一种用于大麦小孢子培养愈伤组织诱导的培养基

摘要

本发明提供一种用于大麦小孢子培养愈伤组织诱导的培养基，所述诱导培养基依据N

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，涉及谷类作物小孢子的诱导培养基改良， 以此获取大量愈伤组织及加倍单倍体(DH)再生植株的方法。

背景技术

植物细胞具有全能性，即每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而 具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成 一个新的个体。植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础。植物的小孢子是 一种处于特殊发育时期的细胞，具有单倍体、单细胞的特性，因而小孢子培养 系统可用于细胞脱分化再分化机理的研究、构建加倍单倍体(DH)作图群体、突 变体筛选、单倍体原生质体培养及融合以及单倍体的转基因受体。在杂交育种 中，对杂种后代的选择是重要的一环，由于杂种后代遗传组成高度杂合，性状 不断分离，往往要经过4-5次田间选择才能得到性状稳定的重组型材料，耗费 大量的人力物力。利用小孢子培养方法诱导可以产生100%单倍体植株，通过 染色体加倍，在1个世代中即可获得能正常结实的、纯合的二倍体植株，等位 基因不会在以后的世代中由于分离而丢失，可以避免杂种后代的严重分离，从 而加速性状重组过程，缩短育种年限，使各种性状得以表现出来，极大地提高 选择效率。小孢子培养的愈伤组织产量及质量决定了再生绿苗的数量，所以， 诱导培养基的优劣在很大程度上决定了小孢子培养方法的有效性。到目前为 止，谷类作物小孢子培养的效果较差，其中，愈伤组织诱导率较低是主要的限 制因子。因此，研发提高小孢子培养愈伤组织诱导率的方法，对于建立高效的 谷类作物小孢子培养体系具有至关重要的作用。

发明内容

本发明针对小孢子培养中基因型的限制和愈伤组织产量低的不足，提供一 种愈伤组织诱导培养基。

本发明以现有的N₆培养基为基础。N₆培养基是禾谷类作物细胞和组织培 养的常用诱导培养基，氮素是培养基中最重要的成分。常规的N₆培养基的成 分基本如下表1所示，不同厂商或文献所记载的不同成分的浓度或许有些许差 别，但其功能都大致相同：

表1：N₆培养基的配方（单位：mg/L）：

N₆大量元素：   (NH₄)₂SO₄463 KNO₃2830 CaCl₂·2H₂O 166 MgSO₄·7H₂O 185 KH₂PO₄400 N₆微量元素：   H₃BO₃1.6 KI 0.83 MnSO₄·4H₂O 4.4 ZnSO₄·7H₂O 1.5 N₆铁盐：   Na₂EDTA 37.3 FeSO₄·7H₂O 27.8 N₆有机元素：   盐酸硫胺素 1.0 盐酸吡多辛 0.5 甘氨酸 2.0 烟酸 0.5

本发明人通过大量的研究发现，通过改变诱导培养基中氮素的用量可以极 大地影响大麦小孢子愈伤组织或胚状体的产量及质量，即影响随后的绿苗分化 数量。具体而言，将N₆培养基中KNO₃的含量从2830mg/L下降至0-2500mg/L、 (NH₄)SO₄的含量从463.0mg/L下降至0-400mg/L，并添加水解干酪素（CH）和 谷氨酰胺（Glu）各400-2500mg/L，用该培养基诱导的愈伤组织产量是原N₆培养基的1.3-9.0倍，再生绿苗的数量是原N₆培养基的1.1-8.6倍。

因此，本申请提供一种改造的N₆诱导培养基，该诱导培养基以表1所示 的N₆培养基为基础，所不同的是含有0-2500mg/L的KNO₃和0-400mg/L的 (NH₄)SO₄，并添加有400-2500mg/L的水解干酪素和400-2500mg/L的谷氨酰胺。

