β-咔啉酰色氨酰色氨酰氨基酸苄酯、其合成、抗肿瘤作用及应用

摘要

本发明涉及β-咔啉酰色氨酰色氨酰氨基酸苄酯、其合成、抗肿瘤作用及应用，公开了通式I代表的15种化合物，式中AA选自Val、Ile、Gly、Pro、Leu、Ser、Tyr、Ala、Trp、Phe、Met、Asp、Lys、Glu和Thr残基。本发明进一步公开了它们的制备方法，本发还公开了它们的抗肿瘤作用和作为抗肿瘤剂的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及了通式I代表的15种化合物，式中AA选自Val、Ile、Gly、Pro、Leu、 Ser、Tyr、Ala、Trp、Phe、Met、Asp、Lys、Glu和Thr残基。本发明进一步涉及了它们的 制备方法，本发还涉及了它们的抗肿瘤作用和作为抗肿瘤剂的用途。本发明属于生物医药 领域。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁人类的健康。根据WHO公布的数据，2020年全世界癌症发病率将 增加50％，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。在抗癌药物的研究中，从生物体 中寻找天然的抗肿瘤活性成分成为寻找新的先导化合物的一个重要途径。全球应用的175 种抗癌药物中，有57％直接或间接来源于天然产物。

β-咔啉类生物碱衍生物是一类天然产物，近年来，其抗肿瘤活性引起人们的关注。发 明人在长期的研究中发现，β-咔啉-3-羧酸的抗肿瘤活性与其平面结构及1位，3位的取代 基团有关。在这些位置上引入适当的取代基能够产生高效低毒的化合物。

发明人在长期的研究中还发现，酰色氨酰色氨酰氨基酸苄酯(W-W-AA-OBzl)z在肿瘤细 胞模型和小鼠S180肉瘤模型上显示出确切的抗肿瘤活性，且未见毒副反应。根据这些认识， 发明人认识到把酰色氨酰色氨酰氨基酸苄酯连接到β-咔啉-3-羧酸上，可以产生抗肿瘤活性 强，毒性低的新型抗肿瘤化合物。于是发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供通式I代表的15种化合物，式中AA选自Val、Ile、Gly、 Pro、Leu、Ser、Tyr、Ala、Trp、Phe、Met、Asp、Lys、Glu和Thr残基。

本发明的第二个内容是提供通式I代表的15种化合物的制备方法，该方法包括以下步 骤：

(1)在二氯亚砜存在下，L-色氨酸和甲醇反应，生成L-色氨酸甲酯；

(2)在浓盐酸存在下，在甲醇中对异丙基苯甲醛和L-色氨酸甲酯缩合为1-(4-异丙基)- 苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯；

(3)在二氧化硒(SeO₂)存在下，1-(4-异丙基)-苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯在四 氢呋喃二氧六环中氧化为1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸甲酯；

(4)在NaOH存在下，1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸甲酯在二氧六环中皂化为1-(4- 异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸；

(5)在多聚磷酸的存在下，L-色氨酸和苯甲醇反应，生成L-色氨酸苄酯；

(6)在二环己基碳二亚胺(DCC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)存在下，Boc-Trp在无水THF 中与L-色氨酸苄酯缩合为Boc-Trp-Trp-OBzl；

(7)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中Boc-Trp-Trp-OBzl脱去Boc生成Trp-Trp-OBzl；

(8)在苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和HOBt存在下，1-(4-异丙 基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和Trp-Trp-OBzl在无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中缩合为1-(4-异丙 基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨苄酯；

(9)在NaOH存在下，在甲醇中将Boc-Trp-Trp-OBzl皂化为Boc-Trp-Trp；

(10)在DCC和HOBt存在下，Boc-Trp-Trp在无水THF中与L-氨基酸苄酯缩合为 Boc-Trp-Trp-AA-OBzl。

(11)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中Boc-Trp-Trp-AA-OBzl脱去Boc生成Trp-Trp-AA-OBzl；

(12)在HBTU和HOBt存在下，1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和Trp-Trp-AA-OBzl 在无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中缩合为1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酰 氨基酸苄酯。

本发明的第三个内容是评价通式I代表的15种化合物的体外和体内抗肿瘤活性。

本发明的第四个内容是观察通式I代表的15种化合物的致命性毒性和神经毒性。

附图说明

图1.合成路线.i)MeOH，SOCl₂；ii)浓HCl，甲醇，油浴75℃；iii)SeO₂，二氧六环，油浴 75℃；iv)NaOH，二氧六环；v)DCC，HOBt，NMM，THF；vi)氯化氢/乙酸乙酯溶液(4N)；vii) HBTU，HOBt，NMM，DMF；viii)NaOH，甲醇。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们 仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备L-色氨酸甲酯盐酸盐

