根际有益细菌促进党参种子萌发的方法

摘要

本发明涉及一种采用根际有益细菌促进党参子种子萌发的处理方法。本发明利用根际促生微生物枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)一种菌株菌液浸泡党参种子，显著提高了党参种子发芽势和发芽率，从而提高党参种子活力和出苗率，克服了生产上党参种子小，发芽势和发芽率低，出苗不整齐的问题，以减少党参补苗及反复发芽造成的人力、物力等经济损失。同时，枯草芽孢杆菌具有对人畜无毒无害、不污染环境、非致病性和抗逆性强等特点，能够产生多种生长激素类物质和丰富的抗菌物质，促进植物生长，改善植株生长发育。本发明种子处理方法简单，可广泛应用于党参的栽培，具有重要的社会、经济和生态经济价值。

说明书

技术领域

本发明属于微生物学和植物生理学领域，涉及利用根际有益细菌枯草芽孢杆菌GB03菌株提高党参种子发芽势和发芽率，从而促进党参种子萌发的方法，保证种子播种后田间出苗健壮、整体一致。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有对人畜无毒无害、不污染环境、非致病性和抗逆性强等特点，它能够产生多种生长激素类物质和丰富的抗菌物质，促进植物生长，改善植株生长发育，增加植物对盐胁迫等逆境的抵御能力，从而提高植物的抗病性。

近年来，党参在治疗冠心病、高血脂症、低血压病等面取得了新的进展，使其用量速增(马雪梅和吴朝峰 2009)，但因党参种子小，寿命短，直播育苗时发芽率低，栽培时播种量大，成本高，达不到生产要求。据调查，国内每年党参的需求量远远超过生产，从党参作为商品在市场上交易以来，党参的生产和销售就经常出现大起大落的现象，价格波动也很大。目前，全国党参野生资源蕴藏量约为1.58万吨，但是资源分散、产量呈现逐年下降的趋势，所能提供的商品数量极其有限，党参市场供求矛盾极为突出(刘德军等2001)。从中药党参资源调查结果表明，目前市场上的党参主产于山西、甘肃、陕西、四川和湖北等省，主要为栽培品，少量为野生，甘肃除了原产地外，近几十年大面积发展党参种植，同时扩大了素花党参的生产规模，成为中药党参最大的产区(张向东等2013)。

目前，随着中药现代化的实施以及中国在世界经济中的地位越来越高，中药材的生产和出口均稳步的增长，据估计2007年我国党参的出口已经超过了0.3万吨，作为中药制药原料，党参的用量也显著增长。近年来，党参的市场价格多次抬升，而且由于全国党参总产量明显下降，使其价格大幅度上调。党参药材供不应求已经成为中药生产中的一大难题，因此，改善党参生产土壤质量，调控活性成分及代谢产物积累，提高党参质量已经成为中药材种植业的首选，也是党参生产中亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种根际有益细菌促进党参种子萌发的方法。是利用根际有益细菌枯草芽孢杆菌GB03促进党参种子的萌发，该方法操作简单，成本低，高效，无毒并对环境友好无害。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种根际有益细菌促进党参种子萌发的方法，其主要特点在于步骤为：

（1）党参种子消毒处理：籽粒饱满无缺损、均匀一致的党参种子，用75%的酒精浸泡8-10s后，使用5%次氯酸钠浸泡10-12min，用灭菌的蒸馏水冲洗7-8次，于2-4℃冰箱过夜；

（2）枯草芽孢杆菌GB03菌液制备：先配制溶菌肉汤LB液体培养基：按照氯化钠、胰蛋白胨和酵母粉的比例为1:2:1配制，溶剂为蒸馏水；调pH到7.2，高温为115-132℃灭菌,待冷却温度为20-35℃后，每100mL的LB液体培养基加入50-100μL的枯草芽孢杆菌GB03菌液，在转速为180-250r/min下，温度为25-30℃的恒温培养摇床上培养过夜后，测定菌液浓度为OD₆₀₀为0.8-1.0时，取出备用；

（3）种子菌液处理：将步骤（1）处理完成种子浸泡于枯草芽孢杆菌GB03菌液中5min-20min，然后将菌液倒出，处理完成的种子进行播种。

本发明的有益效果：本发明可显著提高党参种子发芽势和发芽率，从而提高党参种子活力和出苗率，保持较整齐的发芽率，克服了生产上党参种子小，发芽势和发芽率低，出苗不整齐的问题，以减少生产上党参补苗及反复发芽造成的人力、物力等经济损失。同时，枯草芽孢杆菌具有对人畜无毒无害、不污染环境、非致病性和抗逆性强等特点，能够产生多种生长激素类物质和丰富的抗菌物质，促进植物生长，改善植株生长发育。本发明种子处理方法简单，可广泛应用于党参的栽培，具有重要的社会、经济和生态经济价值。