在一个具体实施例中，KNO₃的浓度为0-2200mg/L。

在一个具体实施例中，KNO₃的浓度为700-2200mg/L。

在一个具体实施例中，KNO₃的浓度为707.5mg/L或1415mg/L或 2122.3mg/L，

在一个具体实施例中，(NH₄)SO₄的浓度为0-350mg/L。

在一个具体实施例中，(NH₄)SO₄的浓度为110-240mg/L，更优选110-160 mg/L。

在一个具体所示中，(NH₄)SO₄的浓度为115.8mg/L或231.5mg/L。

在一个具体实施例中，本发明的诱导培养基还添加有500-2500mg/L的水 解干酪素和500-2500mg/L的谷氨酰胺。

在一个具体实施例中，本发明诱导培养基中添加有600-2000mg/L的水解 干酪素和600-2000mg/L的谷氨酰胺。

在一个具体实施例中，本发明的诱导培养基所含的Na₂EDTA和 FeSO₄·7H₂O各自浓度为已知N₆培养基的1.5-2倍。例如，Na₂EDTA的浓度可 达74.6mg/L，而FeSO₄·7H₂O的浓度可达55.6mg/L。

在一个具体实施例中，本发明的诱导培养基还可在N₆培养基的基础上添 加肌醇，其浓度可为100-200mg/L。

在一个具体实施例中，本发明的诱导培养基还可添加有2,4,5-T（2,4,5-三 氯苯氧乙酸）0.4-1.2mg/L、KT0.3-0.8mg/L、和麦芽糖60-120g/L。

在一个具体实施例中，2,4,5-T的浓度为0.8-1.0mg/L。

在一个具体实施例中，KT的浓度为0.4-0.65mg/L，更优选为0.4-0.5mg/L。

在一个具体实施例中，麦芽糖的浓度为80-100g/L，更优选为80-90g/L。

在一个具体实施例中，可使用2,4-D（2,4-二氯苯氧基乙酸）替代2,4,5-T。 2,4-D的浓度0.4-1.2mg/L，更优选为0.8-1.0mg/L。或者可使用2,4,5-T和2,4-D 的混合物，两者的总浓度控制在0.4-1.2mg/L的范围内，更优选为0.8-1.0mg/L。

在一个具体实施例中，本发明诱导培养基的pH为pH5.5-6.2，优选5.6-5.9， 更优选为5.7-5.8。

在一个具体实施例中，本发明的诱导培养基含有的KNO₃的浓度为 0-2200mg/L，(NH₄)SO₄的浓度为0-350mg/L，水解干酪素的浓度为 400-2000mg/L，谷氨酰胺的浓度为400-2000mg/L。

在一个具体实施例中，本发明的诱导培养基含有的KNO₃的浓度为 700-2200mg/L，(NH₄)SO₄的浓度为110-350mg/L，水解干酪素的浓度为 600-2000mg/L，谷氨酰胺的浓度为600-2000mg/L。

在一个具体实施例中，本发明的诱导培养基含有的KNO₃的浓度为 700-1500mg/L，(NH₄)SO₄的浓度为110-240mg/L，水解干酪素的浓度为 600-2000mg/L，谷氨酰胺的浓度为600-2000mg/L。

在一个具体实施例中，本发明的诱导培养基含有的KNO₃的浓度为 707.5mg/L，(NH₄)SO₄的浓度为115.8mg/L，水解干酪素的浓度为800-2000mg/L， 谷氨酰胺的浓度为800-2000mg/L。

在一个具体实施例中，本发明的诱导培养基不含KNO₃和(NH₄)SO₄，水解 干酪素的浓度为800-2000mg/L，谷氨酰胺的浓度为800-2000mg/L。

因此，本发明诱导培养基的配方可如下表2所示：

表2：本发明诱导培养基的配方（单位：mg/L）

在其它实施方式中，本发明也包括用N₆培养基配制的诱导培养基，其成 分如表1所示，但该诱导培养基不含有KNO₃，含有400-463mg/L的(NH₄)₂SO₄、 800-2000mg/L的水解干酪素和800-2000mg/L的谷氨酰胺。

