙二醇化产物。作为第一步，在市售 肽合成器上合成用于并入DNL复合物内的能够共价缀合PEG部分的 以下肽亚单位。将Fmoc-Cys(t-Buthio)-OH用于添加SS-tbu残基。将 Fmoc-Gly-EDANS树脂用于附接G-EDANS部分。

IMP350

CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SS-tbu)-NH₂(SEQ ID NO：93)

IMP360

CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SS-tbu)-G-EDANS(SEQ ID NO：94)

IMP421

Ac-C-PEG₃-C(S-tBu)GQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(S-tBu)G-NH₂(SEQ ID  NO：95)

IMP362、IMP413和IMP457的生成

通过使IMP360与20-kDa或30-kDa的mPEG-OPTE(Nectar  Therapeutics，San Carlos，CA)偶联来制备两线性PEG-AD2模件，分别 得到IMP362或IMP413。为了制备IMP362，将IMP360(11.5mg)与 20-kDa mPEG-OPTE(127mg)在7mL的1M Tris-HCL，pH7.8中混合。 将乙腈(1mL)加入以溶解一些悬浮的材料。在室温下将反应搅拌4小 时以作用于通过酰胺键的mPEG与氨基末端半胱氨酸的附接。随后， 将41mg的Tris[2-羧乙基]膦盐酸盐(TCEP)和43mg的半胱氨酸加入 以脱保护剩余半胱氨酸。将反应混合物搅拌1小时，并使用已用20％ 水中的甲醇平衡的PD-10柱脱盐。将样品冻干以获得约150mg的 IMP362。使用30-kDa mPEG-OPTE(190mg)类似地制备IMP413。使 用mPEG2-MAL-40K(Nectar Therapeutics)类似地制备IMP457以获得 支链的PEG-AD2模件(IMP457)。

在哺乳动物细胞中用于表达的IFN-α2b-DDD2-pdHL2的构建

通过使用全长人IFNα2b cDNA克隆物(Invitrogen ULTIMATE^TM  ORF人克隆物cat#HORF01克隆物ID IOH35221)作为模板和以下寡 核苷酸作为引物的PCR来扩增IFN-α2b的cDNA序列：

IFNA2Xba I左侧

5’-TCTAGACACAGGACCTCATCATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGG-3’(SEQ ID  NO：96)

IFNA2BamHI右侧

5’- GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGC- 3’(SEQ ID NO：97)

所得分泌的蛋白由在其C-末端处与由SEQ ID NO：98组成的多肽 融合的IFN-α2b组成。

KSHHHHHHGSGGGGSGGGCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTR LREARA(SEQ ID NO：98)

将PCR扩增引物克隆至载体内。通过使用XbaI和 Bam HI限制性核酸内切酶的消化来制备用于与IFN-α2b接合的 DDD2-pdHL2哺乳动物表达载体。使用XbaI和Bam HI由切除IFN-α2b扩增引物，并将其接合至DDD2-pdHL2载体内以生成 表达载体IFN-α2b-DDD2-pdHL2。

通过使用SalI酶消化来使IFN-α2b-DDD2-pdHL2直线化，并通 过用于产生表达的蛋白的电穿孔来将其稳定地转染至Sp/EEE骨髓瘤 细胞内(参见，例如，美国专利No.7,537,930，其实施例部分以引用 方式并入本文)。

α2b-362(IFN-α2b-DDD2-IMP362)的制备和纯化

α2b-362的结构具有偶联至20kDa PEG-AD的IFNα2b-DDD2的 两个拷贝。通过在250mM咪唑、0.02％吐温20、150mM NaCl、1mM  EDTA、50mM NaH₂PO₄，(pH7.5)的10倍摩尔过量的2.25mg(3.5ml) 的IFN-α2b-DDD2中加入11mg的还原和冻干的IMP362来进行DNL 反应。在室温下在黑暗处6小时之后，将反应混合物冻干以及通过在 阳离子交换树脂上的柱层析来纯化。

DNL反应导致位点特异性以及IMP362与IFN-α2b的二聚体的共 价缀合。总之，DNL反应导致均质产物的在通过阳离子交换层析的 纯化之后＞90％纯的接近定量产率(未显示)。