在250mL茄形瓶中加入100mL甲醇，冰浴下，用恒压漏斗加2.8mLSOCl₂，干燥活 化半小时后，加入2.244g(11.0mmol)L-色氨酸于反应瓶中，常温反应24h，利用TLC监 测至原料斑点消失，停止反应，用水泵将反应液抽干，再加入30mL甲醇，摇匀后再抽干， 重复两次，再加入乙醚30mL，抽干乙醚，再重复两次，即得2.58g(92％)标题化合物，为 淡紫灰色固体。ESI-MS(m/e)：219[M+H]⁺。

实施例2制备1-(4-异丙基)-苯基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯(1a，1b)

称取2.54g(10.0mmol)L-色氨酸甲酯盐酸盐于100mL茄形瓶中，加入40mL甲醇溶 解，加入1.334g(9.O mmol)对异丙基苯甲醛，加适量浓盐酸调pH至2，在油浴75℃下反 应10h，利用TLC监测至原料斑点消失，停止反应降温后，在冰浴搅拌下缓慢滴加饱和 NaHCO₃，将反应液调pH值至7-8，将反应液减压浓缩至干后，残留物加适量乙酸乙酯溶 解，乙酸乙酯层依次用饱和NaHCO₃、饱和NaCl各洗三遍，然后用无水Na₂SO₄干燥，过 滤、减压浓缩至干，所得粗品经硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝8/1-3/1)，得到943mg 1a，660mg 1b，809mg 1a和1b的混合物(产率共77％)，为无色固体。ESI-MS(m/e)：349 [M+H]⁺。

实施例3制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸甲酯(2)

往100mL茄形瓶中加入930mg(2.67mmol)1a(或1b)，446mg SeO₂(4.0mmol)及30 mL二氧六环，油浴75℃下反应4h，利用TLC监测至原料斑点消失，停止反应降温后， 过滤、减压浓缩至干，得846mg(92％)标题化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e)：345[M+H]⁺。

实施例4制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸(3)

称取1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸甲酯840mg(2.44mmol)于100mL茄形瓶中， 用二氧六环溶解，加入NaOH(2N)溶液调pH至12，常温反应12h，利用TLC监测至原料 斑点消失，冰浴下用饱和KHSO₄调pH至7，减压浓缩，残留物加适量水，加饱和KHSO₄调pH至2，用适量乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用饱和NaCl洗三次，然后用无水Na₂SO₄ 干燥，过滤、滤液减压浓缩至干，得764mg(95％)标题化合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e)： 329[M-H]^-。

实施例5制备L-色氨酸苄酯

称取15.0g(44.4mmol)多聚磷酸于500mL茄形瓶中，加入80mL苯甲醇，使其在油 浴50℃中溶解，待溶液温度上升至75℃后，称取10g(49.0mmol)L-色氨酸加入其中， 75℃下反应48h，利用TLC监测至原料斑点消失，停止反应降温。在冰浴和搅拌下往反 应瓶中倒入400mL无水乙醚，此时有无色固体析出，搅拌过夜后将之过滤，无色固体用 200mL乙酸乙酯和10mL水悬浮，用三乙胺调溶液pH值至8左右，溶液变为澄清状，静 置分离。将分离的酯层依次用饱和NaHCO₃、饱和NaCl各洗三次，乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥，过滤、滤液减压浓缩至干，得12.76g(89％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)： 295[M+H]⁺。

实施例6制备Boc-Trp-Trp-OBzl

将3.344g(11.0mmol)Boc-Trp溶于20mL无水THF，冰浴下向溶液中加入1.633g(12.1 mmol)HOBt，并使完全溶解。冰浴下加入2.719g(13.2mmol)DCC。得到反应液I，搅拌 30分钟。冰浴下把2.94g(10.0mmol)Trp-OBzl悬浮于20mL无水THF中，然后加入1mL  N-甲基吗啉(NMM)，调pH 8-9。得到反应液II。冰浴下把反应液II加入反应液I中，先在 冰浴下搅拌1h，再在室温下搅拌4h，TLC(二氯/甲醇，15∶1)显示Trp-OBzl消失。滤除DCU， 滤液减压浓缩除去THF。残留物用50mL乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用饱和NaHCO₃水溶液洗、饱和NaCl水溶液洗、5％KHSO₄水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层 用无水Na₂SO₄干燥、过滤，滤液减压浓缩至干，所得粗品经硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸 乙酯＝8/1-3/1)，得到4.1g(71％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：581[M+H]⁺。