在其它实施方式中，本发明也包括用N₆培养基配制的诱导培养基，其成 分如表1所示，但该诱导培养基不含有(NH₄)₂SO₄，含有2500-2830mg/L的 KNO₃、800-2000mg/L的水解干酪素和800-2000mg/L的谷氨酰胺。

本发明的诱导培养基可用于培养小孢子诱导生产愈伤组织。

因此，本发明另一方面提供一种大麦小孢子愈伤组织的诱导培养方法，该 方法包括用本发明的诱导培养基诱导培养大麦小孢子，从而获得愈伤组织。

在一个具体实施例中，本发明的方法还包括：取幼穗在低温下处理10-30 天，灭菌后分离出花药；和从花药中分离出小孢子。

本发明还包括获得大麦再生植株的方法，该方法包括：

（1）用本发明的诱导培养基诱导培养大麦小孢子，从而获得愈伤组织； 和

（2）用分化培养基培养将步骤（1）获得的愈伤组织，从而获得再生植株。

在一个具体实施例中，该方法还包括步骤：（3）用生根壮苗培养基培养 步骤（2）所获得的再生植株。

在一个具体实施例中，所述生根壮苗培养基是添加有NAA0.02-0.08mg/L、 多效唑（MET）2.0-10.0mg/L和蔗糖10-40g/L，pH5.6-6.0的1/2MS生根壮苗 培养基。

在一个具体实施例中，在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下进行 25～30天的生根壮苗培养。

本发明还包括用于诱导产生大麦小孢子愈伤组织或大麦再生植株的套盒， 该套盒含有本发明的诱导培养基，以及任选的分化培养基和生根壮苗培养基。

具体实施方式

上文表1示出了适合作为本发明诱导培养基的基础培养基的N₆培养基的 基础配方。应理解，不同文献、不同市售N₆培养基的配方可能有些许不同， 但都可用于实施本发明。更具体而言，可对表1中的各成分的浓度做出适当的 变动，例如有大约5％（例如3％左右、2％左右、1％左右，或更低的变动范 围）或更低的变动，由此配制得到的培养基仍然具有所需的生物学功能，仍能 用于实施本发明。变动的示例性例子可在表2中以“±”的方式列出。此外， N₆培养基中的成分也可使用功能和性质相同或相似的成分加以替换。

在实际操作中，为方便，通常是以原N₆培养基中KNO₃、(NH₄)₂SO₄的量 的3/4、1/2或1/4的量使用KNO₃、(NH₄)₂SO₄，如本申请具体实施例所示，具 体分别为2122.5mg/L、1415mg/L或707.5mg/L，和347.3mg/L、231.5mg/L或 115.8mg/L。或者两者的浓度也可在707.5-2122.5mg/L以及115.8-347.3mg/L的 范围内。或者，如前文所述，本发明诱导培养基中，KNO₃的浓度范围可以为 0－2500mg/L，(NH₄)₂SO₄的浓度范围可为0－400mg/L。

适用于本发明的分化培养基以2/3MS为基本培养基，其中加有6-BA 0.3-1.2mg/L、KT0.5-2.0mg/L、NAA0.01-0.1mg/L、麦芽糖10-50g/L以及肌 醇95-105mg/L，pH为5.5-6.2。

在本发明分化培养基中，6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）的优选浓度为 0.4-0.8mg/L，更优选为0.5-0.6mg/L；KT（6-糠氨基嘌呤）的优选浓度为1.0-1.8 mg/L，更优选为1.2-1.5mg/L；NAA（萘乙酸）的优选浓度0.02-0.08mg/L，更 优选为0.03-0.06mg/L；麦芽糖的优选浓度为20-40g/L，更优选为20-30g/L。

在一个具体实施方式中，NAA的浓度为0.05mg/L。

分化培养基的pH优选为5.7-5.8。

MS培养基的配方如下表3所示（单位：mg/L）：

表3

MS大量元素：   NH₄NO₄1650 KNO₃1900 CaCl₂·2H₂O 440 MgSO₄·7H₂O 370 KH₂PO₄170 MS微量元素：   H₃BO₃6.2 KI 0.83