通过类似技术制备聚乙二醇化产物 α2b-457(IFN-α2b-DDD2-IMP457)和 α2b-413(IFN-α2b-DDD2-IMP413)。

药物代谢动力学

在成年雌性Swiss-Webster小鼠(～35g)中进行研究。以作为单次 快速推注静脉注射的等摩尔的蛋白剂量(3μg的rhuIFN-α2a、5μg的 11μg的α2b-362以及13μg的α2b-413)来施用各试 剂(测试和对照)。在各时间点(给药前、注射后5-分钟、2-、8-、24-、 48-、72-、96-和168-h)下通过眼眶后方法给小鼠取血。使血液凝结， 离心，并将血清分离和保存在-70℃下直至测定IFN-α浓度以及随后 PK-分析。

各试剂的PK性质概述在表6中。如所预期，rhIFN-α2a具有从 注射小鼠的血液最快的清除率。它的清除率比快约3 倍以及比DNL-EFN试剂更快13倍。结果，清除比 α2b-362或α2b-413更快4倍。在α2b-362和α2b-413之间的消除率 上有较小差异。

依据平均停留时间(MRT)，在各试剂之间与尺寸有明确相关性。 19-kDa rhIFN-α2a具有比31kDa低7倍的MRT(分别 为0.7小时比对5.1小时)，当与70kDaα2b-362(10.3小时)相比时， 其具有低2倍的MRT。80kDaα2b-413的MRT(21.7小时)比α2b-362 长两倍。最后，生物等效的测试显示：根据PK，没有测试的试剂相 同，这表明该差异是真实的(即，循环半衰期为：α2b-413＞α2b-362＞ ＞rhIFN-α2a)。

体内功效

体内肿瘤治疗研究证实：DNL-聚乙二醇化干扰素比 更强效和持续更久。以1.5x10⁷细胞/动物向8周龄雌 性C.B.-17SCID小鼠静脉注射人Burkitt淋巴瘤细胞系(Daudi)。每7 天通过在左或右侧皮下注射3种不同剂量(3500、7000和14000单位) 来施用等同单位活性的α2b-362和α2b-413。在植入 Daudi细胞之后1天开始治疗。

绘制存活率曲线。当与盐水对照小鼠相比，α2b-362和α2b-413均证实显著改善存活率(P＜0.0016)(未显示)。当等 活性剂量施用时，除了3,500IU剂量的α2b-362之外，α2b-413和 α2b-362均优于(P≤0.0027)(未显示)。α2b-362显示比 的效能大两倍(未显示)。7,000IU和3,500IU的α2b-362 的剂量分别优于14,000IU(P＝0.0016)和7,000IU(P＝0.0027)剂量的 (未显示)。因为3,500IU剂量的前者优于14,000IU的 后者，所以α2b-413比更强效四倍(P＝0.0027)(未显示)。 当以等同剂量施用时，α2b-413显著优于α2b-362(P＜0.0025)。然而， 即使与3,500IU剂量和其46天存活中值相比14,000IU剂量导致60 天的存活中值，在三剂量的α2b-413之间也没有统计学显著差异 (P＝0.1255)。因此，观察到的α2b-362、α2b-413和的 体内功效与PK数据较好相关。

通过PK分析证实的α2b-362和α2b-413的增加的生物利用率归 因于增强的DNL-聚乙二醇化IFNα的体内抗肿瘤效能。结果，这两 个因素使得在肿瘤治疗中可以更低频率的时间表给药。使用如上的类 似体内肿瘤治疗证实这点，其中使用不同给药时间表来施用等单位活 性的或α2b-413。通过皮下注射在左或右侧以14,000 IU来施用各试剂(测试和对照)。

当与在与相同时间表下处理的那些动物相比较， 所有经IFN-IMP413处理的小鼠具有显著改善的存活率(P＜0.0097)(未 显示)。注意，那些每隔一周使用IFN-IMP413(q2wkx4)处理的小鼠不 仅具有与那些在相同时间表下使用处理的那些相比显 著改善的存活率(分别MST＝＞54天比对28天；P＝0.0002)，也比使用 每周处理的动物(q7dx4)显著更好(MST＝36.5天； P＝0.0049)(未显示)。而且，使用IFN-IMP413每三周一次处理(q3wkx4) 的小鼠的存活率显著优于使用每两周处理一次的那些 (MST＝54天比对28天；P＝0.002)，并当与使用每周处 理一次的那些相比接近显著(P＝0.0598)(未显示)。

在另一研究中，我们发现，以14,000IU每4周一次施用α2b-413 由盐水对照的23天增加存活中值至56天，并且比以14,000IU每周 一次给予的更强效(未显示)。

