一种常温保存克氏原螯虾各组织蛋白质组学用蛋白样品的方法

摘要

本发明公布了一种常温保存克氏原螯虾各组织蛋白质组学用蛋白样品的方法，包括以下步骤：（1）称取克氏原螯虾新鲜组织放入预冷的研钵中剪碎，再用液氮充分研磨成粉末状，转移到15mL离心管中；（2）采用三氯乙酸/丙酮沉淀法提取蛋白收集沉淀；（3）用含0.02g/mL的CHAPS、10μL/mL的PMSF的浓度为9mol/L尿素溶解步骤（2）制得的沉淀，离心收集上清；（4）向步骤（3）获得的上清中加入10%（v/v）的甘油和10%（v/v）乙腈，调节pH至7.5-8.0，常温保存。本发明方法可以使克氏原螯虾蛋白样品可以在常温保存两周以上，在-20℃保存一年；不仅操作便捷，而且保真度高，不影响后续的液相色谱分离以及质谱分析等实验。

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白样品的保存方法，具体涉及一种常温保存克氏原螯虾各组织蛋白质组学用蛋白样品的方法。

背景技术

1994年澳大利亚麦考瑞大学的Wilkins和Williams等第一次提出了蛋白质组（proteome）这个概念，该英文词汇由蛋白质的“prote”和基因组的“ome”拼接而成，并且最初定义为“一个基因组所表达的蛋白质”。之后伴随着聚丙烯酰胺双向凝胶电泳（2-DE）技术的不断改进和完善，蛋白质组学研究手段已经广泛应用到药物靶点、差异蛋白筛选等研究中。

蛋白质组学研究的分析方法通常有三个步骤：1，运用蛋白质分离技术分离样品中的蛋白质；2，应用质谱技术或N末端测序鉴定分离到的蛋白质；3，应用生物信息学技术存储、筛选、分析获得的数据。其中，蛋白质样品制备是关键的一步。目前应用于总蛋白提取的实验方法很多，最常用的有TCA/丙酮沉淀法、酚抽法等。由于双向电泳实验是以样品中胶条中所分布的蛋白斑点的深浅位置作为蛋白含量差异的判断依据，蛋白样品的质量好坏直接影响到双向电泳的结果，因此该实验要求样品具备较好的重复性。在以往的经验中，能否尽量完整地保存多的蛋白质，以至于能否很好的重现实验结果，对于实验结果的可信度和可论证性都有着非常重要的意义。

一般来说，蛋白质容易降解，利用冻干粉可以较好地保留蛋白活性，但是经过冻干、分装、溶解等步骤所获得的蛋白折损率较高；而利用有机溶剂沉淀蛋白的方法会很大程度的破坏蛋白三维结构，甚至造成肽键断裂，使其产生非自身代谢的小肽段而对实验结果造成人为偏差。不仅如此，不同的生物组织（如原核细胞、真菌、动植物等）的总蛋白构成存在很大的区别，这就要求实验者对不同的物种不同组织不同细胞的某部分蛋白提取和保存采用有针对性的技术方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种常温保存克氏原螯虾各组织蛋白质组学用蛋白样品的方法，该保存方法不仅方便快捷，容易操作，而且可以使克氏原螯虾蛋白样品在常温下保存两周以上，在-20℃以下可以保存一年，按本发明方法保存的蛋白样品不影响后续的液相色谱分离以及质谱分析等，保真度高。

