一种卵巢早衰非人哺乳动物模型的制备方法及其应用

摘要

本发明提供了一种卵巢早衰非人哺乳动物模型及其制备方法，所述动物模型在筛选卵巢早衰治疗药物中的应用以及筛选卵巢早衰治疗药物的方法，和三种合成多肽以及包含所述多肽的药物组合物。本发明的非人哺乳动物模型简便易得，能够用于研究性成熟前卵巢早衰的治疗以及特异治疗药物的筛选。

说明书

技术领域

本发明涉及动物模型领域。更具体地说，本发明涉及性成熟前卵巢早衰动 物模型的制备以及它们在卵巢早衰药物开发中的应用。

背景技术

FSH是一种异二聚体糖蛋白，由腺垂体合成分泌，直接参与调控卵巢功能， 包括卵泡发育与性激素的合成分泌，其调节作用通过卵泡颗粒细胞上FSH受体 (FSHR)信号转导途径介导[1]。FSHR是一种典型的G蛋白偶联受体，与FSH结 合后，通过G蛋白介导的腺苷环化酶-环磷酸腺苷(cAMP)信号级联反应，促进 颗粒细胞中芳香化酶的合成，进而促进雌激素的合成分泌。人FSHR是由695 个氨基酸(大鼠692个氨基酸)组成的一条肽链，其氨基末端17个氨基酸为疏 水性信号肽，紧接着是由349个氨基酸(大鼠348个氨基酸)组成的胞外区，是 识别结合FSH的区域；然后是由264个氨基酸组成的含有7个跨膜螺旋结构的 跨膜区；最后是由羧基末端65个氨基酸(大鼠63个氨基酸)组成的胞内区，为 信息传递所必需[2、3]。在卵泡发育过程中，颗粒细胞膜上的FSHR数量保持 相对的恒定，如果FSHR功能被抑制，卵泡因发育障碍而发生异常闭锁，从而 导致卵巢功能的减退。

卵巢早衰(POF)[4]的主要临床特征之一是患者血液中FSH水平的异常升 高，提示POF患者卵巢组织对FSH的敏感性降低或消失。已有基于人群的研究 证实，FSHR基因突变会导致遗传性卵巢早衰[5]。现有技术中仅仅研究了在实 验动物体内诱导FSHR抗体对雄性小鼠生育力的影响以及遗传修饰的POF小鼠 模型[6、7]。

因此，本领域急需能够用于研究POF且简便易得的哺乳动物模型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种雌性非人哺乳动物模型以及所述模型在性成 熟前卵巢早衰的治疗和特异治疗药物的筛选中的应用。

在第一方面，本发明提供卵巢早衰的非人哺乳动物模型的制备方法，该方法 利用衍生自FSHR的免疫原，免疫非人雌性哺乳动物得到所述卵巢早衰的非人哺乳 动物模型。

在优选的实施方式中，所述衍生自FSHR的免疫原包括选自下组的多肽：

(a)序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4 所示的多肽；

(b)包含(a)所限定的序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形 成的序列，且具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在优选的实施方式中，所述多肽包含(a)所限定的序列经过1-3个氨基酸残 基的取代、缺失或添加而形成的序列，且具有(a)所限定的多肽功能。

在优选的实施方式中，所述非人哺乳动物是啮齿类动物或灵长类动物；在另 一优选的实施方式中，所述非人哺乳动物是小鼠、大鼠、豚鼠、家兔或猴，优选大 鼠。

在优选的实施方式中，所述免疫通过口服、含服、喷雾、经鼻腔、经皮等方 式实施。

在优选的实施方式中，所述免疫进行一次或多次；优选进行三次。

在优选的实施方式中，与正常的非人哺乳动物相比，所述非人哺乳动物模型 血液中的雌二醇水平有统计学显著的降低和/或FSH水平有统计学显著的升高和/ 或所述非人哺乳动物模型的后代窝仔数有统计学显著的降低。

在优选的实施方式中，所述雌二醇水平有统计学显著的降低是指与正常非人 哺乳动物相比，所述非人哺乳动物模型血液中的雌二醇水平降低50%以上，优选 50-90%，更优选70-80%。

在优选的实施方式中，所述FSH水平有统计学显著的升高是指与正常非人哺 乳动物相比，所述非人哺乳动物模型血液中的FSH水平升高20%以上，优选20%-50%， 更优选30-40%。

在优选的实施方式中，所述后代窝仔数有统计学显著的降低是指与正常非人 哺乳动物相比，所述非人哺乳动物模型的窝仔数降低50%以上，优选50-90%，更优 选70-80%。