MnSO₄·4H₂O 22.3 ZnSO₄·7H₂O 8.6 Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 CuSO₄·5H₂O 0.025 CoCl₂·6H₂O 0.025 MS铁盐：   Na₂EDTA 37.3 FeSO₄·7H₂O 27.8 MS有机元素：   盐酸硫胺素 0.1 盐酸吡多辛 0.5 烟酸 0.5 甘氨酸 2.0 肌醇 100.0

MS可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化学试剂公司购买成品。 2/3MS培养基则是将MS培养基的大量元素减少1/3，而微量元素、铁盐和有 机元素不变。然后根据本文所述配方配制本文的2/3MS诱导培养基。本领域技 术人员将理解，可对上述表3所示的浓度作出适当的变动，例如有大约5％或 更低（例如3％左右、2％左右、1％左右，或更低的变动范围）的变动，由此 配制得到的培养基仍然具有所需的生物学功能，仍能用于实施本发明。例如， 以肌醇为例，每升MS培养基中可含有大约95-105mg的肌醇（5％的变动幅度）。 其它成分的浓度也如此变动。此外，2/3MS诱导培养基中的成分也可使用功能 和性质相同或相似的成分加以替换。

同样地，本发明的诱导培养基也可自行按上述配方配制，或者可向Sigma 等化学试剂公司购买获得N₆培养基成品。然后根据本文所述配方配制本文的 诱导培养基。

如前所述，可使用本发明的诱导培养基来诱导产生大麦小孢子的愈伤组 织，包括用该诱导培养基培养大麦小孢子。

通常，实施本申请时，可从大田选取中部小花，其小孢子发育处于单核早 期、中期的穗子，放入冰箱冷藏10-30天，通常是15-25天，例如15天左右。 冷藏的温度可以在0-8℃范围之间，例如可以为3-8℃。通常可在约5℃冷藏。

接种时，穗子先消毒，例如用饱和的漂白粉溶液消毒10-20min，无菌水 冲洗2-4次。每个离心管中接入10个穗子的花药，倒入15-20ml0.2-0.5M的甘 露醇提取液，用高速分散器超速（例如3000-4000rpm）旋切，150目筛网过滤， 滤液低速（例如800-1000rpm）离心，重复2-3次，收集小孢子。

用于预处理花药的甘露醇提取液的浓度可以为约0.3-0.4M，优选为约 0.3M。高速分散器旋切花药时所使用的甘露醇提取液的浓度可以为0.3-0.4M， 优选为0.3M。

提取获得的游离小孢子可置于本发明的诱导培养基中进行诱导培养。培养 前可将先用用该诱导培养基洗涤小孢子1到2次，然后用培养基将小孢子密度 调节至1.0～1.2×10⁵/ml，取大约1.5-3ml小孢子悬浮液接种于培养皿(30× 15mm)，Parafilm封口，室温下（例如约25-28℃）暗培养15-25天。通常情况 下是在25℃暗培养大约21天左右。由此可获得愈伤组织。

诱导培养后，可将所得愈伤组织转移至分化培养基上。

通常在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下分化胁迫培养25～30天， 直至分化出绿色再生植株。分化胁迫培养可使用本发明的分化培养基进行。

分化出的再生植株可转入添加有NAA0.02-0.08mg/L、多效唑（MET） 2.0-10.0mg/L和蔗糖10-40g/L，pH5.6-6.0的1/2MS生根壮苗培养基。在25±1 ℃，每天10～12小时光照的条件下进行25～30天的生根壮苗培养。

生根壮苗培养基中，NAA的优选浓度范围为0.03-0.06mg/L，更优选为 0.04-0.05mg/L；MET的优选浓度范围为3.0-8.0mg/L，更优选为4.0-6.0mg/L。 在一具体实施例中，MET的浓度为5.0mg/L；蔗糖的优选浓度范围为20-30g/L。 在一具体实施例中，蔗糖的浓度为20g/L。

