公开/公告号CN103397057A
专利类型发明专利
公开/公告日2013-11-20
原文格式PDF
申请/专利权人 CJ第一制糖株式会社;
申请/专利号CN201310068944.8
申请日2007-07-30
分类号C12P13/12;C12P7/46;C12P7/54;C12N1/21;C12N1/19;C12R1/19;C12R1/185;C12R1/18;C12R1/425;C12R1/15;C12R1/13;
代理机构南京经纬专利商标代理有限公司;
代理人楼高潮
地址 韩国首尔市
入库时间 2024-02-19 20:43:39
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-03-23
授权
授权
2013-12-18
实质审查的生效 IPC(主分类):C12P13/12 申请日:20070730
实质审查的生效
2013-11-20
公开
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技术领域
本发明涉及一种制备L-蛋氨酸和有机酸的方法。更特别是，本发明涉及一种由L-蛋氨酸前体通过酶转化反应制备具有高产量的L-蛋氨酸和有机酸的方法，所述酶转化反应来自通过根据本发明而制备的L-蛋氨酸前体生产菌株的发酵而生产的L-蛋氨酸前体。本发明生产L-蛋氨酸的方法比传统方法更环保并能对L-蛋氨酸进行选择性生产，目的是使用工业上不同领域中的L-蛋氨酸作为食品、食物添加剂和医学供应品的原料以及药物等。
背景技术
蛋氨酸是人体内的一种必需氨基酸，其可以广泛用作食品和食物添加剂并进一步用作医疗液体和医疗供应品的人造原料。蛋氨酸作为类似化合物如胆碱(卵磷脂)和肌酸的前体，并且同时用作半胱氨酸和牛黄酸的人造原料。蛋氨酸还可以提供硫。S-腺苷蛋氨酸衍生自L-蛋氨酸并且在人体内扮演了一个固定供应甲基的角色，并且还参与合成大脑内的神经传递素。蛋氨酸和/或S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)可抑制脂肪堆积在肺里和动脉里并且可降压、消炎、减轻肝脏疾病和缓解肌肉痛疼等。
蛋氨酸和/或S-腺苷-L-蛋氨酸在体内的功能目前已知如下。
1）它能抑制脂肪在肺部和动脉的堆积促进类脂物的代谢并能提高大脑、心脏和肾脏内的血液循环(J Hepatol.Jeon BR等,2001Mar;34(3): 395-401)。
2)它能促进消化，解毒和有毒物质的排出以及重金属如Pb的排出。
3）它以800-1,600mg/天的剂量可用作抗抑郁剂(Am J Clin Nutr.Mischoulon D.等,2002Nov;76(5):1158S-61S)。
4)它增强了肺部功能(FASEB J.Mato JM.,2002Jan;16(1):15-26)，并对由乙醇导致的肺部疾病特别有效(Cochrane Database Syst Rev.,Rambaldi A.,2001;(4):CD002235)。
5)它对骨关节疾病具有消炎作用并能促进关节的恢复(ACP J Club.Sander O.,2003Jan-Feb;138(1):21,J Fam Pract,Soeken KL等,2002May;51(5):425-30)。
6)它是头发的基本营养物。它可以给头发提供营养而防止脱发(Audiol Neurootol.,Lockwood DS等,2000Sep-Oct;5(5):263-266)。
蛋氨酸可以在化学上或生物上合成以用作饲料、食品和药品。
在化学合成中，蛋氨酸主要由5-(β-甲基巯基乙基)-乙内腺脲的水解制备。该化学合成的蛋氨酸具有的缺点是仅能制成L-型和D-型的混合物。
在生物合成中，蛋氨酸通过参与蛋氨酸合成的蛋白质进行制备。L-蛋氨酸由高丝氨酸通过酶表达作用以生物学方法合成，例如通过基因metA,metB,metC,metE和metH。特别地，metA是编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的基因并且可将高丝氨酸转化成O-琥珀酰-L-蛋氨酸，上述高丝氨酸O-琥珀酰转移酶是蛋氨酸生物合成必需的初始酶。由metB基因编码的O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶或胱硫醚伽马合酶将O-琥珀酰-L-高丝氨酸转化成胱硫醚。由metC基因编码的胱硫醚β裂解酶将胱硫醚转化成L-高半胱氨酸。由metE编码的钴胺素非依赖性（cobalamine-independent）蛋氨酸合酶以及由metH编码的钴胺素依赖性（cobalamine-dependent）蛋氨酸合酶，二者都可将L-高半胱氨酸转化成L-蛋氨酸。