一种纳塔栎体细胞胚胎发生的方法

摘要

本发明公开了一种纳塔栎体细胞胚胎发生的方法，包括选材、消毒处理、试管芽苗诱导培养、体胚诱导、增殖培养、成熟培养、体胚的萌发一系列操作；在体胚诱导、增殖、成熟、萌发培养的培养基中进行培养。本发明具有繁殖系数高，繁殖时间不受季节限制，取材对母体伤害小，无病虫害困扰，能够保持原植株优良性状，在纳塔栎苗木生产及科研中均具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及纳塔栎的组织培养方法，具体的说是纳塔栎的体细胞胚胎发生方法。

背景技术

纳塔栎（Quercus nuttalli）为壳斗科栎属落叶乔木，主干直立，大枝平展略有下垂，塔状树冠。叶椭圆，长10~20cm，宽5~13cm，正面深绿色，背面暗绿色，有丛生毛，秋叶亮红色或红棕色。树皮灰色或棕色，光滑。纳塔栎原产美国，分布区从美国德州东部到佛罗里达西部，包括阿肯色，密苏里，俄克拉何马和田纳西的南部。引种实践表明，纳塔栎生长速度快，五年生平均树高可达5m，十年生胸径15~20cm。每年11月初叶色开始变红，第二年2月落叶，冠形优美，叶色红艳，是良好的速生观赏树种。

但纳塔栎开花结实迟、较难建立种子园、结实量大小年现象明显、扦插生根困难、嫁接繁殖存在不亲和现象，因此大规模生产纳塔栎种苗十分困难。特别对于经过优选的树姿挺秀、叶色亮红的优良单株，急需新型繁殖技术，满足市场的潜在需求。

体细胞胚胎发生及其再生技术是20世纪90年代形成的林业繁育技术的重要内容之一，已经成为许多树种大规模繁殖的有效手段。体细胞胚胎，由体细胞发育而来，进而再生为完整植株。体细胞胚胎发生途径优点明显：繁殖系数高，操作可重复，遗传相对稳定。特别是近年来，随着其技术体系的逐渐成熟，已成为改良栎树生长速率和抗病性的可靠途径，是优良基因型的最佳繁殖系统，而且在种质创新中具有很大的应用潜力。

发明内容

发明目的：建立纳塔栎体胚发生技术体系，实现纳塔栎优选单株规模化高效生产。

技术方案：本发明提供了一种纳塔栎体细胞胚胎的发生方法，包括以下步骤：

（1）选材：9年生纳塔栎优选单株当年生萌条为材料，将其剪成约4 cm的带芽小段；

（2）对采集到的茎段进行消毒处理；

（3）芽苗诱导培养：将步骤（2）中的茎段用剪刀去除头尾氧化变黑部分，分清形态学上、下端，剪成长1.5~3cm 的Y 字型，下端切口呈斜型，竖直接种于芽诱导培养基中，培养15~20d后分化长成试管芽苗； 

（4）体胚诱导：将芽诱导产生的嫩叶接种到体胚诱导培养基中，在培养温度为(25±2) ℃，光照强度为 1 600~2 500 lx的培养室中培养30d后体胚诱导率为97%。

（5）增殖培养：将步骤（4）中诱导产生的体胚，转接于含有增殖培养基的玻璃培养瓶中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1600~2500lx，光照时间为16h/d，温度为(25±2)℃，20~25d后体胚迅速增殖呈白色或黄色透明状颗粒。

（6）成熟培养：将步骤（5）中增殖获得的体胚，转接于成熟培养基中，在光照强度为1600~2500lx，光照时间16h/d，温度为(25±2)℃的培养条件下，进行成熟培养，50天后成熟率在80%；

（7）体胚的萌发：将步骤（6）中获得的成熟体胚接种于萌发培养基中，在光照强度为1600~2500lx，光照时间16h/d，温度为(25±2)℃的培养条件下，进行萌发培养60d。

进一步，所述步骤(2)中的消毒处理过程包括：将采集的嫩梢去除2/3叶片后修剪成约4cm 长的带腋芽茎段，洗涤剂浸泡30 min，流水冲洗10次，蒸馏水清洗外植体后，用无菌水冲洗 3~4次，置于无菌烧杯中，在超净工作台内用 70%的酒精浸泡30s，无菌水冲洗 2~3 次，再用0.1%升汞溶液消毒3 min，最后用无菌水冲洗6次；

进一步，所述步骤(3)中芽诱导培养基的配方为：WPM基本培养基+0.05mg.L^-16-BA+ 0.05mg.L^-1NAA+30g.L^-1蔗糖+6.5 g.L^-1卡拉胶，培养基pH值控制在5.7~5.8。