在第二方面，本发明提供第一方面所述方法制备的卵巢早衰非人哺乳动物模 型在筛选卵巢早衰治疗药物中的应用。

在第三方面，本发明提供筛选卵巢早衰治疗药物的方法，所述方法包括以下 步骤：

(a)将待测物质给予第一方面所述方法制备的卵巢早衰非人哺乳动物模型； 和

(b)检测所述动物模型中的雌二醇或FSH水平；

如果与给予待测物质前的对照动物模型相比，给予待测物质的非人哺乳动物 模型中所述雌二醇有统计学显著的升高和/或FSH浓度有统计学显著的降低，则待 测物质是卵巢早衰治疗药物。

在优选的实施方式中，所述给予方法是口服、含服、喷雾或经皮给药。

在第四方面，本发明提供一种多肽，所述多肽选自下组：

(a)序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的多肽；

(b)包含(a)所限定的序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形 成的序列，且具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在优选的实施方式中，所述多肽包含(a)所限定的序列经过1-3个氨基酸残 基的取代、缺失或添加而形成的序列，且具有(a)所限定的多肽功能。

在第五方面，本发明提供第四方面所述的多肽在制备药物中的用途。

在优选的实施方式中，所述药物用于影响FSH与FSHR结合；和/或

所述药物用于治疗卵巢早衰疾病；和/或

所述药物是避孕药。

在另一优选的实施方式中，所述的卵巢早衰疾病是因FSHR异常免疫反应所导 致的，而所述药物通过中和FSHR抗体而起治疗作用。

在第六方面，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含第四方面所述的 多肽以及药学上可接受的载体。

在优选的实施方式中，所述药物组合物是疫苗组合物或避孕药。

在第七方面，本发明提供第四方面所述的多肽在制备模型动物的用途，所述 模型动物是卵巢早衰非人哺乳动物模型。

在第八方面，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码第四方面所述的 多肽。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施 例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技 术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了标注出胞外区的FSHR氨基酸序列。其中，下划线标记的氨基 酸为重组表达蛋白(13-333aa)(SEQ ID NO:1)，红色标记的氨基酸(1-17aa)为 信号肽序列，蓝色标记单独氨基酸为合成肽序列(17-27aa(SEQ ID NO:2)、 182-194aa(SEQ ID NO:3)、207-219aa(SEQ ID NO:4))，均处于完整FSHR 蛋白分子的胞外区。

图2显示了纯化重组蛋白rFSHR经SDS/PAGE分离的考马斯亮蓝染色结果。 其中M为蛋白分子量Marker(SM0671)；泳道1-2为纯化的重组蛋白his-rFSHR； 泳道3-4为纯化的重组蛋白GST-rFSHR；泳道5-6为BSA蛋白标准品。

图3显示了经纯化的重组蛋白的Western blotting验证。照片A为兔抗 FSHR多克隆抗体检测结果；照片B为鼠抗his单克隆抗体检测结果；照片C为 兔抗GST多克隆抗体检测结果。其中，泳道M为蛋白分子量Marker(SM0671)； 泳道1为纯化的重组蛋白his-rFSHR；泳道2为纯化的重组蛋白his-rFSHR； 泳道3为纯化的重组蛋白GST-rFSHR；泳道4为纯化的重组蛋白GST-rFSHR。

图4显示了大鼠皮下免疫三次后血清抗体滴度水平随日龄的变化。重组蛋 白组以His-rFSHR为免疫原；合成肽组以三段合成肽混合物偶联于KLH作为免 疫原；佐剂对照组为仅仅皮下注射相应剂量的佐剂作为大鼠免疫的对照；三组 均用GST-rFSHR作为包被抗原检测血清抗体滴度。

图5显示了幼年大鼠经FSHR免疫后卵巢对促性腺激素的反应性。其中Con 为空白对照；PMSG为未经免疫处理的同龄大鼠经过PSMG处理后的卵巢反应， 作为免疫影响PMSG反应性的对照；rFSHR+PMSG为显示FSHR免疫反应对卵巢 PMSG反应的影响的实验组。纵坐标表示卵巢重量，或者大鼠体重。各组之间进 行t检验，发现rFSHR+PMSG组的卵巢的反应性，相对PMSG组(p=0.000)和Con 组(p=0.027)均差异显著(p<0.01)。

