H9N2亚型病毒、H9N2亚型病疫苗及其制备方法

摘要

本发明公开了H9N2亚型病毒、H9N2亚型病疫苗及其制备方法。其中，H9N2亚型病毒保藏号CGMCC：7702，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该H9N2亚型病毒具有较强的毒力，免疫原性好，毒价较高，利用该H9N2亚型病毒生产的疫苗安全性好，免疫保护期长。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及H9N2亚型病毒和H9N2亚型病疫苗及其制备方法。 

背景技术

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的严重危害养禽业的高度传染性疾病。禽流感病毒属于正粘病毒科，流感病毒属。血凝素（Hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（Nueraminidase，NA）是病毒的两种主要保护性抗原，根据HA、NA的抗原性差异，可将A型流感病毒分为不同的亚型。迄今为止，A型禽流感病毒的HA已发现16种，NA有9种，分别以H1～H16、N1～N9命名，不同H抗原或N抗原之间无交叉反应。各亚型间血凝素氨基酸序列同源性70%以下，相同亚型氨基酸序列同源性为80%～90%。 

该病于1878年首次发生于意大利，以后国内外不少学者都相继报道了该病的发生及其给养鸡业造成的巨大经济损失。H9N2亚型禽流感是目前世界上分布最广泛的禽流感病毒亚型。H9N2亚型禽流感病毒最早于1966年从北美的火鸡体内分离得到，该亚型的流感病毒最初只感染火鸡，几乎不感染鸡。但从20世纪90年代以来，H9N2亚型禽流感病毒就在亚洲很多养鸡场传播开来。该病目前已流行于世界上许多国家和地区，给养禽业造成了巨大的经济损失。在我国，高致病性禽流感以H5N1亚型为代表，低致病性禽流感以H9N2亚型为主型。 

AIV血清亚型较多，不同亚型AIV甚至不同毒株对不同宿主的易感性不同，而易感性变化又会因为病毒变异而发生改变。HA基因变异率高，是病毒发生抗原变异的主要原因。NA蛋白主要和病毒的成熟和释放有密切关系，可能会影响到病毒的复制、传播等。由于禽流感病毒变异非常快，给禽流感防控带来困难，治疗性药物的研发周期较长，一定程度上影响了临床防控效果。接种疫苗是防控禽流感的主要手段，但由于禽流感病毒变异快，流行毒株多，血清学多且无交叉免疫，其作用大大受到限制。解决这一难题，有赖于对本地区流行的毒株的流行特点，变异特点进行研究以及筛选分离出合适的优势疫苗毒株，以使禽流感的防控更具有针对性和有效性。 

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的目的在于提出一种H9N2亚型病毒和H9N2亚型病疫苗及其制备方法。 

在本发明的第一方面，本发明提出了一种H9N2亚型病毒，根据本发明实施例，该H9N2亚型病毒保藏编号CGMCC：7702，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，根据本发明实施例，所述的H9N2亚型病毒是是从经过正常免疫禽流感灭活疫苗的发病鸡群分离得到，其毒价EID₅₀为10^7.5～10^8.5/ml，因此，所述的H9N2亚型病毒株毒性好，具有良好的免疫原性，可作为灭活疫苗生产毒株及检验毒种。 

在本发明的第二方面，本发明提出了上述H9N2亚型病毒在制备H9N2亚型病疫苗中的用途，在本发明一个实施例中，根据H9N2亚型病毒交叉免疫保护试验证明，所述的H9N2亚型病毒具有很好的交叉免疫保护作用。因此利用该H9N2亚型病毒生产H9N2亚型病疫苗，可以有效提高H9N2亚型病疫苗的免疫原性，从而进一步提高H9N2亚型病疫苗安全性及免疫保护期。 

在本发明第三方面，本发明提出了一种H9N2亚型病疫苗，根据本发明实施例，该H9N2亚型病疫苗包括灭活的H9N2亚型病毒。从而有效提高H9N2亚型病疫苗的免疫原性，进一步提高H9N2亚型病疫苗安全性及免疫保护期。 