实施例7制备HCl·Trp-Trp-OBzl

将1.5g(2.59mmol)Boc-Trp-Trp-OBzl溶解在15mL 4M氯化氢-乙酸乙酯溶液中，冰 浴下搅拌2小时，TLC(二氯/甲醇，15/1)监测原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留 物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气，最后得1.3g(97％)标题化合物，为淡黄 色固体。ESI-MS(m/e)：481[M+H]⁺。

实施例8制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-甲酰色氨酰色氨酸苄酯(4)

将693mg(2.1mmol)1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸、270mg HOBt溶解于15mL无 水DMF中，冰浴下向溶液中加入833mg HBTU、1.034g(2.0mmol)HCl·Trp-Trp-OBzl，然 后加入1mL N-甲基吗啉(NMM)，调pH 8-9，室温搅拌反应5h，TLC(二氯甲烷/甲醇，50∶1) 监测原料点消失，停止反应。向反应液中加入适量水，用饱和NaHCO₃水溶液调pH至7， 用适量乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯层依次用饱和NaHCO₃溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。乙酸 乙酯层用无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得到的黄色固体经硅胶柱层析纯化 (石油醚/丙酮＝8/1-3/1粗纯化；二氯甲烷/甲醇＝100/1-80/1纯化)，得到334mg(21％)标题化 合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)793[M+H]⁺.Mp：124.4-125.3℃.(c＝0.60， CH₃OH).¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝9.04(s，1H)，8.74(s，2H)，8.14-8.11(d，J＝5.7Hz， 1H)，7.905(s，1H)，7.729(d，J＝7.8Hz，1H)，7.656(s，1H)，7.629(s，1H)，7.60-7.45(m，4H)， 7.37-7.28(m，3H)，7.24-7.18(m，4H)，7.11-6.80(m，7H)，6.166(s，1H)，5.23-5.17(m，1H)， 4.97-4.85(m，3H)，3.63-3.56(dd，J＝4.5Hz，J＝4.5Hz，1H)，3.30-3.00(m，4H)，1.39-1.35(d，J＝6.6 Hz，6H)。

实施例9制备Boc-Trp-Trp

将2.030g(3.50mmol)Boc-Trp-Trp-OBzl溶于20mL甲醇。冰浴下将溶液用NaOH(2N) 水溶液调pH 12并搅拌2h，TLC(二氯/甲醇，15∶1)显示Boc-Trp-Trp-OBzl消失。反应混合物 用稀盐酸(2N)调pH为7，减压浓缩除甲醇。残留物用稀盐酸(2N)调pH 2，用乙酸乙酯萃取 3次。合并的乙酸乙酯相用饱和NaCl水溶液洗至中性，无水Na₂SO₄干燥。过滤，滤液减 压浓缩至干，得1.529g(86％)标题化合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e)：507[M-H]^-。

实施例10制备Boc-Trp-Trp-L-Val-OBzl

按Boc-Trp-Trp-OBzl的制备方法由1.27g(2.5mmol)Boc-Trp-Trp和0.499g(2.40mmol) L-Val-OBzl得1.124g(69％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：681[M+H]⁺.

类似地以大致相同的收率制得Boc-Trp-Trp-L-ILe-OBzl、Boc-Trp-Trp-Gly-OBzl、 Boc-Trp-Trp-L-Pro-OBzl、Boc-Trp-Trp-L-Leu-OBzl、Boc-Trp-Trp-L-Ser-OBzl、 Boc-Trp-Trp-L-Tyr-OBzl、Boc-Trp-Trp-L-Ala-OBzl、Boc-Trp-Trp-L-Trp-OBzl、 Boc-Trp-Trp-L-Phe-OBzl、Boc-Trp-Trp-L-Met-OBzl、Boc-Trp-Trp-L-Asp-OBzl、 Boc-Trp-Trp-L-Lys-OBzl、Boc-Trp-Trp-L-Glu-OBzl和Boc-Trp-Trp-L-Thr-OBzl

实施例11制备Trp-Trp-L-Val-OBzl

按Trp-Trp-OBzl的制备方法由1g(1.47mmol)Boc-Trp-Trp-Val-OBzl得0.875g(97％)标 题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：581[M+H]⁺.