图6显示了经过FSHR免疫的大鼠抗血清特异结合于卵母细胞-复合体。利 用FSHR免疫原常规免疫大鼠，获得免疫血清。通过常规荧光免疫检测，观察 其中的特异抗体对大鼠卵母细胞-卵丘复合体上FSHR的识别情况。其中图片A 为不加抗血清的免疫对照；B为佐剂组大鼠的血清；C为合成多肽作为免疫原 的大鼠抗血清；D为以重组表达His-FSHR为免疫原的大鼠抗血清。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，人工制备了大鼠FSHR的重组多肽和三个 人工合成多肽，出乎意料地发现通过皮下免疫后能获得血液中含有高水平FSHR 抗体的大鼠，大鼠血液中FSHR抗体可以和卵巢颗粒细胞上的FSHR特异结合， 导致其对FSH反应性降低，进而引发大鼠出现卵巢早衰的症状；发明人还出乎 意料地发现本发明的多肽还能与自身FSHR抗体特异性结合，从而降低自身FSHR 抗体的水平，进而用于治疗FSHR异常免疫反应导致的卵巢早衰等疾病。在此基 础上完成了本发明。

哺乳动物

本文所用的术语“哺乳动物”指非人雌性哺乳动物，包括啮齿类动物和灵 长类动物。在具体的实施方式中，所述非人哺乳动物是小鼠、大鼠、豚鼠、家兔或 猴。在优选的实施方式中，所述非人哺乳动物包括大鼠和小鼠。在更优选的实 施方式中，所述非人哺乳动物是大鼠。

模型动物的制备方法

本发明通过对FSHR分子结构的生物信息学分析，克隆其胞外区片段，构 建原核表达质粒进行表达纯化，并合成三段可能与配体FSH结合的多肽。

用所得重组蛋白rFSHR和人工合成多肽主动免疫雌性非人哺乳动物后，该 动物的血液中产生高滴度水平的抗体，进而检测到该动物的动情周期紊乱、发 情期缩短、血液FSH水平上升、而血液雌激素水平降低。所述动物血液中FSHR 抗体可以和卵巢颗粒细胞上的FSHR特异结合，导致其对促性腺激素的反应性 降低，进而引发卵巢早衰症状的出现，从而得到卵巢早衰的动物模型。

在具体的实施方式中，所述免疫可进行一次或多次。在优选的实施方式中， 所述免疫进行三次。

模型动物的用途

本发明的动物模型可用于研究哺乳动物的性成熟前卵巢早衰，确定治疗方 案并用于特异治疗药物的筛选。

本发明的多肽

本发明所用的术语“多肽”具有本领域普通技术人员熟知的含义。

在优选的实施方式中，本发明的多肽包括序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的多肽。

本发明的多肽还包括所包含的序列是SEQ ID NO:ID NO:1、SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示序列经过1-5个氨基酸残基，优选1-3个氨 基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且具有所需功能的衍生多肽。

本领域普通技术人员知道，一般在多肽的非必要区域改变少数个氨基酸残 基基本上不会改变生物活性，即，适当替换氨基酸得到的序列并不影响其活性 (可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The  Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。本领域技术人员不难实施这种替换并且 能确保所得分子的生物活性不改变。

在本发明中，优选的“衍生多肽”指与上述多肽的氨基酸序列(如SEQ ID NO: 2、3或4)相比，有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地至多1个 氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最 好根据下表进行氨基酸替换而产生。

  最初的残基   代表性的取代   优选的取代   Ala  (A)   Val;Leu;Ile   Val   Arg  (R)   Lys;Gln;Asn   Lys   Asn  (N)   Gln;His;Lys;Arg   Gln   Asp  (D)   Glu   Glu   Cys  (C)   Ser   Ser   Gln  (Q)   Asn   Asn   Glu  (E)   Asp   Asp   Gly  (G)   Pro;Ala   Ala   His  (H)   Asn;Gln;Lys;Arg   Arg   Ile  (I)   Leu;Val;Met;Ala;Phe   Leu   Leu  (L)   Ile;Val;Met;Ala;Phe   Ile   Lys  (K)   Arg;Gln;Asn   Arg

  Met(M)   Leu;Phe;Ile  Leu   Phe(F)   Leu;Val;Ile;Ala;Tyr  Leu   Pro(P)   Ala  Ala   Ser(S)   Thr  Thr   Thr(T)   Ser  Ser   Trp(W)   Tyr;Phe  Tyr   Tyr(Y)   Trp;Phe;Thr;Ser  Phe   Val(V)   Ile;Leu;Met;Phe;Ala  Leu

本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸” 可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序 列的多核苷酸。