根据本发明实施例，本发明的上述实施例的H9N2亚型病疫苗还包括如下附加技术特征： 

根据本发明的一个实施例，所述的H9N2亚型病疫苗是通过甲醛灭活的，由此可以有效提高H9N2亚型病疫苗的免疫原性，同时可以进一步提高H9N2亚型病疫苗安全性及免疫保护期。 

在本发明第四方面，本发明提出了一种制备H9N2亚型病疫苗的方法，根据本发明实施例，该方法包括：对权利要求1所述的H9N2亚型病毒进行灭活，以便获得经过灭活的H9N2亚型病毒；利用所述经过灭活的H9N2亚型病毒制备水相；以及将所述水相与油相进行混合乳化，以便获得所述H9N2亚型病疫苗。由此，可以有效提高H9N2亚型病疫苗的免疫原性，从而进一步提高H9N2亚型病疫苗安全性及免疫保护期。 

根据本发明一个实施例，本发明上述实施例的制备H9N2亚型病疫苗的方法还包括如下附加技术特征： 

根据本发明实施例，在对所述H9N2亚型病毒进行灭活之前，包括按照下列步骤获得H9N2亚型病毒培养液：将所述H9N2亚型病毒接种非免疫鸡胚中，并在35.5～37.5℃下进行培养，收集所获得的鸡胚尿囊液；分离所述鸡胚尿囊液，以便获得所述H9N2亚型病毒培养液。 

根据本发明一个实施例，对所述H9N2亚型病毒进行灭活包括：在37℃下，利用终浓 度为0.2%的甲醛对H9N2亚型病毒培养液进行灭活处理16～36小时；以便获得含有灭活H9N2亚型病毒的溶液。根据本发明一个实施例，所述制备水相包括：将含有灭活H9N2亚型病毒的溶液与吐温-80按照96：4的体积比例进行混合，以便得到所述水相。、 

根据本发明一个实施例，所述制备油相包括：将注射用白油MARCOL52、司本-80以及硬脂酸铝按照94：6：2的质量比进行混合，以便得到所述油相。由此，提高H9N2亚型病疫苗的免疫原性，从而进一步提高H9N2亚型病疫苗安全性及免疫保护期。 

根据本发明一个实施例，将所述水相与油相混合包括：将所述水相和油相按照体积比为1：2～2：3进行混合乳化搅拌，在搅拌终止前加入终浓度为0.01%的硫柳汞以便获得所述H9N2亚型病疫苗。由此，提高H9N2亚型病疫苗的免疫原性，从而进一步提高H9N2亚型病疫苗安全性及免疫保护期。 

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。 

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中： 

图1是根据本发明一个实施例的H9N2亚型病疫苗的制备方法技术路线图。 

具体实施方式

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：发明人分离了一株H9N2亚型病毒，该病毒在经过灭活后可以用作制备H9N2亚型病疫苗，用于防止禽流感。 

在本发明的第一方面，本发明提出了一种H9N2亚型病毒，根据本发明实施例，该H9N2亚型病毒保藏编号CGMCC：7702，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，根据本发明实施例，H9N2亚型病毒是从经过正常禽流感灭活疫苗免疫的发病鸡群分离得到，其毒价EID₅₀为10^7.5～10^8.5/ml，因此，分离得到的H9N2亚型病毒株毒性好，具有良好的免疫原性，可作为灭活疫苗生产毒株及检验毒种，根据本发明一个实施例，H9N2亚型病毒交叉免疫保护试验证明，该H9N2亚型病毒具有很好的交叉免疫保护作用。因此可以利用该H9N2亚型病毒生产H9N2亚型病疫苗，有效提高H9N2亚型病疫苗的免疫原性，从而进一步提高H9N2亚型病疫苗安全性及免疫保护期。 