本发明为实现上述目的，采用如下技术方案：

一种常温保存克氏原螯虾各组织蛋白质组学用蛋白样品的方法，包括以下步骤：

（1）        称取克氏原螯虾新鲜组织放入预冷的研钵中剪碎，再用液氮充分研磨成粉末状，转移到15 mL离心管中；

（2）        采用三氯乙酸/丙酮沉淀法提取蛋白收集沉淀；

（3）        用含0.02 g/mL的CHAPS、10 μL/mL的PMSF 的浓度为9mol/L尿素溶解步骤（2）制得的沉淀，离心收集上清；

（4）        向步骤（3）获得的上清中加入10%（v/v）的甘油和10%（v/v）乙腈，调节pH至7.5-8.0，常温保存。

本发明方法可以使克氏原螯虾蛋白样品在常温下保存两周以上，在-20℃以下可以保存一年。

在采用经典的三氯乙酸/丙酮沉淀法提取蛋白沉淀之后，本发明采用高浓度的尿素溶液（9 mol/L）在水溶液中断裂氢键，使蛋白质发生不同程度的变性，还可以通过增大疏水氨基酸残基在水相中的溶解度，降低疏水相互作用，从而达到溶解蛋白质的目的。在针对克氏原螯虾的组织蛋白提取过程中，本发明经过4-10 mol/L浓度梯度的摸索实验后，认为9 mol/L的尿素浓度能最大限度得溶解并保留克氏原螯虾组织蛋白。同时加入CHAPS活性剂助溶；PMSF抑制蛋白酶的活性，防止蛋白降解。

本发明在溶解蛋白中加入乙腈，与水溶液任意比例互溶，并且在一定幅度内降低溶液温度，有助于蛋白保存，是良好的有机溶剂。同时乙腈也多用于液相色谱分离、液质联用分析技术中，是常用的流动相组分。因此有助于在整个蛋白质组学实验过程中发挥稳定的缓冲保护作用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：使用本发明方法可以使克氏原螯虾蛋白样品可以在常温保存两周以上，在-20℃保存一年；不仅操作便捷，而且保真度高，不影响后续的液相色谱分离以及质谱分析等实验。

附图说明

图1为新鲜制备的克氏原螯虾卵巢组织发育期总蛋白样品的双向电泳图谱。

图2为利用本发明保存的克氏原螯虾卵巢组织发育期总蛋白样品的双向电泳图谱。

具体实施方式

本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。应理解，以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何形式限制本发明的范围。

实施例一：

1、  克氏原螯虾卵巢组织发育期总蛋白样品的制备

1）称取发育期克氏原螯虾新鲜卵巢组织500 mg，先放入预冷的研钵中剪碎，再用液氮充分研磨成粉末状，转移到15 mL离心管中；

2）向步骤1）离心管中加入5倍体积预冷的丙酮溶液A（其中含有0.02 mmol/L的二硫苏糖醇、终浓度为20%的三氯乙酸），充分混匀，于-20℃放置2 h，低温高速离心，收集沉淀；

3）向步骤2）沉淀中加入2 mL 预冷的丙酮溶液B（其中含有0.02 mmol/L 的二硫苏糖醇），充分混匀，于-20℃放置2 h，低温高速离心，收集沉淀。采用预冷的丙酮溶液B重复清洗沉淀一次，于-20℃低温静置挥发残留丙酮4 h以上；

4）向步骤3）中制得的蛋白沉淀中加入600 μL的样品裂解液（其中含有8 mol/L尿素、0.02 g/mL的CHAPS、10 μL/mL的PMSF、体积百分含量为0.5%的IPG缓冲液、0.002 g/mL的溴酚蓝），室温下充分裂解2 h。

5）将步骤4）中蛋白混合液于4℃、12000 r/min 离心 30 min，收集上清液。此上清液即为适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品。

2、蛋白样品的保存

1）用9 mol/L尿素（含0.02 g/mL的CHAPS、10 μL/mL的PMSF）溶解上述制得的沉淀，离心收集上清。

2）向步骤（1）获得的上清中加入10%（v/v）的甘油和10%（v/v）乙腈，调节pH至7.5-8.0，常温保存14天。

3、双向电泳对比检测

1）按照《双向电泳操作手册》进行水化上样和等电聚焦。在Immobiline干胶条再泡胀盘中加入含100 μg蛋白的样品液，将IPG干胶条（7 cm，pH 3-10）水平放入其中，加入少量IPG覆盖液，水化过夜。水化过夜后的胶条转移到Ettan IPGphor胶条槽中，进行等电聚焦。等电聚焦程序设置为：①Step，300 V×2 h；②Gradient，1000 V×0.5 h；③Gradient，5000 V×1.5 h；④Step，5000 V，2500 vh。