类似地以大致相同的收率制得Trp-Trp-L-ILe-OBzl、Trp-Trp-Gly-OBzl、 Trp-Trp-L-Pro-OBzl、Trp-Trp-L-Leu-OBzl、Trp-Trp-L-Ser-OBzl、Trp-Trp-L-Tyr-OBzl、 Trp-Trp-L-Ala-OBzl、Trp-Trp-L-Trp-OBzl、Trp-Trp-L-Phe-OBzl、Trp-Trp-L-Met-OBzl、 Trp-Trp-L-Asp-OBzl、Trp-Trp-L-Lys-OBzl、Trp-Trp-L-Glu-OBzl和Trp-Trp-L-Thr-Obzl

实施例12制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酰缬氨酸苄酯(5a)

按1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酸苄酯的制备方法由495mg(1.50 mmol)1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和863mg(1.40mmol)Trp-Trp-Val-OBzl得273mg (22％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)892[M+H]⁺.Mp 125-126℃.(c ＝0.20，CH₃OH).¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝8.952(s，1H)，8.705(s，1H)，8.43(d， J＝6.6Hz，1H)，8.16(d，J＝8.1Hz，1H)，7.70-7.47(m，8H)，7.43-7.23(m，6H)，7.11-6.88(m，6H)， 6.695(s，1H)，6.584(s，1H)，6.359(s，1H)，5.21-5.00(m，3H)，4.73-4.66(m，1H)，4.45-4.40(m， 1H)，3.62-3.52(dd，J＝3.9Hz，J＝3.9Hz，1H)，3.24-2.88(m，4H)，2.18-2.08(m，1H)，1.44-1.40(t， J＝5.7Hz，J＝6Hz，6H)，0.84-0.78(t，J＝7.2Hz，J＝7.2Hz，6H).

实施例13制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酰异亮氨酸苄酯(5b)

按1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酸苄酯的制备方法由694mg(2.1 mmol)1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和1.26g(2.0mmol)Trp-Trp-Ile-OBzl得389mg (22％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：906[M+H]⁺.Mp 123-124℃.(c ＝0.25，CH₃OH).¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝8.936(s，1H)，8.701(s，1H)，8.45(d， J＝8.1Hz，1H)，8.16(d，J＝7.8Hz，1H)，7.70-7.47(m，8H)，7.43-7.23(m，6H)，7.11-6.88(m，6H)， 6.707(s，1H)，6.57(d，J＝6.9Hz，1H)，6.353(s，1H)，5.23-5.00(m，3H)，4.73-4.66(m，1H)， 4.52-4.40(m，1H)，3.62-3.52(dd，J＝3.9Hz，J＝3.9Hz，1H)，3.25-2.88(m，4H)，1.90-1.75(m，2H)， 1.44-1.40(t，J＝5.7Hz，J＝6Hz，6H)，1.15-0.89(m，1H)，0.70-0.90(m，6H)。

实施例14制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酰甘氨酸苄酯(5c)

按1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酸苄酯的制备方法由694mg(2.1 mmol)1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和1.15g(2.0mmol)Trp-Trp-Gly-OBzl得435mg (25％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：850[M+H]⁺.Mp 129-131℃.(c ＝0.3，CH₃OH).¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝8.951(s，1H)，8.673(s，1H)，8.43-8.39(d， J＝6.9Hz，1H)，8.19-8.16(d，J＝7.8Hz，1H)，7.76-7.47(m，8H)，7.43-6.67(m，13H)，6，53-6.52(d， J＝2.4Hz，1H)，6.43-6.40(d，J＝7.2Hz，1H)，5.150(s，2H)，4.95-4.88(m，1H)，4.75-4.68(m，1H)， 4.15-4.06(dd，J＝6.3Hz，J＝6Hz，1H)，3.90-3.82(dd，J＝5.1Hz，J＝5.4Hz，1H)，3.56-3.47(m，1H)， 3.27-2.96(m，4H)，1.45-1.40(m，6H)。

实施例15制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酰脯氨酸苄酯(5d)

按1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酸苄酯的制备方法由694mg(2.1 mmol)1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和1.228g(2.0mmol)Trp-Trp-Pro-OBzl得440mg (25％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：890[M+H]⁺.Mp 137-138℃.(c ＝0.50，CH₃OH).¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝9.109(s，1H)，8.93-8.89(d，J＝8.4Hz， 1H)，8.691(s，1H)，8.12-8.08(d，J＝7.8Hz，1H)，7.875(s，1H)，7.74-7.45(m，6H)，7.45-6.90(m， 12H)，6.851(s，1H)，6.753(s，1H)，5.18-4.88(m，4H)，4.45-4.41(m，1H)，3.62-3.41(m，3H)， 3.28-2.93(m，4H)，2.13-2.00(m，1H)，1.90-1.81(m，3H)，1.45-1.40(m，6H)。