因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要 由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、 “基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下 位概念。

本发明多肽的用途

本发明的多肽能在哺乳动物体内产生FSHR抗体，从而能抑制哺乳动物中FSHR 的功能，进而用作避孕药。

对于具有自身FSHR抗体的哺乳动物而言，本发明的多肽不会重复引发免疫应 答，但却仍能与自身FSHR抗体结合，因此，本发明的多肽还能中和FSHR异常免疫 反应导致的血液FSHR抗体，即，降低自身抗体的浓度，进而通过中和FSHR异常免 疫反应导致的血液FSHR抗体来治疗FSHR异常免疫反应导致的卵巢早衰等疾病。

本发明的优点：

1.本发明的人工合成多肽能够在大鼠体内产生高滴度水平的特异性抗 FSHR抗体，进而观察大鼠发情周期、血液FSH及雌激素水平的变化情况。本发 明的哺乳动物模型制备方法简便，得到的动物模型能够用于研究性成熟前卵巢 早衰的治疗以及特异治疗药物的筛选；

2.本发明的多肽可抑制哺乳动物中FSHR的功能，从而可用作避孕药；

3.本发明的多肽还能中和FSHR异常免疫反应导致的血液FSHR抗体，从而 可以治疗FSHR异常免疫反应导致的卵巢早衰等疾病。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则 百分比和份数按重量计算。

本发明所用的具体材料与方法

1.实验动物与饲养条件

SPF级4周龄SD雌性大鼠，体重45±5g，购自上海西普尔-必凯实验动物 有限责任公司(许可证号码：SCXK(沪)2008-0016)。饲养于上海市计划生育科 学研究所啮齿类实验动物房。饲养环境温度控制在24±2℃,相对湿度40-50%, 饲喂颗粒料,自由饮水。

2.主要试剂

各种限制性内切酶、DNA连接酶、逆转录酶(D2680A)及高保真酶(DR010) 均购自Takara公司；离心柱型质粒小抽试剂盒及PCR产物回收试剂盒购自北 京天为时代生物公司；DH5α感受态及DE3感受态购自上海莱枫生物公司；兔 抗FSHR多克隆抗体购自上海沪尚生物科技公司；兔抗GST和beta-actin多克 隆抗体购自上海康为世纪公司；HRP标记的羊抗兔-IgG(H+L)二抗及Trizol购 自Invitrogen公司；ELISA检测用TMB(货号860336)购自Sigma公司，HRP 标记的驴抗兔-IgG(H+L)及HRP标记的驴抗大鼠-IgG(H+L)二抗购自PTG公司； 蛋白分子量Marker(SM0671)购自上海麦约尔生物技术有限公司；弗氏佐剂购自 Sigma公司，FSH测定ELISA试剂盒购自上海逸峰生物科技有限公司。质粒 pET-28a(+)(购自Novagen公司，美国)和pGEX4T-3(购自Amesham Pharmacia  Biotech公司，美国)均为本实验室保存。

3.大鼠主动免疫用FSHR抗原的制备

3.1大鼠FSHR胞外区片段的重组表达与抗原制备

用Trizol试剂提取SD大鼠卵巢组织总RNA，分光光度计测定A260和A280。 取1μg总RNA为模板，按42℃，30min的反应条件反转录为cDNA(逆转录酶购 自Takara公司)，72℃维持10min灭活逆转录酶，冰浴3min后cNDA产物于 -20℃保存。以自行设计的rFSHR引物：正向引物F，5’ GGTGGATCCTTTCTCTGCCAAGACAGCAA3’(SEQ ID NO:5)；反向引物，5’ GATCTCGAGTTTGGTGAGCAGGTCACATC3’(SEQ ID NO:6)，扩增FSHR胞外区片段， 对应13-333位氨基酸残基。取1μL以上cDNA为模板，用高保真酶(DR010， Takara公司)通过PCR获取目标cDNA片段，反应条件为：98℃，15sec；[98℃， 10sec；60℃，15sec；72℃，40sec]30个循环；72℃，10min；4℃，10min。 PCR反应产物经1.2%琼脂糖电泳分离获取rFSHR片段，用限制性内切酶BamH I 和XhoI双酶切，接入载体pGEX4T-3或pET-28a(+)质粒，构建重组表达质粒， 经DNA序列测定，核实构建的质粒序列及阅读框正确。