生根壮苗培养基的pH优选为5.8-5.9。

1/2MS生根壮苗培养基是将表3所示的MS培养基的大量元素减半，并加 入本申请所述的NAA0.02-0.08mg/L、多效唑（MET）2.0-10.0mg/L和蔗糖 10-40g/L后配制得到。

与传统育种方法相比，本发明方法简便，易于掌握、实施；不受外界条件 的影响；利用小孢子作为起始材料，可获得大量的愈伤组织，整个过程都在培 养室中进行，同时又降低了劳动力和农田的使用，且可周年重复试验，既缩短 了育种时间，又能获得大量的种质材料。

下文将以大麦为例对本发明进行描述。应理解，在不偏离本发明精神和范 围的情况下可对本发明做出各种修改和变动。且也可采用本发明的方法用于其 它禾谷类作物，并能产生相同的效果。以下实施例仅仅是阐述性的，本发明的 范围由本申请的权利要求加以限定。如无特别说明，本发明所用的百分比为重 量体积百分比。此外，应理解，上述各培养基中各成分的优选范围可任意组合， 只要其能实现本发明的发明目的即可。

实施例

实施例1：愈伤组织的获取

从大田选取中部小花小孢子发育处于单核早期、中期的穗子，放入冰箱冷 藏15天。接种时，穗子用饱和的漂白粉溶液消毒15min，无菌水冲洗3-4次。 每个试管接10个穗子，倒入15ml甘露醇60g/L、CaCl₂1.1g/L、MES0.976g/L 的提取液，用3000rpm的高速分散器超速旋切，150目筛网过滤，滤液以800rpm 低速离心，重复3次，收集小孢子。小孢子用提取液于25℃、黑暗预处理2d。 诱导培养基以表1所示N₆培养基为基本培养基，但Na₂EDTA的浓度为 74.6mg/L，FeSO₄·7H₂O的浓度为达55.6mg/L，其中还加有2,4,5-T1.0mg/L、 KT0.5mg/L，麦芽糖90g/L，肌醇200mg/L，谷氨酰胺和水解干酪素各2.0g/L， pH5.8。培养前将小孢子用培养基洗涤1次，然后用培养基将小孢子密度调节 至1.0～1.2×10⁵/ml，取1.0ml小孢子悬浮液接种于培养皿(30×15mm)，Parafilm 封口，25℃暗培养21d。

实施例2：再生植株的获取

诱导培养21d后将愈伤组织转移至分化培养基上。分化培养基以2/3MS 为基本培养基，其中加有6-BA0.5mg/L、KT1.5mg/L、NAA0.05mg/L和麦芽 糖30g/L，PH为5.8。在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下分化培养25～30 天，直至分化出绿色再生植株。

实施例3：

配制不同KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度的修改的N₆诱导培养基（除KNO₃、 (NH₄)₂SO₄、Glu和CH如下所示外，其余成分浓度同实施例1），按实施例1 收集4份大麦材料的小孢子诱导愈伤组织，培养28d时吸干培养基后称重，结 果见下表。

不同CH和Glu浓度培养基上诱导的愈伤组织产量（mg/皿）

诱导培养基中无机氮浓度

N₆-全氮：KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度分别为2830mg/L和463mg/L，Glu和 CH各800mg/L。

N₆-3/4氮：KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度为全氮的3/4，即分别为2122.5mg/L 和347.3mg/L，Glu和CH各600mg/L。

N₆-1/2氮：KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度为全氮的1/2，即分别为1415mg/L 和231.5mg/L，Glu和CH各400mg/L。

N₆-1/4氮：KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度为全氮的1/4，即分别为707.5mg/L 和115.8mg/L，Glu和CH各200mg/L。