为了更好地与比较，我们缀合IFNα2b-DDD2至 IMP457，一种40-kDa支链PEG的AD2-模件，并获得所得α2b-457。 与α2b-413相比，通过三种不同测定法测定的α2b-457的体外生物活 性比更低，并相对比显著更高(未显示)。 使用单次皮下注射的小鼠中获得的PK数据表明α2b-457比α2b-413 或的更长循环半衰期，三者均比清除更慢 (未显示)。

当以20pmol的低剂量每四周一次给予时，α2b-457比以摩尔等 同剂量每周一次给予的更有效。当与盐水组的23天 比较时，α2b-457的施用延长具有Daudi的小鼠的存活中值至47天(未 显示)。在相同的研究中，20pmol下α2b-457显著优于20pmol下 α2b-413或(MST＝47天比对分别的41和37天； P＜0.0151)(未显示)。与相比，20pmol剂量的α2b-413 也改善存活率(P＝0.002)(未显示)。在10pmol下，在α2b-457和α2b-413 之间没有差异，但显著改善在经处理的小鼠内存活率 (P＜0.001)(未显示)。

这些研究证实：即使当与IFNα2b的聚乙二醇化形式相比时，使 用DNL技术使治疗剂聚乙二醇化也导致改善功效和使功效持续更长 时间，这使得可以更低频率给药。熟练技术人员意识到，DNL PEG 缀合物可提供抗-HIV治疗剂的类似改善的药物代谢动力学和/或功 效。

实施例7.抗-HIV DNL复合物

在中和HIV-1的各种抗体中，通过它的诱导抗体依赖性细胞介导 的细胞毒性(ADCC)以消除表达结合P4/D10的抗原性gp120表位的受 感染的T细胞的能力来区分鼠抗-gp120抗体，P4/D10(Broliden等人， 1990，J Virol64：936-40)。增强的效能也显示在阿霉素-缀合的P4/D10 的以上实施例1中以中和和抑制体外HIV感染的细胞内散布，以及 以保护抵抗体内HIV-1/MuLV感染(Johansson等人，2006，AIDS20： 1911-15)。

将对接和锁定(DNL)方法用于生成包含P4/D10IgG或其他抗体 或其片段以及一种或多种抗-HIV试剂的DNL复合物。在本文示出的 优选的实施方案中，抗-HIV试剂是T20HIV融合抑制剂(恩夫韦地， )(Asboe，2004，HIV Clin Trials5：1-6)。然而，熟练技术人员 意识到，可使本领域已知、以上更详细描述的其他抗-HIV治疗剂附 接抗-HIV DNL复合物或者在施用抗-HIV DNL复合物之前、同时或 之后单独施用。

主题DNL复合物的初始靶HIV患者群体是HAART治疗失败的 个体，其中多剂量的DNL缀合物可有效地降低受感染的细胞和循环 病毒颗粒的数目。第二类患者群体是对HAART有效的个体，其目的 是为了达到和消除少数持续、产生病毒的细胞。

在图7所示的优选的实施方案中，DNL方法用于开发包含连接 具有HIV-1的特异性的嵌合、人或人源化抗体的恩夫韦地(T20)的多 个拷贝的新型种类的抗-HIV试剂。通过短接头使IgG抗体的各重链 的C-末端附接至AD2部分(SEQ ID NO：4)，并将其表达为如以上实施 例中所述的融合蛋白。使T20HIV融合抑制剂附接DDD2部分(SEQ  ID NO：2)，并也表达为融合蛋白。DDD2部分的两个拷贝自发形成结 合AD2部分的二聚体，其形成包含IgG抗体和T20的四个拷贝的DNL 复合物。迄今获得的临床前研究表明这些IgG-(T20)₄缀合物应当使可 比未缀合的T20频率更低地给药以阻断HIV-1进入T细胞、中和无 HIV-1的细胞以及消除HIV-感染的细胞。

DDD2-T20氨基酸序列显示在以下SEQ ID NO：99中。DDD2的 序列标有下划线。这随后为用于亲和纯化的短接头和铰链区以及聚组 氨酸标签。在C-末端处T20的序列标有粗体。DDD2-T20由LC-MS 显示的大肠杆菌中产生以具有由设计的氨基酸序列预测的精确质量 (数据未显示)，并将其用于制备如下所述的DNL复合物。