2）等电聚焦结束后，采用两步平衡法进行平衡，先将IPG胶条放入3 mL平衡液Ⅰ（平衡液Ⅰ配方：尿素72.07 g，SDS 4.0 g，1.5 M Tris-HCl 6.7 mL（pH 8.8），甘油69 mL，1 %溴酚蓝贮存液400 μL，加入双蒸水至200 mL，使用前每10 mL加入DTT 100 mg）中，在水平摇床上平衡15 min；再使用平衡液Ⅱ（平衡液Ⅱ配方：尿素72.07 g，SDS 4.0 g，1.5 M Tris-HCl 6.7 mL（pH 8.8），甘油69 mL，1 %溴酚蓝贮存液400 μL，加入双蒸水至200 mL，使用前每10 mL加入IAA 250 mg）进行第二步平衡，在摇床上平衡15 min。

3）平衡后进行第二向SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为12.5%（10 cm × 7 cm × l mm）。将平衡后的IPG胶条转移到已聚合的聚丙烯酰胺凝胶胶面顶端，排除胶条与胶面之间的气泡。以恒流方式进行电泳：先10 mA电泳10 min，然后电流调至20 mA。当溴酚蓝指示剂迁移到凝胶底部时，关闭电源，结束电泳。

4）采用考马斯亮蓝染色法对凝胶进行染色。

5）利用捷达JD-801凝胶电泳图像分析系统对脱色后的双向电泳凝胶进行扫描、拍照。

双向电泳结果如图1、图2所示，对比结果表明采用本发明方法保存的克氏原螯虾卵巢组织蛋白质组学用蛋白样品在常温下14天后，所获得的双向电泳图谱与新鲜组织蛋白样品相比，蛋白斑点覆盖性好，分辨率较高，蛋白降解程度不大，重复性较好，说明本发明方法对于保存克氏原螯虾组织总蛋白切实有效。

实施例二：

1、  克氏原螯虾成虾肝胰腺总蛋白样品的制备

1）称取发育期克氏原螯虾新鲜肝胰腺组织500 mg，先放入预冷的研钵中剪碎，再用液氮充分研磨成粉末状，转移到15 mL离心管中；

2）向步骤1）离心管中加入5倍体积预冷的丙酮溶液A（其中含有0.02 mmol/L的二硫苏糖醇、终浓度为20%的三氯乙酸），充分混匀，于-20℃放置2 h，低温高速离心，收集沉淀；

3）向步骤2）沉淀中加入2 mL 预冷的丙酮溶液B（其中含有0.02 mmol/L 的二硫苏糖醇），充分混匀，于-20℃放置2 h，低温高速离心，收集沉淀。采用预冷的丙酮溶液B重复清洗沉淀一次，于-20℃低温静置挥发残留丙酮4 h以上；

4）向步骤3）中制得的蛋白沉淀中加入600 μL的样品裂解液（其中含有8 mol/L尿素、0.02 g/mL的CHAPS、10 μL/mL的PMSF、体积百分含量为0.5%的IPG缓冲液、0.002 g/mL的溴酚蓝），室温下充分裂解2 h。

5）将步骤4）中蛋白混合液于4℃、12000 r/min 离心 30 min，收集上清液。此上清液即为适合双向电泳的克氏原螯虾肝胰腺总蛋白样品。

2、蛋白样品的保存

1）用9 mol/L尿素（含0.02 g/mL的CHAPS、10 μL/mL的PMSF）溶解上述制得的沉淀，离心收集上清。

2）向步骤（1）获得的上清中加入10%（v/v）的甘油和10%（v/v）乙腈，调节pH至7.5-8.0，常温保存14天。

3、双向电泳对比检测

1）按照《双向电泳操作手册》进行水化上样和等电聚焦，同上。

2）等电聚焦结束后，采用两步平衡法进行平衡，同上。

3）平衡后进行第二向SDS-PAGE电泳。

4）采用考马斯亮蓝染色法对凝胶进行染色。

5）利用捷达JD-801凝胶电泳图像分析系统对脱色后的双向电泳凝胶进行扫描、拍照。

双向电泳结果表明，采用本发明方法保存的克氏原螯虾肝胰腺蛋白质组学用蛋白样品在常温下14天后，分辨率高，重复性好。是一种比较有效便捷的样品保存方法。