同时，由metF编码的5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶和由glyA编码的丝氨酸羟甲基转移 酶同时作用以合成N(5)-亚甲基四氢叶酸从而提供合成L-蛋氨酸所必需的甲基。L-蛋氨酸通过上面的酶由一系列有机反应合成。上述基因修饰蛋白或其它影响上述蛋白的蛋白可能导致L-蛋氨酸在合成上的变动。例如,日本专利提前公开公布号2000/139471描述了一种通过Escherichia sp制备L-蛋氨酸的方法。其中基因组中的thrBC和metJ基因被删除,metBL为过表达，并且metK由渗漏突变体替换。此外，美国专利公开号US2003/0092026Al描述了一种采用metD(L-蛋氨酸合成抑制剂)敲除（knock-out）微生物方法，其属于棒状杆菌属（Corynebacterium sp.）美国专利公开号US2002/0049305描述了一种通过增加5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(metF)的表达增加L-蛋氨酸产量的方法。
美国专利专利公开号US2005/0054060A1描述了一种制备L-蛋氨酸采用胱硫醚合酶(O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶)突变体生产微生物的方法。该胱硫醚合酶突变体可以直接地由H2S或CH3SH取代半胱氨酸产生高半胱氨酸或蛋氨酸。在这种方法中，突变体胱硫醚合酶直接诱导进细胞内并参与胞内蛋氨酸的生物合成过程。在这种方法中，由于采用胞内蛋氨酸的生物合成渠道胱硫醚合酶反应并不是很有效。而且，H2S或CH3SH对细胞的高毒性降低了这种方法的有效性。在我们的实验中，我们还发现胱硫醚合酶对CH3SH的底物特异性比衍生自假单胞菌属或色素杆菌属的琥珀酰高丝氨酸合酶的底物特异性低。
根据现有技术，胱硫醚合酶与不同的底物反应趋向于产生不同的产物。胱硫醚合酶介于高半胱氨酸和O-琥珀酰高丝氨酸之间相互作用以产生具有高效应的高羊毛氨酸(J.Bacteriol(2006)vol188:p609-618)。该细胞内的胱硫醚合酶可以与不同的蛋氨酸前体反应并能产生不同的具有高效的副产物。因此，胱硫醚合酶的过表达由于较高的副产物可以导致较低的效率。
由传统的生物方法制备的该蛋氨酸是L型的，其具有优点但是产量 太低。这是因为该蛋氨酸的生物合成渠道具有紧密的反馈调节系统。一旦合成的蛋氨酸到达确定水平，最终产物蛋氨酸抑制了在蛋氨酸生物合成开始时metA基因编码初始蛋白的转录。metA基因本身的过表达并不能增加蛋氨酸产量，因为该metA基因在转录阶段被蛋氨酸抑制并在接下来的翻译阶段由细胞内蛋白酶降低(Dvora Biran,Eyal Gur,Leora Gollan and Eliora Z.Ron:通过蛋白水解作用对大肠杆菌中蛋氨酸的抑制(2000)37(6),1436-1443)。因此,许多在先专利关注怎样从metA基因的反馈管理系统中释放它(WO2005/108561,WO1403813)。
当蛋氨酸在生物系统中产生时，在蛋氨酸降解渠道由蛋氨酸中的S-腺蛋氨酸合酶使产生的蛋氨酸被转化成S-腺蛋氨酸。由于S-腺蛋氨酸是细胞内的基本物质，因此S-腺蛋氨酸合酶并不能被检测出。根据在先专利，该基因编码S-腺蛋氨酸合酶变异成具有低的活性以增加该蛋氨酸的产量(WO2005/108561)。
发明内容
传统的蛋氨酸生物合成方法采用胱硫醚合酶代谢渠道以产生蛋氨酸，由于硫化物的毒性并伴随着副产物的产生以至于酶的反应过程效率很低。另外，在蛋氨酸合成渠道中的反馈调节抑制了蛋氨酸的大量产生。
本发明的目的在于提供一种生产L-蛋氨酸可选择的方法以克服传统方法中存在的上述问题。该可选方法由两步组成，其中L-蛋氨酸前体通过发酵产生并且L-蛋氨酸前体在酶的作用下转化成L-蛋氨酸。
本发明的另一个目的在于提供一种选择性地生产L-蛋氨酸的方法。
本发明进一步的目的在于提供一种在不增加工艺步骤的情况下同时产生作为副产物的有机酸的方法。
本发明将在下文中作详细描述。为了完成本发明的目的，本发明提供了一种制备L-蛋氨酸的方法，其组成步骤有1)制备L-蛋氨酸前体生 产菌株并通过发酵该菌株以制备L-蛋氨酸前体,和2)通过与L-蛋氨酸前体的酶反应制备L-蛋氨酸以及有机酸。特别是,在步骤1)中,生产和发酵L-蛋氨酸前体产生菌株以在培养基中积聚L-蛋氨酸前体。同时，产生L-蛋氨酸前体的菌株通过本发明的方法由本发明者有计划地制备,以至于本发明还包括该菌株以及在它的范围内生产菌株的方法。
文中的L-蛋氨酸前体被组成为下列公式的O-酰基高丝氨酸基团之一取代;[公式1]
其中R为包括C,H,O,N和其它最多带有15个碳分子的化合物。例如，该O-酰基高丝氨酸基团包括,但不限于,O-乙酰基高丝氨酸,O-琥珀酰基高丝氨酸,丙酰基高丝氨酸,乙酸乙酰基高丝氨酸,香豆酰基高丝氨酸,丙二酰高丝氨酸,羟甲基戊二酰基高丝氨酸和pimelyl高丝氨酸。