在本发明的第二方面，本发明提出了上述H9N2亚型病毒在制备H9N2亚型病疫苗中的用途，在本发明一个实施例中，根据H9N2亚型病毒交叉免疫保护试验证明，该H9N2亚型病毒具有很好的交叉免疫保护作用。因此利用该H9N2亚型病毒生产H9N2亚型病疫苗，可以有效提高H9N2亚型病疫苗的免疫原性，从而进一步提高H9N2亚型病疫苗免疫 保护期和免疫效果。 

在本发明的第三方面，本发明提出了一种H9N2亚型病疫苗，根据本发明实施例，该H9N2亚型病疫苗包括灭活的H9N2亚型病毒。根据本发明实施例，该H9N2亚型病疫苗的免疫持续期至少可以维持4个月。根据本发明实施例，该H9N2亚型病疫苗可在2～8摄氏度下保存12个月，因此该疫苗具有良好的稳定性。 

根据本发明实施例，上述H9N2亚型病疫苗是被灭活的，可以采用的灭活剂种类并不受特别限制，只要可以有效破坏H9N2亚型病毒的核酸结构以及使蛋白质变性即可，但不破坏H9N2亚型病毒的抗原性及血凝性。根据本发明一个实施例，所采用的灭活剂为甲醛，甲醛可以有效破坏H9N2亚型病毒的DNA结构，进而达到灭活H9N2亚型病毒的目的。根据本发明实施例，所采用的灭活剂甲醛终浓度并不受特别限制，只要能够有效灭活H9N2亚型病毒即可。根据本发明一个实施例，所采用的甲醛的终浓度为0.2%。 

在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备H9N2亚型病疫苗的方法，根据本发明实施例，该方法包括对上述H9N2亚型病毒进行灭活，以便获得经过灭活的H9N2亚型病毒；利用经过灭活的H9N2亚型病毒制备水相；以及将水相与油相进行混合乳化，以便获得H9N2亚型病疫苗。由此，有效提高H9N2亚型病疫苗的免疫原性，从而进一步提高H9N2亚型病疫苗免疫保护期和免疫效果。 

根据本发明的一个实施例，在对H9N2亚型病毒进行灭活之前，包括按照下列步骤获得H9N2亚型病毒培养液：将H9N2亚型病毒接种于非免疫鸡胚中，并在35.5～37.5℃下进行培养，收集所获得的鸡胚尿囊液，以便获得H9N2亚型病毒培养液。根据本发明实施例，非免疫鸡胚为9～11日龄鸡胚，能够对H9N2亚型病毒进行有效培养。根据本发明一个实施例，在H9N2亚型病毒接种于非免疫鸡胚之前，先将H9N2亚型病毒进行稀，接种后，在35.5～37.5℃下进行培养72小时，弃去24小时内死亡鸡胚，收集24～72小时死亡鸡胚。从而有利于得到毒价高的鸡胚尿囊液，进而提高制备H9N2亚型病疫苗的免疫保护力。 

根据本发明一个实施例，对H9N2亚型病毒进行灭活的条件并不受特别限制，根据本发明的具体实施例，可以采用甲醛对H9N2亚型病毒进行灭活。所采用的灭活剂甲醛终浓度并不受特别限制，只要可以有效灭活H9N2亚型病毒即可。根据本发明的具体实施例，所采用的甲醛的终浓度为0.1%～0.4%。根据本发明实施例，灭活剂灭活的时间及温度并不受特别限制，只要可以有效破坏H9N2亚型病毒的核酸结构即可。根据本发明的具体实施例，利用终浓度为0.1%～0.4%的甲醛对H9N2亚型病毒培养液进行灭活处理16～36小时，由此可以将H9N2亚型病毒充分灭活。 

根据本发明的一个实施例，上述制备H9N2亚型病疫苗的方法中，可以利用下述方法制备水相：将含有灭活H9N2亚型病毒的溶液与吐温-80进行混合。 

根据本发明的具体实施例，含有灭活H9N2亚型病毒的溶液和吐温-80进行混合的配比并不受特别限制，根据本发明的具体示例，可以按照96：4的体积比进行混合。通过采用上述配比以及浓度制备水相。 