测序正确的重组表达质粒(pGEX4T-3-rFSHR-ECD和pET-28a(+)-rFSHR-ECD) 转化大肠杆菌DE3感受态菌，以表达FSHR的保外区段(ECD)的GST或His标记 的融合蛋白。当细菌浓度达到A₆₀₀为0.8-1.0，加IPTG至终浓度1mmol/L诱导 表达4h，以获取最佳的表达量。然后于4℃，6000rpm离心10min，收集菌 体以备分离重组表达蛋白。

每克湿菌体加入5ml裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM NaCl， 1mM EDTA，0.1mM PMSF)重悬收集的菌体，冰上超声(宁波新芝生物科技股份 有限公司)，按超声20s，间隔40s，循环20次，功率维持在约200w，以裂 解菌体。经4℃，10000g离心10min，取沉淀以获取包涵体。包涵体经洗涤， 用含7M尿素的裂解液重悬，冰上超声，离心取包涵体的裂解上清液。加入6× 上样缓冲液，于沸水中煮5min，离心去除沉淀物。

利用制备电泳，自包涵体裂解液分离重组蛋白。将经0.25M的KCl浸染 显示的蛋白条带切下后装入处理好的透析袋中，加入6ml生理盐水，置于DNA 电泳槽中，以0.1×蛋白电泳缓冲液电泳，恒定电压100V，电泳约3h，以游 离重组蛋白。电泳完毕，取出透析袋内蛋白凝胶，保留其中的液体，对600ml 缓冲液(5mM Tris-Cl(pH8.0)，0.9%NaCl，0.1mM PMSF)透析3次，每次2h， 以去除蛋白溶液中的电泳液等成分。经透析的重组蛋白溶液，通过超滤浓缩， 以作为免疫或检测用抗原。获取的重组蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定，并参照蛋 白标准，经考马斯亮蓝染色后定量。获取的重组蛋白His-rFSHR作为免疫原， 而GST-rFSHR作为检测抗原。

3.2FSHR配体结合部位免疫原性多肽预测与合成

利用BepiPred 1.0Server软件，预测获得可能具有免疫原性的3条多肽： (1)C-17DSKVTEIPTDL27(SEQ ID NO:2)；(2)182NLSDNNNLEELPN194-C(SEQ ID NO:3)；(3)C-207DISRTKVHSLPNH219(SEQ ID NO:4)。为了下一步免疫， 多肽片段在合成时在氨基末端或羧基末端加入甲硫氨酸(含-SH)。各多肽委托 北京康为世纪生物科技有限公司合成，以与载体蛋白KLH连接作为免疫原，与 BSA连接作为检测抗原。

4.SD大鼠免疫程序

取雌性SD大鼠，于28日龄进行初次免疫免疫。将抗原用生理盐水稀释， 与等体积的佐剂混合，充分乳化，注射体积为150μl/只，腹部皮下多点注射 主动免疫。在不同的时间节点免疫，共3次。初次免疫使用完全弗氏佐剂，抗 原剂量为500μg蛋白/只大鼠。第2次免疫于初次免疫后第14天，即42日龄 进行，改用不完全弗氏佐剂，抗原剂量为200μg蛋白/只；第3次免疫于第2 次免疫后第10天，52日龄进行，佐剂和剂量同2次免疫。

5.ELISA检测血清FSHR抗体滴度

于第3次免疫后1周，即59日龄时，经舌下静脉取血0.1ml，37℃温育 1h，4℃静置过夜，1500rpm、4℃离心30min分离血清，用于抗体滴度检测。 每经过7天取血1次，监测抗体水平变化情况，持续6周。

重组表达的GST融合蛋白GST-rFSHR，经纯化，溶于包被液，配成10μg/ml 的终浓度，按每孔100μl蛋白溶液，加入96孔酶标板(上海萃华生物科技有 限公司)，放入湿盒，于4℃包被过夜，弃去包被液，PBS-Tween 20洗涤3次， 完成抗原包被。加入封闭液200μl/孔，37℃温育1h。弃去封闭液，加入 PBS-Tween20洗涤液200μl/孔，摇床轻轻摇动3min后，甩干洗涤液，在草 纸上拍干，洗涤3次，以除去未能结合的抗原蛋白；每孔加已稀释的待测抗大 鼠血清100μl/孔，放入湿盒，于37℃温育1h，同时以适当稀释的兔源抗大 鼠FSHR兔多抗作为阳性对照。经过常规洗涤后，分别用过氧化物酶标的驴源 抗大鼠IgG(H+L)多抗(PTG公司)和过氧化物酶标的驴源抗兔IgG(H+L)多抗 (PTG公司)作为二抗，检测实验大鼠血清中的抗FSHR抗体和阳性对照的兔源抗 FSHR抗体的浓度。添加二抗溶液，于37℃温育反应1h，经过洗涤，加入底物 进行显色反应。每孔加入100μl新鲜配制的底物溶液(取9.8ml磷酸-柠檬酸 溶液，pH 5.0，依次加入0.2ml的5mg/ml TMB，和10μl30%(V/V)H2O2， 混匀即刻使用)，再置于湿盒中，于37℃温育20min。每孔加50μl反应中止 液，即2M硫酸终止反应。用酶标仪ELx-800(BIO-TEK instruments Inc.)测 定A450值，以计算抗体滴度。将抗体滴度定义为实验组和阴性对照组(未免疫 血清)光吸收比值≥2.0时最大的血清稀释倍数。