N₆-无氮：培养基中不含KNO₃和(NH₄)₂SO₄，也不含Glu和CH。

从表中结果可以看出，诱导培养基中KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度降至3/4 时，4份供试材料中3份的愈伤组织产量有所上升，1份持平；降至1/2时，4 份供试材料中2份的愈伤组织产量达到最高值，只有1份的愈伤组织产量略低 于全氮的。

实施例4

配制不同CH和Glu浓度的修改的N₆诱导培养基（除KNO₃、(NH₄)₂SO₄、 Glu和CH外，其余成分浓度同实施例1），按实施例1收集一批大麦材料的 小孢子培养诱导愈伤组织，培养21d时吸干培养基，以培养皿为单位，将获得 的愈伤组织称量，结果见下表。

不同CH和Glu浓度培养基上诱导的愈伤组织产量（mg/皿）

N₆-全氮：KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度分别为2830mg/L和463mg/L，Glu和 CH各800mg/L。

N₆-800：KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度分别为707.5mg/L和115.8mg/L，Glu 和CH各800mg/L。

N₆-1200：KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度分别为707.5mg/L和115.8mg/L，Glu 和CH各1200mg/L。

N₆-1600：KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度分别为707.5mg/L和115.8mg/L，Glu 和CH各1600mg/L。

N₆-2000：KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度分别为707.5mg/L和115.8mg/L，Glu 和CH各2000mg/L。

以添加1/4无机氮用量的N₆培养基作为基本诱导培养基，添加不同浓度 的Glu和CH，比较培养基中不同有机氮使用量对小孢子培养愈伤产量的影响。 表中结果表明，所有供试材料的愈伤组织产量随着诱导培养基中Glu和CH浓 度的提高而提高，在含有Glu和CH2000mg/L修改的N₆培养基上，愈伤组织 产量/皿是全氮培养基的1.3-9.0倍。

实施例5

实施例4获得的愈伤组织转移至分化培养基上分化，统计每皿得到的绿色 再生植株数量，结果见下表。

不同CH和Glu浓度培养基上的愈伤组织分化的绿苗数量（株/皿）

培养基“N₆-全氮”、“N₆-800”、“N₆-1200”、“N₆-1600”和“N₆-2000” 含义同实施例4。

表中结果表明，几乎所有供试材料的绿苗产量/皿随着愈伤组织产量的提 高而增加，在含有Glu和CH2000mg/L修改的N₆培养基上，绿苗产量/皿是全 氮培养基的1.1-8.6倍。

实施例6

配制不同KNO₃、(NH₄)₂SO₄、Glu和CH浓度的修改的N₆诱导培养基（除 KNO₃、(NH₄)₂SO₄、Glu和CH外，其余成分浓度同实施例1），按实施例1 收集4份大麦材料的小孢子诱导愈伤组织，培养28d时吸干培养基后称重，结 果见下表。

培养基中不同氮源对愈伤产量的影响(mg/皿)

N₆-A：(NH₄)₂SO₄的浓度为463mg/L，无KNO₃、Glu和CH。

N₆-N：KNO₃浓度为2830mg/L，无(NH₄)₂SO₄、Glu和CH。

N₆-AN：KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度分别为2830mg/L和463mg/L，无Glu 和CH。

N₆-O：Glu和CH各800mg/L，无KNO₃和(NH₄)₂SO₄。

N₆-全氮：KNO₃和(NH₄)₂SO₄的浓度分别为2830mg/L和463mg/L，Glu和 CH各800mg/L。

N₆-AO：(NH₄)₂SO₄的浓度为463mg/L，Glu和CH各800mg/L，无KNO₃。

N₆-NO：KNO₃浓度为2830mg/L，Glu和CH各800mg/L，无(NH₄)₂SO₄。

从上表可以看出，在缺少KNO₃或(NH₄)₂SO₄的情况下，与N₆-全氮组相比， 添加Glu和CH也能明显提高愈伤产量（N₆-AO和N₆-NO组）。此外，诱导培 养基不含KNO₃和(NH₄)₂SO₄的情况下（N₆-O组），与N₆-全氮组相比，添加 Glu和CH也能明显提高愈伤产量。