实施例16制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酰亮氨酸苄酯(5e)

按1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酸苄酯的制备方法由694mg(2.1 mmol)1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和1.26g(2.0mmol)Trp-Trp-Leu-OBzl得543mg (30％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)906[M+H]⁺.Mp 119-121℃.(c＝0.3，CH₃OH).¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝8.950(s，1H)，8.613(s，1H)，8.47-8.43 (d，J＝7.2Hz，1H)，8.15-8.12(d，J＝7.8Hz，1H)，7.70-7.45(m，8H)，7.45-7.15(m，6H)，7.10-6.95 (m，3H)，6.90-6.75(m，4H)，6.49-6.45(d，J＝7.5Hz，1H)，6.376(s，1H)，5.17-5.16(d，J＝2.1Hz， 2H)，5.0-4.9(m，1H)，4.78-4.67(m，1H)，4.62-4.50(m，1H)，3.62-3.51(m，1H)，3.3-3.15(m，3H)， 3.0-2.9(dd，J＝5.4Hz，J＝5.4Hz，1H)，1.65-1.55(m，2H)，1.50-1.40(m，7H)，0.92-0.80(dd，J＝6.3 Hz，J＝6.3Hz，1H)。

实施例17制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酰丝氨酸苄酯(5f)

按1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酸苄酯的制备方法由694mg(2.1 mmol)1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和1.208mg(2.0mmol)Trp-Trp-Ser-OBzl得348mg (20％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：881[M+H]⁺.Mp 136-137℃.(c ＝0.35，CH₃OH).¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝9.026(s，1H)，8.62-8.58(d，J＝5.7Hz， 1H)，8.382(s，1H)，8.14-8.08(d，J＝7.8Hz，1H)，8.015(s，1H)，7.78-7.50(m，8H)，7.45-7.15(m， 6H)，7.05-6.95(m，2H)，6.907(s，1H)，6.72-6.57(m，3H)，6.40-6.28(m，2H)，5.201(s，2H)， 4.80-4.70(m，1H)，4.65-4.55(m，1H)，4.12-3.97(m，2H)，3.72-3.65(m，1H)，3.55-3.42(m，3H)， 3.30-2.93(m，2H)，2.85-2.75(dd，J＝5.4Hz，J＝5.4Hz，1H)，1.48-1.38(m，6H)。

实施例18制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酰酪氨酸苄酯(5g)

按1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酸苄酯的制备方法由694mg(2.1 mmol)1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和1.36g(2.0mmo1)Trp-Trp-Tyr-OBzl得346mg (18％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：956[M+H]⁺.Mp 139-140℃.(c ＝0.50，CH₃OH).¹H NMR(300MHz，DMSO)：δ/ppm＝8.863(s，1H)，8.777(s，1H)，8.54-8.48 (s，1H)，8.17-8.13(d，J＝7.8Hz，1H)，7.67-6.80(m，20H)，6.78-6.60(m，4H)，6.66-6.33(m，2H)， 6.189(s，1H)，5.20-5.10(m，2H)，4.985(m，1H)，4.85-4.70(m，1H)，4.70-4.50(m，1H)， 3.53-3.40(m，1H)，3.20-2.70(m，6H)，1.45-1.30(m，6H).

实施例19制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酰丙氨酸苄酯(5h)

按1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酸苄酯的制备方法由694mg(2.1 mmol)1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和1.176g(2.0mmol)Trp-Trp-Ala-OBzl得355mg (20％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)886[M+H]⁺.Mp 136-137℃；(c ＝0.35，CH₃OH).¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝8.921(s，1H)，8.663(s，1H)，8.49-8.45 (d，J＝7.5Hz，1H)，8.19-8.14(d，J＝8.1Hz，1H)，7.67-7.48(m，8H)，7.45-7.20(m，6H)， 7.10-6.85(m，6H)，6.730(s，1H)，6.51-6.46(d，J＝6.9Hz，1H)，6.373(s，1H)，5.25-5.10(m，2H)， 5.07-4.96(s，1H)，4.71-4.63(m，1H)，4.56-4.45(m，1H)，3.60-3.47(m，1H)，3.26-2.90(m，4H)， 1.45-1.35(m，6H)，1.34-1.29(m，3H).