附图说明

图1：萌发3天后党参种子发芽情况比较。图中四个小图分别表示对照、有益细菌菌液浸泡党参种子5分钟、10分钟和20分钟；

图2：萌发3天后党参种子萌发幼苗根系发育情况比较。左上图为有益细菌菌液浸泡党参种子5分钟，左右图为对照；下图为放大的党参萌发种子；

图3：GB03菌液浸泡对党参种子发芽势的影响。图中四个柱子分别表示对照、有益细菌菌液浸泡党参种子5分钟、10分钟和20分钟的党参种子发芽势；

图4：GB03菌液浸泡对党参种子发芽率的影响。图中四个柱子分别表示对照、有益细菌菌液浸泡党参种子5分钟、10分钟和20分钟的党参种子发芽率。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。

实施例1：一种根际有益细菌促进党参种子萌发的方法，其主要特点在于步骤为：

（1）党参种子消毒处理：籽粒饱满无缺损、均匀一致的党参种子，用75%的酒精浸泡8s后，使用5%次氯酸钠浸泡10min，用灭菌的蒸馏水冲洗7-8次，于4℃冰箱过夜；

（2）枯草芽孢杆菌GB03菌液制备：

先配制LB液体培养基：按照氯化钠5g/L、胰蛋白胨10g/L和酵母粉5g/L的比例配制，用标准型pH计(PB-10，北京赛多利斯)调pH到6.8，使用立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50KBS，上海申安)高温118-125℃灭菌待冷却后，每100mL的LB液体培养基加入50μL的GB03菌液，在转速为180r/min下，温度为28℃的恒温培养摇床(THZ-300，上海一恒科技)上培养过夜后，使用核酸检测仪(NanoDrop 1000，德国)测定菌液浓度为OD600＝0.9时取出备用，菌液为现配现用。

（3）种子菌液处理：将步骤（1）处理完成种子浸泡于枯草芽孢杆菌GB03菌液中5min，然后将菌液倒出，处理完成的种子进行播种。

实施例2：一种根际有益细菌促进党参种子萌发的方法，其主要特点在于步骤为：

（1）党参种子消毒处理：籽粒饱满无缺损、均匀一致的党参种子，用75%的酒精浸泡9s后，使用5%次氯酸钠浸泡11min，用灭菌的蒸馏水冲洗7-8次，于2℃冰箱过夜；

（2）枯草芽孢杆菌GB03菌液制备：

先配制溶菌肉汤LB液体培养基：按照氯化钠、胰蛋白胨和酵母粉的比例为1:2:1配制，溶剂为蒸馏水；调pH到7.2，高温为115-118℃灭菌,待冷却温度为20℃后，每100mL的LB液体培养基加入80μL的枯草芽孢杆菌GB03菌液，在转速为180-250r/min下，温度为25℃的恒温培养摇床上培养过夜后，测定菌液浓度为OD₆₀₀为0.8-1.0时，取出备用。

（3）种子菌液处理：将步骤（1）处理完成种子浸泡于枯草芽孢杆菌GB03菌液中10min，然后将菌液倒出，处理完成的种子进行播种。

实施例3：一种根际有益细菌促进党参种子萌发的方法，其主要特点在于步骤为：

（1）党参种子消毒处理：籽粒饱满无缺损、均匀一致的党参种子，用75%的酒精浸泡10s后，使用5%次氯酸钠浸泡12min，用灭菌的蒸馏水冲洗7-8次，于4℃冰箱过夜；

（2）枯草芽孢杆菌GB03菌液制备：

先配制溶菌肉汤LB液体培养基：按照氯化钠、胰蛋白胨和酵母粉的比例为1:2:1配制，溶剂为蒸馏水；调pH到7.2，高温为125-132℃灭菌,待冷却温度为35℃后，每100mL的LB液体培养基加入100μL的枯草芽孢杆菌GB03菌液，在转速为180-250r/min下，温度为30℃的恒温培养摇床上培养过夜后，测定菌液浓度为OD₆₀₀为0.8-1.0时，取出备用；

（3）种子菌液处理：将步骤（1）处理完成种子浸泡于枯草芽孢杆菌GB03菌液中20min，然后将菌液倒出，处理完成的种子进行播种。

实验例：根际有益细菌促进党参种子萌发的方法

1 材料与方法

1.1 材料

党参种子于2011年10月采自甘肃岷县中药材技术指导站药园，经甘肃中医学院王引权教授鉴定为桔梗科党参属植物党参Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.，种子保存于实验室4℃冰箱。枯草芽孢杆菌GB03菌株由美国德克萨斯州理工大学Paul W.Paré教授实验室提供，保存于-80℃冰箱。75%酒精、次氯酸钠、氯化钠均为标准试剂。酵母粉、胰蛋白胨和琼脂粉为英国进口试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 种子处理