DDD2-T20

MCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARAEFPKPSTPPGSSG HHHHHHGSYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(SEQ ID  NO：99)

P4/D10是当向人受试者施用时可诱导人抗-小鼠抗体(HAMA)的 鼠抗体。P4/D10的嵌合或人源化形式对于人治疗用途更加合适。通 过移植P4/D10的V_H和Vκ序列(图8)至人IgG1的恒定区序列来构建 嵌合的P4/D10(cP4/D10)。所得cP4/D10具有如在可变结构域的 P4/D10中相同DNA和氨基酸序列(图9)。制备cP4/D10，并发现它对 gp160(包含gp120和gp41)的结合亲合力与鼠P4/D10的结合亲合力可 比较(图10A)。也发现，对位于gp120的V3环中P4/D10的反应表位 的cP4/D10的结合亲合力与P4/D10可比较，并不受8M脲存在下影 响(图10B)。

除了代表中和抗-HIV mAb的cP4/D10之外，使用两种人源化 IgG1抗体、h734(抗-铟-DTPA)和hLL2(依帕珠单抗；抗-CD22)以及 hA20的Fab(维妥珠单抗，抗-CD20)体外研究和证实使T20与其他抗 体缀合以增强T20的效能的潜能。结果(图11至图13)显示通过并入 它至具有大量既未中和也未针对HIV的细胞表面受体(CD4)或共同受 体(CCR5和CXCR4)的抗体或抗体片段的DNL复合物内可改善常见 HIV-融合抑制剂以及特别是T20的功效。通过共同施用具有诸如 2G12(Hessell等人，2009，PLoS Pathogens5：e1000433)的广泛中和抗体 和/或靶向CD4、CCR5或CXCR4的抗体的含有T20的DNL复合物 可达到对功效的进一步增加。以下表7列出迄今制备的含有T20的选 择性DNL缀合物以及它们各自的抗体组分。hLL2-(T20)₄、 cP4/D10-(T20)₄和hA20-Fab-(T20)₂以及它们对应AD2模件的 SE-HPLC分析与DNL复合物的所提出结构一致。

表7.DNL-T20复合物。

DDD2-T20在大肠杆菌中产生以及与h734-IgG-AD2和 hLL2-IgG-AD2模件一起使用以制备h734-(T20)₄和hLL2-(T20)₄、对 HIV特异的两种DNL复合物。图11A通过p24 ELISA比较DDD2-T20 h734-(T20)₄和未缀合的T20()的体外中和活性(Johansson 等人，2006，AIDS 20：1911-15)，当以μg/ml的各试剂浓度表示X轴 时，其显示几乎相等的效能。因为h734-(T20)₄的分子量显著高于 DDD2-T20或T20，将这些数据以摩尔浓度再进行绘制(图11B)。当 以摩尔计绘制时，显示h734-(T20)₄优于DDD2-T20和T20的更好效 能(图11B)。

使用选择性HIV融合抑制剂的公开数据对h734-(T20)₄的效能的 比较提供在表8中。与T20的1至2nM相比，h734-(T20)₄复合物表 现出约0.1nM的EC₅₀。与T20的约10nM相比，h734-(T20)₄复合物 表现出约0.6nM的EC₉₀。h734-(T20)₄DNL复合物的EC₅₀和EC₉₀值 比任何其他HIV融合抑制剂所报道的那些值更低(表8)。这些结果显 示：即使当使用非靶向抗体时，其与T20的DNL复合物表现出比未 缀合的T20基本上更高的效能，其显著优于使用非DNL的其他技术 制备的融合抑制剂的缀合物。例如，与未缀合的T20相比，EP40111， T20的PEG-戊多糖缀合物具有基本上降低的效能。PC-1505，C34的 人血清白蛋白缀合物(与T20相比，显示一定程度改善的功效，但具 有类似半衰期的T20类似物)未显示超过T20的改善的效能。

表8.HIV融合抑制剂的效力

DNL试剂的体外功效进一步图示在图12A-D中，其比较中和在 Jurkat T细胞中HIV-1_IIIB和在PBMC中HIV-1₆₇₉₄的P4/D10、cP4/D10、 cP4/D10-(T20)₄、h734-(T20)₄和hLL2-(T20)₄的效力。这些结果表示如 下。在中和在Jurkat T细胞中HIV-1_IIIB上，cP4/D10和P4/D10的效 力等同(图12A)。在中和HIV-1_IIIB和HIV-1₆₇₉₄上，cP4/D10-(T20)₄比 cP4/D10更强效(图12B-D)。在中和HIV-1上，hLL2-(T20)₄和 h734-(T20)₄均令人惊讶地比cP4/D10-(T20)₄更高(图12D)。未缀合的 hLL2和hMN-14IgG不具有中和活性(图12A-D)。表9概述由图 12A-中所显示结果评估的EC50值。