实施例20制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酰色氨酸苄酯(5i)

按1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酸苄酯的制备方法由694mg(2.1 mmol)1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和1.406g(2.0mmol)Trp-Trp-Trp-OBzl得482mg (24％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：979[M+H]⁺.Mp 133-134℃.(c ＝0.30，CH₃OH).¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝8.856(s，2H)，8.693(s，1H)，8.525(s， 1H)，8.21-8.15(d，J＝7.8Hz，1H)，7.77-7.50(m，5H)，7.50-6.70(m，19H)，6.633(s，1H)，6.451(s， 1H)，6.311(s，1H)，6.188(s，1H)，5.098(s，2H)，5.00-4.90(m，1H)，4.90-4.80(m，1H)，4.75-4.60 (m，1H)，3.55-3.40(m，1H)，3.30-2.90(m，6H)，1.45-1.30(t，J＝5.7Hz，J＝6.0Hz，6H).

实施例21制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酰苯丙氨酸苄酯(5j)

按1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酸苄酯的制备方法由694mg(2.1 mmol)1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和1.328g(2.0mmol)Trp-Trp-Phe-OBzl得406mg (22％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：940[M+H]⁺.Mp 124-126℃.(c ＝0.75，CH₃OH).¹H NMR(300MHz，DMSO)：δ/ppm＝9.043(s，1H)，8.754(s，1H)，8.564(s， 1H)，8.20-8.13(d，J＝7.8Hz，1H)，7.75-7.42(m，8H)，7.40-7.18(m，6H)，7.18-6.80(m，11H)， 6.706(s，1H)，6.368(s，1H)，6.268(s，1H)，5.20-4.95(m，3H)，4.85-4.75(m，1H)，4.71-4.60(m， 1H)，3.60-3.50(m，1H)，3.30-2.90(m，6H)，1.45-1.35(m，6H)。

实施例22制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酰甲硫氨酸苄酯(5k)

按1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酸苄酯的制备方法由694mg(2.1 mmol)1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和1.296g(2.0mmol)Trp-Trp-Met-OBzl得346mg (19％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：923[M+H]⁺.Mp 118-119℃. (c＝0.35，CH₃OH).¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝8.970(s，1H)，8.546(s，2H)，8.24-8.18 (d，J＝7.8Hz，1H)，7.873(s，2H)，7.80-7.65(m，3H)，7.65-7.50(m，4H)，7.45-7.20(m，7H)， 7.10-6.90(m，3H)，6.687(s，3H)，6.412(s，2H)，5.24-5.10(m，2H)，4.90-4.80(m，1H)，4.80-4.69 (m，1H)，4.69-4.59(m，1H)，3.65-3.55(m，1H)，3.33-3.08(m，3H)，2.85-2.75(dd，J＝5.1Hz，J＝5.1 Hz，1H)，1.50-1.40(m，6H).

实施例23制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酰天冬氨酸双苄酯(5l)

按1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酸苄酯的制备方法由694mg(2.1 mmol)1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和1.444g(2.0mmol)Trp-Trp-Asp(OBzl)-OBzl得 401mg(20％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：998[M+H]⁺.Mp 121-122℃.(c＝0.65，CH₃OH).¹H NMR(300MHz，DMSO)：δ/ppm＝8.918(s，1H)，8.725(s，1H)， 8.57-8.50(d，J＝7.5Hz，1H)，8.19-8.15(d，J＝7.8Hz，1H)，7.78-7.63(m，4H)，7.63-7.45(m，4H)， 7.45-7.20(m，12H)，7.10-7.00(m，2H)，7.00-6.80(m，4H)，6.355(s，2H)，5.18-4.90(m，5H)， 4.90-4.75(m，1H)，4.75-4.60(m，1H)，3.60-3.50(dd，J＝3.9Hz，J＝3.6Hz，1H)，3.30-3.02(m，3H)， 3.02-2.91(m，1H)，2.91-2.82(m，2H)，1.47-1.30(m，6H).