挑选籽粒饱满无缺损、均匀一致的党参种子，于超净工作台用75%的酒精、5%次氯酸钠中分别浸泡10s和10min后，用灭菌的蒸馏水冲洗7-8次，于4℃冰箱过夜。

1.2.2 枯草芽胞杆菌GB03菌液的制备

配制LB液体培养基：按照氯化钠5g/L、胰蛋白胨10g/L和酵母粉5g/L的比例配制，用标准型pH计(PB-10，北京赛多利斯)调pH到7.2，使用立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50KBS，上海申安)高温灭菌待冷却后，每100mL的LB液体培养基加入100μL的GB03菌液，在转速为180r/min下，温度为28℃的恒温培养摇床(THZ-300，上海一恒科技)上培养过夜后，使用核酸蛋白检测仪（NanoDrop 1000，德国）测定菌液浓度为OD₆₀₀＝0.9时取出备用，菌液为现配现用。

1.2.3 菌液浸泡种子萌发的实验

在灭菌的离心管中加入培养好的GB03菌液，然后将消毒好的党参种子浸泡在菌液中(无菌水作对照)，计时5min、10min和20min后，迅速取出种子，平铺在已灭菌铺有两层滤纸的培养皿中，铺种之前，在滤纸上滴入等量无菌水，至滤纸表面形成水膜为止，取出的种子均匀的铺在滤纸上，每皿100粒，置于25℃黑暗条件培养，每天统计观察发芽情况，培养10d后统计发芽率，计算发芽势。

1.3 数据处理及统计分析方法

实验中以胚根突破种皮，露白视为萌发，每天观察党参种子并记录当天萌发的种子数量，发芽率(GP)＝(Gt/T)×100%，式中Gt为发芽终了全部发芽的种子数，T为种子的总数；发芽势是指在种子发芽过程中日发芽种子数达到最高峰时，党参发芽势确定为发芽第3d，发芽的种子数占供测样品种子数的百分率。发芽势是判断田间出苗率的指标(杨晓杰等2003;赵兰枝等2004)。每处理设置至少6个重复，图表中的数值为平均值±SE；采用Excel 2003和SPSS 13.0分别进行数据处理和统计分析，用One-wayANOVA检验各处理间差异的显著水平。

2 结果与分析

发芽势是衡量种子萌发能力的重要标准，发芽势高的种子，生命力强，在大田的播种发芽率较高，播种后幼苗出土正常。由图1可以看出，萌发实验第3天枯草芽孢杆菌菌株GB03菌液侵泡5min、10min和20min后的党参种子萌发数量较多；从图2可以看出侵泡5分钟的党参萌发种子胚根上根毛明显多于对照。由图3可以看出，GB03菌液浸泡党参种子5min、10min和20min后，较对照均显著(P<0.05)提高了党参种子发芽势，提高幅度分别为2.1倍、1.9倍和1.5倍，其中5min效果最佳，对发芽势的提高能力最强。从图4可以看出，GB03菌液浸泡党参种子5min、10min和20min后，较对照对党参种子的发芽率均有提高，其中5min、10min浸泡提高党参种子发芽率8.0%和2.0%，20min显著(P<0.05)提高发芽率11.6%(P<0.05)。本实验结果表明，菌液浸泡党参种子5min对种子萌发的促进效果最佳，尤其是对发芽势的提高最为显著。

3 讨论

发芽势为发芽初期比较集中的发芽率，它决定着出苗的整齐程度，发芽势高，则出苗整齐，苗生长一致，反之，苗参差不齐，在发芽率相同时，发芽势高的种子生命力强，在场地的播种发芽率较高，播种后幼苗出土正常，所以，发芽势是计算播种量的因子之一。

本研究结果发现，枯草芽孢杆菌菌液GB03浸泡显著提高了党参种子发芽势，从而提高了党参种子活力。

综上所述，枯草芽孢杆菌菌株GB03菌液浸泡显著提高了党参种子发芽势，对发芽势的促进作用较发芽率更为明显，从而提高了党参种子活力和出苗率，保持较整齐的发芽率，克服了生产上党参种子小，发芽率低的问题，从而减少生产上党参补苗及反复发芽造成的人力等经济损失。研究GB03对种子萌发的调控，可以更好为其在实际生产中的应用提供理论依据与技术指导。

4 小结

(1)枯草芽孢杆菌GB03菌液浸泡党参种子5min、10min和20min后，较对照均显著(P<0.05)的提高了党参种子的发芽势，提高幅度分别为211.8%、192.5%和145.8%，其中5min效果最佳。

(2)枯草芽孢杆菌GB03菌液浸泡党参种子5min、10min和20min后，较对照对党参种子的发芽率均有提高，其中5min、10min浸泡提高党参种子发芽率为8.0%和2.0%，20min显著(P<0.05)提高了发芽率为11.6%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。