6.rFSHR主动免疫大鼠血清抗体对卵母细胞-卵丘复合体FSHR的识别

颈椎脱臼法处死5周龄的雌性SD大鼠，取出卵巢，解剖镜下分离卵丘复 合体。用口吸管吸取卵丘复合体，放入200μl含4%多聚甲醛的96孔板(圆底) 中，室温固定40min，然后将卵丘复合体转移至200μl透膜液(含0.3%BSA、 0.1%TritonX-100的PBS)中4℃过夜，使抗体容易透过细胞膜进入颗粒层细胞 和卵细胞内。透膜后的卵丘复合体经三次洗涤(洗涤液：0.01%TritonX-100的 PBS)后，转移至200μl封闭液(0.3%BSA、150mM甘氨酸的PBS)中，在37℃条 件下，封闭40min；然后加入200μl用封闭液按1：50稀释的大鼠抗血清中， 37℃下，孵育40mi n。大鼠抗血清一抗结合后的卵丘复合体，经洗涤液洗涤三 次后，加入200μl用封闭液按1：50稀释FITC-羊抗大鼠IgG(H+L)(PTG公司， SA00003-11)二抗中，37℃条件下，在暗盒中孵育40min，然后经洗涤三次后， 转移至200μl DAPI染液中，室温条件下染5min；洗涤三次，将卵丘复合体 用抗荧光淬灭封片液(上海碧云天生物技术有限公司，P0173-3)封片，共聚焦 显微镜下观察。

7.动情周期检测和发情期血液激素水平检测

第3次免疫后第7周，即从约100日龄开始，阴道涂片检查大鼠动情周期。 每日早上8：30，翻起大鼠尾巴，露出阴道口，用灭菌的圆头玻璃棒，轻轻插 入阴道10毫米处，顺时针缓慢转动一圈，慢慢将玻璃棒抽出，将黏液均匀涂 在已加灭菌水的载玻片上。一般涂片检查持续3个周期以上，计算发情的频率。 接下来，检查到发情期的当日上午10:30左右，在大鼠舌下静脉取血1.2ml， 分离血浆用于FSH、雌激素及孕激素水平的测定。

利用雌二醇和孕酮诊断试剂盒(电化学发光法，德国罗氏诊断有限公司)， 按照试剂盒使用说明书，在罗氏2010电化学发光免疫分析仪上测定大鼠血浆 E2和P4浓度。血浆FSH水平，通过ELISA试剂盒(上海逸峰生物科技有限公司) 检测，参照说明书，在酶标仪ELx-800(BIO-TEK instruments Inc.)上测定。 血浆E2，P4和FSH测定的批内和批间变异系数均<10%。

8.His-rFSH免疫幼年大鼠后卵巢对促性腺激素的反应性检测

取周龄21日龄雌性SD大鼠分成3组。其中重组蛋白免疫组和免疫对照组 分别为6只和4只，另取4只同龄大鼠作为空白对照。重组蛋白组进行免疫， 第一次使用完全佐剂，免疫原his-rFSHR剂量为200μg蛋白/只大鼠，第二次 免疫(4周龄，28日龄)使用不完全弗氏佐剂，免疫原剂量为200μg蛋白/只大 鼠。第二次免疫后第3天(31日龄)上午舌下取血0.1ml，ELISA检测抗血清滴 度。重组蛋白组6只(滴度均高于8000倍稀释度)。同时取4只大鼠作为对照 组。于32日龄的下午13：00，腹腔注射PMSG(宁波第二激素厂)15IU/大鼠 [8-10]，注射后24h(33日龄)颈椎脱臼法处死分离卵巢，解剖镜下观察卵巢卵 泡情况，称量大鼠体重和卵巢重量。