实施例24制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酰-N-Z-赖氨酸苄酯 (5m)

按1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酸苄酯的制备方法由694mg(2.1 mmol)1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和1.557g(2.0mmol)Trp-Trp-Lys(Z)-OBzl得422 mg(20％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1056[M+H]⁺.Mp：118-119℃.(c＝0.40，CH₃OH).¹H NMR(300MHz，DMSO)：δ/ppm＝9.031(s，1H)，8.510(s，2H)， 8.12-7.90(m，3H)，7.80-7.49(m，7H)，7.45-6.80(m，15H)，6.80-6.55(m，3H)，6.50-6.37(m，2H)， 5.25-5.10(m，2H)，5.042(s，2H)，4.92-4.80(m，1H)，4.78-4.65(m，1H)，4.60-4.45(m，1H)， 3.62-3.51(d，J＝3.9Hz，J＝3.6Hz，1H)，3.30-2.75(m，6H)，2.00-1.50(m，3H)，1.50-1.35(m，6H)， 1.10-0.90(m，3H).

实施例25制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酰谷氨酸双苄酯(5n)

按1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酸苄酯的制备方法由694mg(2.1 mmol)1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和1.471g(2.0mmol)Trp-Trp-Glu(OBzl)-OBzl得 367mg(18％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：1013[M+H]⁺.Mp 106-107℃. (c＝1.25，CH₃OH).¹H NMR(300MHz，DMSO)：δ/ppm＝8.905(s，1H)，8.534(s， 2H)，8.27-8.20(d，J＝7.8Hz，1H)，8.002(s，1H)，7.83-7.70(m，3H)，7.67-7.50(m，4H)， 7.45-7.16(m，11H)，7.16-6.87(m，4H)，6.70-6.50(m，3H)，6.442(s，1H)，6.40-6.30(d，J＝7.2Hz， 1H)，5.165(s，2H)，5.045(s，2H)，4.90-4.78(m，1H)，4.78-4.70(m，1H)，4.65-4.50(m，1H)， 3.65-3.50(dd，J＝3.0Hz，J＝3.0Hz，1H)，3.32-3.02(m，3H)，2.85-2.75(dd，J＝5.4Hz，J＝4.2Hz， 1H)，2.20-1.95(m，4H)，1.50-1.40(d，J＝6.3Hz，6H).

实施例26制备1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酰苏氨酸苄酯(5o)

按1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸酰色氨酰色氨酸苄酯的制备方法由694mg(2.1 mmol)1-(4-异丙基)-苯基-β-咔啉-3-羧酸和1.471g(2.0mmol)Trp-Trp-Thr-OBzl得112mg (13％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)：894[M+H]⁺.Mp 129-130℃.(c＝0.35，CH₃OH).¹H NMR(300MHz，DMSO)：δ/ppm＝8.997(s，1H)，8.559(s，1H)，8.354(s， 1H)，8.099(s，1H)，8.076(s，1H)，7.83-7.65(m，3H)，7.65-7.50(m，3H)，7.50-7.15(m，7H)， 7.05-6.90(m，2H)，6.739(s，1H)，6.57-6.30(m，5H)，5.197(s，2H)，4.90-4.78(m，1H)，4.78-4.65 (m，1H)，4.65-4.50(m，1H)，4.351(s，2H)，3.65-3.50(dd，J＝4.2Hz，J＝4.5Hz，1H)，3.35-3.10 (m，3H)，2.83-2.73(dd，J＝3.6Hz，J＝3.6Hz，1H)，1.50-1.40(d，J＝6.9Hz，6H)，0.95-0.85(m，3H).

实验例1化合物5a-o的抗肿瘤细胞增殖活性评价

本发明的化合物5a-o均用含0.5％DMSO的1640培养基配制成所需浓度。K562和HL60 肿瘤细胞均购自美国标准菌种收藏所(ATCC)。RPMI-1640培养基干粉购自Gibco公司。每 升PBS缓冲液含有8.2g NaCl，0.2g KCl，1.56g Na₂HPO₄·H₂O和0.2g KH₂PO₄，pH值7.4。胎牛 血清购自Hyclone公司，0.25％胰酶溶液购自Hyclone公司，青霉素和链霉素购自solarbio公 司。四噻唑蓝(MTT)购自solarbio公司，溶于PBS溶液中，制成5mg/mL的溶液，过滤除菌 后使用，避光保存。阿霉素(ADR)购自北京华丰联合技术有限公司，二甲基亚枫(DMSO) 购自Hyclone公司。

癌细胞HL-60选用RPMI-1640培养基，K562选用DMEM培养基。培养液中均含10％ 灭火的胎牛血清和1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素。