进一步，所述步骤(4)中体胚诱导培养基配方为：MS基本培养基+0.16 mg. L^-16-BA+0.3mg. L^-1NAA+0.1 mg. L^-12,4-D+30g.L^-1蔗糖+6.5 g.L^-1卡拉胶； pH值控制在5.7-5.8。

进一步，所述步骤(5)中的增殖培养基配方为：MS基本培养基+2.0 mg. L^-16-BA+0.02 mg. L^-1NAA+30g.L^-1蔗糖+6.5 g.L^-1卡拉胶； pH值控制在5.7~5.8。

进一步，所述步骤(6)的成熟培养基配方为：MS基本培养基+50g.L^-1蔗糖+6.5 g.L^-1卡拉胶； pH值控制在5.7~5.8。

进一步，所述步骤(7)中的萌发培养基配方为：MS基本培养基+10 g. L^-1山梨醇+30g.L^-1蔗糖+6.5 g.L^-1卡拉胶，所述萌发培养基的pH值为5.7~5.8。

进一步，所述WPM基本培养基即木本植物组织培养基的具体配方如下：

硝酸铵NH4NO3             400 mg/L

 硝酸钙 Ca(NO₃)₂·4H₂O       556 mg/L

氯化钙CaCl₂·2H₂O           96 mg/L

硫酸镁MgSO₄·7H₂O          370 mg/L

磷酸二氢钾 KH₂PO₄              170 mg/L

硫酸钾K₂SO4                990 mg/L

乙二胺四乙酸二钠Na₂·EDTA   37.3 mg/L

硫酸亚铁FeSO₄·7H₂O         27.8 mg/L

硫酸锰MnSO₄·H₂O           22.3 mg/L

硫酸锌ZnSO₄·7H₂O           8.6 mg/L

硼酸H₃BO₃                          6.2 mg/L

钼酸钠Na₂MoO₄·2H₂O        0.25 mg/L

硫酸铜CuSO₄·5H₂O          0.025 mg/L

氯化钴 CoCl₂.6 H₂O                   0.025 mg/L

肌醇C₆H₁₂O₆·2H₂O           100 mg/L

甘氨酸  NH_2·CH₂·COOH      2 mg/L

盐酸硫胺素C₁₂H₁₇ClOS·2HCl   1 mg/L

盐酸吡哆醇C₈H₁₀NO₅P         0.5 mg/L

烟酸NC₅H₄COOH            0.5 mg/L。

所述MS基本培养基的具体配方如下：

硝酸钾KNO3    　　　1900 mg/L

硝酸铵NH4NO3      　1650 mg/L

磷酸二氢KH2PO4   　170 mg/L

硫酸镁MgSO4.7H2O     370 mg/L

氯化钙CaCl2.2H2O 　　440 mg/L

碘化钾KI   　　　　　0.83 mg/L

硼酸H3BO3     　　　　6.2 mg/L

硫酸锰 MnSO4.4H2O   22.3 mg/L

硫酸锌　ZnSO4.7 H2O        8.6 mg/L

钼酸钠 Na2MoO4.2 H2O     0.25 mg/L

硫酸铜　CuSO4.5 H2O 　   0.025 mg/L

氯化钴 CoCl2.6 H2O    　　　0.025 mg/L

乙二胺四乙酸二钠 Na2.EDTA   37.3 mg/L

硫酸亚铁FeSO24.7H2O       27.8 mg/L

肌醇     　　　　　　　　　100 mg/L

甘氨酸        　　　　　　　2 mg/L

盐酸硫胺素VB1     　　　　0.1 mg/L

盐酸吡哆醇　VB6 　　　   0.5 mg/L

烟酸VPP     　　　　　　　0.5 mg/L。

有益效果：本发明相对于现有技术而言具有以下优点：

1. 以无菌瓶苗叶片作为外植体进行体胚诱导，克服了离体培养外植体取材受季节限制的缺点。

2. 本发明建立的再生体系，通过各个生长阶段植株生长需求不同调配适当的培养基，所得体胚诱导率为97%，与其它无性繁殖相比较（从1~2年幼树上采嫩枝进行夏插，成活率为20%左右；以1年生麻栎做砧木，春季枝接活率为12~15%），繁殖系数大大增加。

3.本发明建立的再生体系，植株发育正常，稳定保存了新叶亮红的优良性状。

本发明提供的繁殖方法很大程度上提高了纳塔栎的再生效率和繁殖系数，为产业化快速繁殖纳塔栎优选单株提供了一种新方法。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。