9.rFSHR主动免疫雌性大鼠生育力的检测

取第3次免疫后血清针对FSHR的抗体维持高滴度，至94日龄，阴道涂片 查发情周期，发情期(10：30am)取血测定激素水平，然后与正常的成年雄性 大鼠交配，观察生育后代的情况。记录窝仔数，出生后28日仔鼠平均体重， 仔鼠性别比(以雌性数目作为100，求得男性的相当值，作为性别比)，妊娠天 数，母鼠体重(分娩后28日)。

10.统计学分析方法

观察和检测各指标，记录有关的数据，以各指标作为变量，FSHR主动免疫 实验组和佐剂对照的数据，填入Excel表格中。然后把有关数据导入SPSS 18.0 统计软件(SPSS Inc.,Chicago,IL)，绘制有关柱状图和获得有关表格。根据 数据类型和分布情况，选择t检验或Mann-Whitney U检验，获得均值和标准 差，以及显著性指标p值。差异显著性水平选择p<0.05。

实施例

实施例1.针对FSHR胞外区的免疫原的制备

我们克隆大鼠FSHR胞外区的对应cDNA序列，构建细菌重组表达质粒，分 别表达大鼠FSH受体(rFSHR)胞外区段的重组蛋白GST-rFSHR和his-rFSHR。在 DE3表达菌中大鼠FSH受体(rFSHR)的重组蛋白GST-rFSHR和his-rFSHR主要以 包涵体形式表达，经过洗涤包涵体、制备型电泳切胶及在超滤管中超滤纯化， SDS/PAGE和考马斯亮蓝染色验证，获得足够量并且纯度较高的蛋白(图2)。同 时，分别用标签抗体(兔抗GST多克隆抗体和小鼠抗his单克隆抗体)和特异性 的兔抗FSHR多克隆抗体对纯化蛋白进行了western blot验证(图3)。同时， 通过抗原反应性预测，3段多肽序列，通过化学合成获得各段肽，与KLH偶联 作为免疫抗原，与BSA偶联作为检测抗原。各种合成肽的抗原经过纯化， SDS/PAGE电泳检测检测发现呈现单一条带，适合进行动物免疫和抗体检测。

实施例2.ELISA检测免疫大鼠抗血清中的FSHR抗体滴度

大鼠免疫3次后7天舌下静脉取血约0.1ml，分离抗血清。酶标板用纯化 的蛋白GST-rFSHR包被，每孔抗原含量为1μg。检测主动免疫大鼠血清的抗体 滴度。合成肽组和佐剂对照组以1:200稀释倍比开始，重组蛋白组从1:2000 稀释倍比开始，通过免疫检测反应的A450值测定，计算相应血清的抗体滴度。 连续检测测六周的血清抗体滴度，发现抗血清滴度水平维持在相当高的水平。 由图-5可见，52日龄最后一次免疫后，重组蛋白免疫组血清抗体滴度的维持 在1/520000；而合成肽免疫组的抗体滴度维持在1/10000左右，持续至日龄 94天，而佐剂对照组的血清滴度大约在1/200的较低水平。

实施例3.rFSHR主动免疫大鼠血清抗体识别卵母细胞-卵丘复合体FSHR

由图6可以看出，经过针对FSHR人工免疫，在大鼠的血清中产生的抗体 可以在离体情况下与卵母细胞-卵丘复合体结合。不添加抗血清，则没有荧光 出现，表明抗体反应荧光检测系统可以特异呈现FSHR抗体和细胞上FSHR的结 合(图6，图片A)。佐剂免疫对照组，可能天然含有少量FSHR抗体，呈现少量 的荧光(图6，图片B)。合成肽抗原免疫重组的荧光出现明显的荧光，但相对 重组蛋白抗原免疫荧光信号较弱(图6，图片C)。重组表达蛋白作为免疫原来 源的抗血清，产生的荧光最强，表明其中抗体的效价更高(图6，图片D)。

实施例4.检测重组FSHR胞外区主动免疫对大鼠动情周期与血液激素水平 的影响

从表1可以看出，28日龄大鼠经过三次以重组His-rFSHR作为免疫原的免 疫过程后，检测大鼠的动情周期和血液激素水平，发现发情频率和血液孕酮(P4) 水平与佐剂对照组比较变化差异不显著，而雌激素(E2)和FSH浓度和对照比较， 均出现显著的差异(p<0.05)。其中，发情频率的均值略有降低，P4水平略有升 高；E2水平显著降低，而FSH水平显著升高。