根据本发明的一个实施例，上述制备H9N2亚型病疫苗的方法中，可以利用下述方法制备油相：将注射用白油MARCOL52、司本-80以及硬脂酸铝进行混合，以便得到油相。根据本发明的具体实施例，注射用白油MARCOL52、司本-80以及硬脂酸铝可以采用的质量为94：6：2，由此可以提高H9N2亚型病疫苗的免疫原性，从而进一步提高H9N2亚型病疫苗免疫保护期和免疫保护效果。 

根据本发明的一个实施例，将水相和油相混合乳化，可以按照水相和油相体积比为1：2～2：3进行混合乳化搅拌，在终止搅拌前加入0.01的硫柳汞以便获得H9N2亚型病疫苗。由此可以使得适当程度乳化，提高H9N2亚型病疫苗的免疫原性，从而进一步提高H9N2亚型病疫苗的免疫保护效果。 

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。 

实施例1禽流感H9N2亚型病毒毒株江苏株的分离和鉴定 

1、病毒分离 

采集病禽样品包括气管、肺、泄殖腔拭子，将采集样品放在含有抗菌素的PH值7.0～7.4的等渗磷酸盐缓冲液（PBS）内。将鉴定为阳性样品的棉拭子充分捻动，拧干后弃去拭子，样品液经1500r/min离心10min，取上清液用0.22μm除菌滤器过滤,将处理好的无菌组织样品经绒毛尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，共接种10枚，0.2mL/枚，置37℃孵育，每8h照一次胚，弃去24h内非特异性死亡胚，收集24～72h死亡胚尿囊液，放置-20℃冻结保存备用。 

按照上述方法，从病鸡的病料中分离到有血凝性的病毒，HA试验证明江苏株能够凝集鸡红细胞，HI试验证明江苏株的血凝性不能被新城疫病毒（NDV）抗血清、抗AIV H5亚型血清和抗AIV H7亚型血清所抑制，能被AIV H9亚型阳性血清抑制。结果见表1。 

表1病料初次分离结果 

2、亚型鉴定 

将分离的江苏株鸡胚尿囊液经亚型鉴定为AIV H9N2亚型，命名为A/Chicken/Jiangsu-12/2012(H9N2亚型)株，简称江苏株。该毒株已于2013年5月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，分类命名为甲型流感病毒，保藏号为CGMCC No.7702。鉴定用血清购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室。 

实施例2禽流感H9N2亚型病毒毒株江苏株灭活疫苗制备 

1、疫苗抗原液制备及毒价测定 

将江苏株病毒用生理盐水稀释后，接种10日龄非免疫鸡胚，37℃培养72小时（弃去24h内死亡鸡胚），收取24-72小时捏死亡鸡胚尿囊液，测定毒价：10^7.5-10^8.5EID₅₀。病毒液置-20℃保藏备用 

2、抗原液灭活 

将甲醛溶液加入病毒液中，终浓度为0.2%，置37℃温箱内摇动作用20小时，经接种9～11日龄SPF鸡胚检验合格后作为制备抗原液。 

3、油相佐剂制备 

以注射用专用白油、司本-80和硬脂酸铝按质量比94：6：2比例配制混合，经高温灭菌后备用。 

4、水相制备 

将4体积的吐温-80经高温灭菌后，加入到96体积的已灭活抗原液中，经充分溶解混合即为水相。 

5、疫苗配制 

将一定比例的油相和水相（比例为1:2）在立式胶体磨机中预混后，再将混合物注入到高压匀浆泵内乳化，制成油包水乳剂，每毫升含有病毒量大于等于1.5×10^8.0EID₅₀。 

6、安全性试验 

取2周龄SPF鸡10只，每只鸡颈部皮下注射3倍免疫剂量灭活疫苗。同时设对照组鸡10只，连续14d，观察是否出现由禽流感H9N2亚型江苏株灭活油苗接种引起的任何局部或全身不良反应。结果证明所有接种鸡均未有跛行症状发生，也无其他任何临床病理症状或病理变化，无任何的局部或全身反应。 