以下实例所用的基本培养基的配方如下：

芽诱导基本培养基为WPM培养基，其中，常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硝酸铵（NH₄NO₃）400 mg/L、硝酸钙（Ca(NO₃)₂·4H₂O）556 mg/L、氯化钙（CaCl₂·2H₂O）96 mg/L、硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）370 mg/L、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）170 mg/L、硫酸钾（K₂SO₄）990 mg/L；

微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硫酸锰（MnSO₄·H₂O ）22.3 mg/L、硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）8.6 mg/L、硼酸（H₃BO₃）6.2 mg/L、钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）0.25 mg/L、硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）0.025 mg/L、硫酸铜（CuSO_4·5H₂O）0.025 mg/L、氯化钴 （CoCl₂.6₂ ）0.025 mg/L；

铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠（Na₂·EDTA）37.3 mg/L、硫酸亚铁（FeSO₄·7H₂O）27.8 mg/L；

有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100 mg/L、甘氨酸（Gly）2 mg/L、盐酸硫胺素（VB₁）1 mg/L、盐酸吡哆醇（VB₆）0.5 mg/L、烟酸（VPP）0.5 mg/L。

体胚诱导、增殖、成熟、萌发培养的基本培养基为MS培养基，其中，常量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硝酸铵（NH₄NO₃）1650 mg/L、硝酸钾（KNO₃）1900 mg/L、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）170 mg/L、硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）370 mg/L、氯化钙（CaCl₂·2H₂O）440 mg/L；

微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：碘化钾（KI） 0.83 mg/L，硫酸锰（MnSO₄·H₂O）22.3 mg/L、硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）8.6 mg/L、硼酸（H₃BO₃）6.2 mg/L、钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）0.25 mg/L、硫酸铜（CuSO_4·5H₂O）0.025 mg/L、氯化钴 （CoCl₂.6₂ ）0.025 mg/L；

铁盐的组分和其对应的使用浓度如下：乙二胺四乙酸二钠（Na₂·EDTA）37.3 mg/L、硫酸亚铁（FeSO₄·7H₂O）27.8 mg/L；

有机成分的组分和其对应的浓度如下：肌醇100 mg/L、甘氨酸（Gly）2 mg/L、盐酸硫胺素（VB₁）1 mg/L、盐酸吡哆醇（VB₆）0.5 mg/L、烟酸（VPP）0.5 mg/L。

一种纳塔栎体细胞胚胎的发生方法，包括以下步骤：

（1）选材： 2012 年 4~5 月，以江苏省林科院自主选育的纳塔栎为研究材料(树龄9年，胸径12cm，具有春季新叶鲜红，秋季叶色亮红，树形优美等优良性状) ，采集当年生萌条，将其剪成约4~6 cm的带芽小段进行芽的诱导，30d后取芽诱导获得的嫩叶作为外植体进行体胚诱导；

（2）消毒处理：将采集的萌条去除2/3叶片后，洗涤剂浸泡30 min，流水冲洗10次，蒸馏水清洗外植体后，用无菌水冲洗 3~4次，置于无菌烧杯中，在超净工作台内用 70%的酒精浸泡30s，无菌水冲洗 2~3 次，再用0.1%升汞溶液消毒3分钟，最后用无菌水冲洗6次；

（3）试管芽苗诱导培养：在超净的工作台上及无菌条件下，将步骤（2）中消毒后的外植体用剪刀去除茎段头尾氧化变黑部分，分清形态学上、下端，将茎段剪成长约2cm 的Y 字型，下端切口呈斜型，竖直接种于芽诱导培养基中。然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，其中光照强度为1600-2500lx，每日光照时间为16小时，温度为(25±2)℃，培养20天，分化长成试管芽苗；

（4）体胚诱导：将芽诱导后产生的嫩叶接种到体胚诱导培养基中，在培养温度为(25±2) ℃，光照强度为 1 600~2 500 lx的培养室中培养30d后体胚诱导率为97%。

（5）增殖培养：将步骤（4）中诱导产生的体胚，在超净的工作台上及无菌条件下，转接于增殖培养基中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1600~2500lx，光照时间为16h/d，温度为(25±2)℃的条件下培养25d，体胚迅速增殖呈白色或黄色透明状颗粒。

（6）成熟培养：将步骤（5）中增殖获得的体胚，转接于成熟培养基的培养瓶中，在光照强度为1600~2500lx，每日光照时间为16小时，温度为(25±2)℃的条件下，进行成熟培养，50天后成熟率在80%；