表1.重组蛋白免疫对雌性大鼠动情周期和血液激素水平的影响

注：*标注表示重组蛋白免疫组和对照组间的比较通过t检验差异显著 (p<0.05)。

实施例5.检测rFSHR主动免疫对卵巢的PMSG反应性的影响

从表2可以看出，21周龄的大鼠经过rFSHR免疫后，观察其卵巢重量相应 促性腺激素PMSG刺激出现的变化，发现与未经免疫的对照组比较，卵巢重量 呈现显著变小；同时大鼠体重伴随显著降低。同时，rFSHR免疫大鼠虽然体重 较轻(p=0.027)，但是经PMSG刺激的卵巢重量与空白对照组相比显著升高 (p=0.006)。

表2.FSHR免疫21周龄大鼠后卵巢对促性腺激素的反应性的影响

注：*标注表示重组蛋白免疫组PMSG和佐剂免疫对照注射PMSG组的比较 通过t检验差异显著(p<0.01)。

实施例6.检测FSHR作为免疫原主动免疫对雌性大鼠生育力的影响

雌性大鼠经过3次免疫，母鼠血液中维持高水平的FSHR抗体。于94日龄， 同成年雄鼠交配，生育后代在这种情况下，与正常的成年雄性大鼠交配，生育 后代的窝仔数与对照比较，呈现显著降低；而出生后28日仔鼠平均体重，仔 鼠性别比，妊娠天数，母鼠体重等均没有差异显著性，如表3。

表3重组蛋白免疫对雌性大鼠生殖后代的影响

注：*标注表示重组蛋白免疫组和对照组间比较通过t检验获得p值，假 设方差相等，双边截尾。灰色标记出呈现显著差异的指标(p<0.01)。

结论

无论合成肽抗原还是重组表达抗原都能够引起实验动物产生高水平血清 抗体。在本研究中，合成肽和重组蛋白免疫后的抗血清，以GST-rFSHR为包被 抗原检测，合成肽组滴度(约1万倍稀释)低于重组蛋白组(约50万倍稀释)； 以合成肽-BSA为包被抗原，合成肽组抗血清滴度可达5万到20万(结果未显 示)，达到较高水平，而重组蛋白组抗血清仅对三段合成肽中其中某一片段产 生较低水平滴度(约1万倍稀释)。

Ghosalkar等用合成的大鼠285-309多肽免疫雄兔，抗血清能与大鼠卵巢 的颗粒细胞结合，Lindau-Shepard等的研究显示针对人FSHR的单抗可以识别 天然FSHR。在我们的研究中，针对大鼠蛋白序列的重组表达蛋白His-rFSHR和 合成肽，能够通过皮下免疫，生成高水平的抗体，其能够结合大鼠卵泡颗粒细 胞上自然状态的FSHR，并且重组蛋白组中显示抗体结合量的免疫荧光强度高于 合成肽组。

免疫大鼠导致高滴度的血清抗体生成，与佐剂对照组比较，发现血液中E2 水平显著降低，而FSH水平显著升高，这与卵巢早衰的实验室检查结果一致。 说明我们通过人工免疫反应，可以导致大鼠出现与临床卵巢早衰激素变化类似 的变化。

孕马血清促性腺激素(PMSG)，也称马绒毛膜促性腺激素，由妊娠早期母马 子宫内膜杯状结构所分泌。PMSG是糖蛋白激素中唯一而独特的促性腺激素，同 一分子中具有黄体生成素(LH)和促卵泡生成素(FSH)两种促性腺激素的活性， 主要用于促进母畜卵巢卵泡发育、成熟。在本研究中，通过检测卵巢对促性腺 激素PMSG的反应性，我们发现经过免疫的大鼠卵巢对PMSG反应性减弱。说明 免疫反应产生的针对FSHR胞外区段的抗体可以结合卵巢颗粒细胞上的FSHR， 阻碍其与外源性促性腺激素PMSG结合，阻碍PMSG促进颗粒细胞增殖，结果导 致卵巢体积与对照相比明显变小。进而，卵巢的颗粒细胞因为FSHR的功能障 碍而导致卵泡发育出现障碍，影响其产生卵母细胞的数量和质量，引起雌性大 鼠生育力下降。

总之，我们通过人工制备大鼠的FSHR免疫原，通过皮下免疫，获得血液 中含有高水平FSHR抗体的大鼠。其中的抗体可以和卵巢颗粒细胞上的FSHR结 合，导致其对FSH反应性降低，进而引发大鼠出现卵巢早衰的症状。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。

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