表9.未缀合的T20、未缀合的抗体和缀合的DNL复合物的相对 效力

通过测定在SAHA(辛二酰替苯胺异羟肟酸)激活之后在30天的 时间段内在PBMC中针对HIV-1_IIIB的hLL2-(T20)₄的中和活性来研究 用于治疗潜伏受感染的细胞的DNL-T20复合物的潜在用途(图13)。 对于比较，cP4/D10、T20和hLL2也包括在研究中。获得的结果表明： 在30天的时间段内在添加SAHA的培养基中观察到通过p24 ELISA(图13A)或p24-阳性培养物(图13B)测定的HIV复制的大量和 持续增加，其几乎可被hLL2-(T20)₄、cP4/D10或T20完全抑制。在 第30天，如图13C所示，三种试剂分别降低p24-阳性培养物至小于 5％的培养基+SAHA对照。令人惊讶的是，hLL2也降低p24-阳性培 养物至约50％的培养基+SAHA对照。hLL2结合存在于成熟B细胞 的表面上的CD22抗原。

如下测定hLL2-(T20)₄的体内稳定性。向天然SCID小鼠(总计11 只)皮下注射hLL2-(T20)₄(100μg；500pmol)。分别由2、3、3和3只 小鼠中在0.5、6、24和72小时处收集血清样品，并保存在-70℃下直 至通过ELISA分析。以相同方式使用hLL2IgG(75μg；500pmol)来进 行平行研究。通过两种不同ELISA来检查使用hLL2-(T20)₄注射的小 鼠的血清样品，一种设计为仅定量完整hLL2-(T20)₄，而另一种定量 有或者没有连接T20的所有含有hLL2的种类。对于hLL2-(T20)₄的 量化，使用F(ab′)₂-特异性、山羊抗-人IgG以及经本身发育的小鼠抗 -DDD2mAb(5E3)探测的捕获抗体，随后为HRP-缀合的山羊-抗-小鼠 来涂覆平板。用于测定所有含有hLL2的种类，使用抗-人F(ab′)2来 涂覆平板，并使用大鼠抗-id mAb至hLL2(WN)、随后为HRP-缀合的 山羊抗-大鼠抗体探测捕获的抗体。将第二次分析也用于测定hLL2 的血清水平。在图14中显示的结果表明：因为通过两次分析测定的 血清浓度在6、24和72小时处可比较，所以hLL2-(T20)₄呈现出至少 3天的体内稳定。在72小时处hLL2-(T20)₄的生物利用率约为hLL2 的生物利用率的一半。

将具有广谱和有效HIV中和活性的抗体连续识别和工程化 (Burton和Weiss，Science2010；329：770-3)，并且它们中的一些可具有 在DNL构建体中使用的更优性能。也可将诸如抗-CD4的另外的抗体 和诸如下一代产品融合抑制剂的可选的HIV-抑制剂用作DNL缀合物 的组分。与在HIV的单一疗法中自身有效的未缀合的抗体共同施用 也可达到增强的功效。

靶向HIV糖类和糖蛋白的多个糖-表位的人源化和完整人mAb 有效地靶向在针对早期HIV-1感染的消极免疫中HIV-感染的细胞和 病毒粒子或者在HAART有效或失败下的HIV-1。通过在HIV病毒粒 子和/或受感染的细胞的跨膜区处插入分子自身可进一步辅助HIV-特 异性靶向。因此，本设计的DNL缀合物应当选择性靶向受感染的细 胞，而不靶向未受感染的细胞。