实施例3 江苏株灭活疫苗免疫保护性试验 

取28日龄SPF鸡20只，分为2组，10只每组，分为免疫组和对照组。免疫组接种禽流感病毒H9N2亚型江苏株灭活疫苗，每只肌肉注射单剂量疫苗0.5ml，28天后，用禽流感病毒H9N2亚型江苏株做攻毒试验。剩下的为对照组，只攻毒不接种疫苗。攻毒剂量均 为10^5.0EID₅₀。攻毒后5天采集棉拭子，接种10日龄鸡胚分离该病毒。 

通过实验可知（试验结果见表6），免疫组都没有出现疑似禽流感的临床症状，棉拭子病毒分离结果是：免疫组10只分离到病毒的数量为0，对照组10只分离到病毒的数量为10只。棉拭子结果显示禽流感病毒H9N2亚型江苏株灭活疫苗能够使鸡免受该毒株的攻击，显示该毒株具有良好的免疫保护效果。 

表6SPF鸡发病和棉拭子病毒分离结果 

以0.5ml一次肌肉注射后14、21、28和35天后采血，分离血清测定其对H9N2亚型AIV的滴度。14天后大多数鸡已表现出不同程度的HI抗体。在21天后，所有免疫鸡都产生抗H9的HI抗体，且较14天时显著上升，HI抗体滴度在35天时达到高峰，平均可达10log2。 

实施例4 江苏株免疫攻毒交叉保护试验 

取商品化的禽流感H9亚型灭活疫苗H株与用本发明实施例1的禽流感H9亚型江苏株制作的灭活疫苗进行交叉免疫保护试验，验证江苏株灭活疫苗的免疫保护性能。 

取28日龄SPF鸡50只，分为6组，第1组、第2组、第4组和第5组都是10只，第3组和第6组都是5只，第1组和第2组肌肉和皮下接种H株灭活疫苗每只0.5ml/只，第4组和第5组肌肉和皮下接种江苏株灭活疫苗0.5ml/只，第3组和第6组肌肉和皮下接种无菌PBS0.5ml/只。在免疫后28天，第1、2、3组用禽流感H9N2亚型江苏株攻毒10⁵EID₅₀/只，第4、5、6组用禽流感H9N2亚型H株攻毒10⁵EID₅₀/只；攻毒后每天观察鸡群情况，观察两周，并在第5天采集口腔和泄殖腔棉拭子，进行病毒分离等。攻毒后第14天，剖检所有试验鸡，观察内脏病变等。 

试验结果表明（试验结果见表7）。攻毒后，所以组别都没有出现明显的临床症状；而棉拭子病毒分离结果显示，第1组有2份棉拭子能够分离到AIV H9亚型禽流感病毒，接种PBS的第3组和第6组全部都能分离到病毒。说明禽流感病毒H9N2亚型江苏株能够为鸡提供良好的保护力，防止江苏株和H株的攻击；禽流感病毒H9N2亚型H株产生的抗体能够防止H毒株的攻击，而对江苏株的攻击只能产生80%的免疫保护力。进一步说明本发明的禽流感H9N2亚型病毒江苏株灭活疫苗具有较好的交叉保护力，能够抵抗江苏株以及其他禽流感病毒株的攻击。 

表7H9亚型禽流感江苏株与H株的SPF鸡免疫攻毒交叉保护实验 

实施例5 江苏株稳定抗原的制备及稳定性试验 

将禽流感病毒江苏株接种10日龄SPF鸡胚，弃去24h死胚，收获24h-96h死胚的尿囊液，将尿囊液进行灭活，离心后，加入适当佐剂制成禽流感病毒江苏株的稳定抗原，该抗原在使用和储备时不存在散毒的危险，减少了因为使用活病毒抗原而对环境和人体的危害，该产品具有很好的稳定性，在2～8℃条件下，保存12个月以上该产品血凝价不变，可用于禽流感H9N2亚型的HI检测（结果见表8）。 

表8江苏株稳定抗原保存稳定性试验结果 

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。 

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。