分别将生长状态良好，处于对数生长期的K562和HL60细胞按照4×10⁴个/mL的密度 接种于96孔板，每孔100μL。细胞按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物5a-o的含 0.5％DMSO的1640培养基配制成的所需浓度的溶液，每孔25μL，对照孔加入等体积的 RPMI-1640，平行6孔。37℃下96孔板置于5％CO₂培养箱中培养48小时。之后每孔 加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续培养4小时。离心3分钟(3000rpm/min)。 小心吸出上清液，每孔加入100μL DMSO溶解紫色残留物(甲瓒)，平板振荡10分钟使沉淀 全部溶解，于570nm酶标仪上测定O.D.值(吸光度)，波长570nm。

按照公式“相对生存率＝(D含药-D空白)/(D对照-D空白)×100％”计算每一个样 品浓度下的样品对肿瘤细胞的抑制率。

实验平行重复3次，以抑制率对化合物浓度作图，计算本发明化合物5a-o的IC₅₀(半 数有效抑制浓度)值。实验结果列入表1。IC₅₀值表明发明的化合物5a-o对HL60和K562 没有明显的细胞毒性。

表15a-o的体外抗肿瘤活性(IC₅₀±SDμM)

实验例25a-o的体内抗肿瘤活性

无菌条件下抽取接种7天后生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1∶3)的 液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法 计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按细胞浓度＝(4大方格内活细胞数/4)× 10⁴稀释倍数＝细胞数/mL和细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％计算 细胞浓度和细胞存活率。

ICR雄性小鼠(清洁级，体重为20±2g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)， 每12只小鼠一组。将S180活细胞存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成1.5×10⁷个/mL的细 胞悬液，于ICR雄性小鼠腋皮下接种(0.2mL/只)，造成荷S180实体瘤小鼠并接受治疗。化合 物3，4和5a-o加少量吐温80助溶后逐渐加生理盐水至所需浓度。化合物5a-o均按1μmol/kg剂 量口服给药，化合物4按10μmol/kg剂量口服给药，化合物3按100μmol/kg剂量口服给药。 它们均每天口服给药一次，连续给药7天。阳性对照为阿霉素加入生理盐水至所需浓度。它 的给药剂量均为2μmol/kg，每天腹腔注射1次。连续给药7天。空白对照为等体积生理盐水。 治疗至第8天，称小鼠体重，脱颈椎处死小鼠，并剖取各组小鼠的肿瘤及各主要脏器称重， 最后统计各组药物的抑瘤率。实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示，计算如下：瘤重抑制率 ％＝(1-给药组瘤重/空白组瘤重)×100％。脾指数＝脾重(mg)/处死体重(g)。本实验 数据统计均采用t检验和方差分析。

实验结果列入表2。

实验观察到，在低于2μmol/kg剂量下，阿霉素不显示抗肿瘤作用。在2μmol/kg剂量下， 阿霉素虽然显示抗肿瘤作用，但是在治疗的第四天小鼠即开始死亡，第五天没有小鼠存活， 显示致命性毒性。在存活的4-5天内，小鼠显示躁动和不安等神经毒性症状。相反，1μmol/kg 剂量下5a-m，o都显示优秀的抗肿瘤作用。其中1个化合物的活性与阿霉素没有显著性差异， 也就是说这个化合物的抗肿瘤活性是阿霉素的2倍。其中1个化合物的活性与阿霉素有显著 性差异，也就是说这个化合物的抗肿瘤活性比阿霉素强2倍以上。在治疗的8天内，5a-o既 没有引起任何小鼠死亡，即没有致命性毒性，也没有引起小鼠出现躁动和不安等神经毒性 症状。因而在在致命性毒性和神经毒性方面，5a-o比阿霉素低很多。

表25a-o对S180荷瘤小鼠瘤重的影响

n＝12；a)与生理盐水组比P＜0.01；b)与生理盐水组比P＜0.05；c)与与生理盐水组比p＜0.01；d)与生理 盐水及阿霉素组比p＜0.01.

实验例3化合物5i体内抗肿瘤活性的量效关系

按照试验例2的方法，化合物5i选取高、中、低三个剂量，即1μmol/kg、0.1μmol/kg和 0.01μmol/kg三个剂量考察化合物的剂量效应依赖关系。结果列入表3。治疗小鼠的肿瘤重 表明，5i的抗肿瘤作用显示剂量效应依赖关系。

表3.不同剂量5i对荷S180小鼠肿瘤重量影响

n＝12；a)与生理盐水组、0.1μmol/kg 5i组及0.01μmol/kg 5i组比P＜0.01；b)与生理盐水组及0.01 μmol/kg 5i组比P＜0.01；c)与与生理盐水组比P＜0.01.