熟练技术人员意识到，使用上述技术可将其他抗体和/或HIV治 疗剂并入DNL构建体内。其他HIV治疗剂的例子包括但不限于： sCD4-D1-D2(West等人，2010，J Virol.84：261-69)；CP32M(He等人， PNAS2008；105：16332-7)；IZN17(Eckert和Kim，PNAS2001；98： 11187-92)；C34(Stoddart等人，J Biol Chem2008；283：34045-52)； T1144(Dwyer等人，PNAS2007；104：12772-7)；C52L(Deng等人， Biochemistry2007；46：4360-9)；CCR5拮抗剂，例如马拉韦罗(maraviroc) 或维克力韦罗(vicriviroc)；以及以下试剂，例如阿巴卡韦、氨多索韦、 AOP-RANTES、阿立他滨、阿扎那韦、贝韦立马、BMS-378806、胡 桐素A、CCR5、CD4、塞拉格尼、可比司他、抗病毒蓝藻蛋白-N、 地瑞那韦、二芳基嘧啶类化合物、去羟肌苷、德罗格韦、efavirenz、 埃替拉韦、艾夫他滨、emtricitabine、表没食子儿茶素没食子酸酯、 费替那韦、福沙那韦、膦甲酸、格瑞弗森、格鲁博南A、羟基脲、茚 地那韦、KP-146、拉米夫定、来非那韦、来司韦林、洛匹那韦、米替 福新、MK-2048、奈非那韦、奈韦拉平、拉西韦、雷特格韦、利托那 韦、沙奎那韦、塞利西利、司他夫定、司他匹定、双脱氧胸苷、T61、 T651、T1249、T2635、Tat拮抗剂、替诺福韦、替拉那韦、天花粉蛋 白、TRIM5α、韦瑞康、扎西他滨、齐多夫定或齐多夫定。可将这些 其他抗-HIV治疗剂附接或并入DNL复合物内，或者可选地将其在施 用DNL复合物之前、同时或之后向受试者共同施用。

可能使用的其他抗体包括：抗-CD4抗体，例如伊巴珠单抗 (ibalizumab)(Bruno和Jacobson，2010，J Antimicrob Chemother65： 1839-41)；抗-Leu3a、L120、OKT4A、13B8.2或L71；抗-CCR5抗体， 例如NBP1-43335、ab10397、2D7、HGS004、MC-1、MC-4、MC-5、 PA9、PA14或PRO140(参见，例如，Lopalco，2011，J Transl Med9：S4)； 或中和抗-HIV抗体，例如2G12(Armbruster等人，J.Antimicrob. Chemother.54：915-20，2004)、2F5(Bryson等人，Protein and Peptide  Letters，8：413-18，2001)、3D6(Ruker等人，Ann.NY Acad.Sci. 646：212-19，1991)、b12(例如，Wu等人，J Virol2006，80：2585)、 X5(Moulard等人，Proc Natl Acad Sci2002，99：6913-18)、C37(Cao等 人，DNA and Cell Biology，12：836-41，2004)、1ACY、1F58、 1GGGC(Berry等人，Proteins，45：281-82，2001)或4E10(Cardoso等人， 2005，Immunity22：163-73)。熟练技术人员意识到，使用本文所述的 方法可将包含任何抗体或其抗原结合片段的DNL复合物并入DNL 复合物内。

在可选的实施方案中，如以上实施例6中所述，使用PEG将诸 如T20的HIV治疗剂并入DNL构建体内以提供改善的药物代谢动力 学性质和降低的施用频率。

实施例8.聚乙二醇化抗-HIV试剂DNL复合物

如在以上实施例6，选自IMP362、IMP413和IMP457中所述制 备PEG-AD2部分。如在以上实施例7中所述制备T20-DDD2。由包 含附接两个T20部分的一个PEG部分的PEG-AD2和T20-DDD2形 成DNL复合物。聚乙二醇化T20DNL复合物显示与未缀合的T20 相比可比较的功效以及超过其血清半衰期更高的数量级，使得可每周 施用而不是每日施用。与未缀合的T20相比，观察到DNL复合物的 注射位点副反应的发生率降低。

实施例9.具有人源化抗-HIV抗体的DNL复合物

根据Leung等人(1995，Mol.Immunol.，32：1413)，通过使鼠CDR 序列附接人抗体构架区(FR)和恒定区序列，如在实施例7中所述制备 的嵌合的P4/D10抗体用于制备人源化P4/D10(hP4/D10)。使用如人源 化抗-CD22抗体依帕珠单抗的相同人IgG供体FR来构建人抗体FR 序列(Leung等人，Mol Immunol1995；32：1413-1427)。具体而言，选 择重链的人EU抗体的FR1、FR2和FR3以及人NEWM抗体的FR4 以及选择hP4/D10抗体的轻链的人REI抗体的FR。如在美国专利No. 7,151,164中所公开，将关键鼠残基保留在FR中以维持hP4/D10与 gp120的结合特异性和亲合力。