（7）体胚的萌发：将步骤（6）中获得的成熟体胚接种于萌发培养基中，在光照强度为1600~2500lx，光照时间为16h/d，温度为(25±2)℃的条件下，进行萌发培养60天。

实施例1：

本实施例中所选用的各个阶段的培养基配方如下：

（1）芽诱导培养基的配方为：WPM基本培养基，附加0.05mg.L^-16-BA、  0.06mg.L^-1NAA、40g.L^-1蔗糖、7.0 g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.7； 

（2）体胚诱导培养基配方为：MS基本培养基，附加0.20 mg. L^-16-BA、0.2mg. L^-1NAA、0.08mg. L^-12,4-D、25g.L^-1蔗糖、6.5g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.7。

（3）体胚增殖培养基配方为：MS基本培养基，附加2.0 mg. L^-16-BA、0.01 mg. L^-1NAA、25g.L^-1蔗糖、6.5g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.7。

（4）体胚成熟培养基配方为：MS基本培养基，附加60g.L^-1蔗糖、6.5 g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.7。

（5）体胚萌发培养基配方为：MS培养基，附加12 g. L^-1山梨醇、20g.L^-1蔗糖、6.5 g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.7 

实施例2：

本实施例中所选用的各个阶段的培养基配方如下：

（1）芽诱导培养基的配方为：WPM基本培养基，附加0.08mg.L^-16-BA、  0.05mg.L^-1NAA、25g.L^-1蔗糖、6.5 g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.7； 

（2）体胚诱导培养基配方为：MS基本培养基，附加0.16mg. L^-16-BA、0.2~0.3mg. L^-1NAA、0.12 mg. L^-12,4-D、40g.L^-1蔗糖、7.0g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.7。

（3）体胚增殖培养基配方为：MS基本培养基，附加1.8 mg. L^-16-BA、0.03 mg. L^-1NAA、40g.L^-1蔗糖、7.0 g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.7。

（4）体胚成熟培养基配方为：MS基本培养基，附加40g.L^-1蔗糖、7.0 g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.7。

（5）体胚萌发培养基配方为：MS培养基，附加8 g. L^-1山梨醇、30g.L^-1蔗糖、7.0 g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.7。 

实施例3：

本实施例中所选用的各个阶段的培养基配方如下：

（1）芽诱导培养基的配方为：WPM基本培养基，附加0.06mg.L^-16-BA、  0.05mg.L^-1NAA、30g.L^-1蔗糖、6.8 g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.8； 

（2）体胚诱导培养基配方为：MS基本培养基，附加0.18 mg. L^-16-BA、0.25mg. L^-1NAA、0.1 mg. L^-12,4-D、30g.L^-1蔗糖、6.8g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.8。

（3）体胚增殖培养基配方为：MS基本培养基，附加1.9 mg. L^-16-BA、0.02 mg. L^-1NAA、32g.L^-1蔗糖、6.8 g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.8。

（4）体胚成熟培养基配方为：MS基本培养基，附加45g.L^-1蔗糖、6.8g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.8。

（5）体胚萌发培养基配方为：MS培养基，附加10g. L^-1山梨醇、28g.L^-1蔗糖、6.8g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.8 。

实施例4：

本实施例中所选用的各个阶段的培养基配方如下：

（1）芽诱导培养基的配方为：WPM基本培养基，附加0.07mg.L^-16-BA、  0.06mg.L^-1NAA、38g.L^-1蔗糖、6.5 g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.8； 

（2）体胚诱导培养基配方为：MS基本培养基，附加0.19 mg. L^-16-BA、0.28mg. L^-1NAA、0.09 mg. L^-12,4-D、35g.L^-1蔗糖、6.6g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.8。

（3）体胚增殖培养基配方为：MS基本培养基，附加1.8~2.0 mg. L^-16-BA、0.03 mg. L^-1NAA、28g.L^-1蔗糖、6.9g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.8。

（4）体胚成熟培养基配方为：MS基本培养基，附加48g.L^-1蔗糖、6.9 g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.8。

（5）体胚萌发培养基配方为：MS培养基，附加11 g. L^-1山梨醇、22g.L^-1蔗糖、6.6 g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.8 。

以下是本发明与传统方法性能对比表：

本实施例建立的再生体系，体胚诱导率为96%~98%，与其它无性繁殖相比较，比如：从1~2年幼树上采嫩枝进行夏插，成活率为20%左右；以1年生麻栎做砧木，春季枝接活率为12~15%，繁殖系数大大增加。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。