使用引物VK1BACK和VK1FOR来扩增MAb的Vκ序列(Orlandi 等人，1989)。使用引物对VH1BACK/VH1FOR来扩增V_H序列(Orlandi 等人，1989)。将含有10μl的第一链cDNA产物、10μl的10XPCR 缓冲剂[500mM KCl，100mM Tris-HCl(pH8.3)、15mM MgCl₂和 0.01％(w/v)明胶](Perkin Elmer Cetus，Norwalk，Conn.)、250μM的各 dNTP、200nM的引物以及5单位的Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer  Cetus)的PCR反应混合物进行30次PCR的循环。各PCR循环由在 94℃下变性1分钟、在50℃下退火1.5分钟以及在72℃下聚合1.5分 钟组成。将扩增的Vκ和V_H片段在2％琼脂糖(BioRad，Richmond，Calif.) 上纯化。通过联合如Leung等人(Mo1.Immunol.，32：1413(1995))所述 的长寡核苷酸模版合成和PCR扩增来构建人源化V基因。

将Vκ的PCR产物亚克隆至含有Ig启动子、信号肽序列和方便 限制性位点的基于pBR327的分级载体，VκpBR内以便于VκPCR产 物的框内接合。将V_H的PCR产物亚克隆至基于pBluescript的VHpBS 内。通过Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74：5463(1977))的方 法测序含有各PCR产物的单独的克隆物。

分别通过作为HindIII-BamHI片段的双重限制性消化从VKpBR 和VHpBS中切除含有Vκ和V_H序列以及启动子和信号肽序列的表达 盒。如通过Gilles等人(J.Immunol.Methods125：191(1989)中所述以 及也显示在Losman等人，Cancer，80：2660(1997))中，将Vκ和VH 表达盒组装在作为XbaI/BamHI和XhoI/BamHI片段切除的修饰分级 的载体VκpBR2和VHpBS2中，并将其亚克隆至单个表达载体pdHL2 内。将表达载体转染至Sp-EEE、Sp-ESF或Sp-ESF-X哺乳动物宿主 细胞内以用于表达和抗体产生。

如下由细胞培养基中分离抗体。使用HSFM使细胞作为在滚瓶 中500ml培养物生长。将培养物离心以及将上清液过滤通过0.2μl 膜。使过滤的培养基通过蛋白A柱。然后使用约10柱体积的PBS来 洗涤树脂，并由具有0.1M含有10mM EDTA的甘氨酸缓冲剂(pH3.5) 的柱洗脱蛋白A结合的抗体。将峰部分汇集，针对PBS透析，并使 用30浓缩器(Amicon，Beverly，Mass.)来浓缩抗体。

如以上实施例7中所述使纯化的hP4/D10附接AD2部分。使 CP32M融合抑制剂肽附接DDD2以及表达为如上实施例7所述的融 合蛋白。如在以上实施例7中734-T20DNL复合物所述制备包含附 接DDD2-CP32M的hP4/D10-AD2的DNL复合物。与734-T20DNL 复合物相比，hP4/D10-CP32M DNL复合物显示显著改善的功效和等 同的血清半衰期。

实施例10.用于DNL复合物形成的其他抗-HIV抗体的使用

2G12抗-HIV抗体购自Polymun Scientific(Vienna，Austria)。如以 上实施例7中所述制备AD2-2G12融合蛋白。如以上实施例7中所述 制备DDD2-T20。如以上实施例7中734-T20DNL复合物所述制备包 含附接DDD2-T20的2G12-AD2的DNL复合物。与734-T20DNL复 合物相比，2G12-T20DNL复合物显示显著改善的功效以及等同的血 清半衰期。

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鉴于本公开，在没有过度实验下可制备和实施本文所公开和所要 求保护的所有组合物和方法。尽管依据优选的实施方案已经描述组合 物和方法，对于本领域技术人员显然，在没有违背本发明的概念、精 神和范围下变化形式可应用于本文所述的组合物和方法以及方法的 步骤或者步骤的顺序中。更具体而言，化学和生理上相关的某些试剂 可替代本文所述的试剂，同时得到相同或相类似的结果。对本领域技 术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改均被认为在如所附权 利要求定义的本发明的精神、范围和概念内。