本发明中的L-蛋氨酸前体优选为O-乙酰基高丝氨酸或O-琥珀酰基高丝氨酸。文中所用的"L-蛋氨酸前体生产菌株"指的是一种原核或真核的微生物菌株，通过本发明的处理它们能够积聚L-蛋氨酸前体。例如，该菌株可以选自由埃希氏菌属（Escherichia sp.）、欧文氏菌属（Erwinia sp.）、沙雷氏菌属（Serratia sp.）、普罗威登斯菌属（Providencia sp.）、棒状杆菌属(Coryne bacteria sp.)、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、钩端螺旋体菌属（Leptospira sp.）、沙门氏菌属（Salmonellar sp.）、Brevibacteria sp.、Hypomononas sp.、色素杆菌属（Chromobacterium sp.）和诺卡氏菌属（Norcardia sp.）微生物或真菌类或酵母类组成的组中。优选地，该假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、诺卡氏菌属（Norcardia sp.）和埃希氏菌属（Escherichia sp.）微生物可以被用作生产O-琥珀酰基高丝氨酸,并且 该埃希氏菌属（Escherichia sp.）、棒状杆菌属（Corynebacterium sp.）、Reptospira sp.和酵母的微生物可用于生产O-乙酰基高丝氨酸。更优选地是，使用埃希氏菌属（Escherichia sp.）微生物，并且最优选是使用大肠杆菌（Escherichia coli.）(下文中称为"E.coli”)。此外,可将外部基因引进埃希氏菌属（Escherichia sp.）微生物以选择性生产O-琥珀酰基高丝氨酸和O-乙酰基高丝氨酸。
本发明提供一种L-蛋氨酸前体生产菌株，其中参与O-琥珀酰基高丝氨酸和O-乙酰基高丝氨酸降解的基因被删除或被削弱。本发明还提供了一种L-蛋氨酸前体生产菌株，其中参与O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸的合成的基因被诱导或放大。本发明还选择性提供一种菌株，其中苏氨酸的生物合成渠道被封闭或削弱从而提高了O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸的产量。本发明进一步提供一种菌株，其中诱导、过表达或应急的基因从反馈调节系统中释放出来并且编码参与琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸合成的蛋白。
更特别地是，本发明通过删除参与L-蛋氨酸前体降解的metB基因、参与苏氨酸生物合成渠道的thrB基因和控制L-蛋氨酸前体合成基因的转录的metJ基因的菌株提高参与L-蛋氨酸前体生物合成的metA或metX基因的表达或引入在反馈调节系统中释放的metA或metX基因;或敲除（knocking-out）metA基因并取代引入的metX基因;或检测metX基因并取代引入的metA基因以提供一种L-蛋氨酸前体生产菌株。
在本发明中,基因的删除可以通过剪掉某段基因或在染色体上通过引入特定的DNA序列修饰该蛋白序列来实施。基因的削弱(weakening)可以通过在靶基因的ORF区域引入突变体以降低蛋白的活性来实施或通过修饰基因的启动区或5'-UTR的核苷酸序列以降低蛋白的表达来实施。
在本发明中，该蛋白表达的增加通过修饰基因的启动区或5'-UTR的核苷酸序列以实现，并且该蛋白的活性的增加可以通过在靶基因的ORF 区域引入突变体来实现，并且该蛋白表达的提高还可以通过在染色体上引入靶基因的额外复本来实现或通过诱导该载体，该载体是带有自启动子的靶基因或该菌株中的其它增强启动子。
在本发明中的一个优选实施例中，制备L-蛋氨酸前体生产菌株的方法如下：
在步骤1中,基因编码蛋白例如胱硫醚伽马合酶，O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶在菌株中被删除或敲除（knocking-out）目的是积聚L-蛋氨酸前体例如O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸。
编码胱硫醚伽马合酶的基因指的是metB,编码O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶的基因指的是metZ,以及编码O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的基因指的是metY。编码具有上述活性的蛋白的基因为例如metB，其metB为公知的E.coli。在现有技术中(Blattner等,Science277:1453-1462(1997))披露了该基因的染色体组序列可以从E.coli(保藏号AAC75876)的染色体组序列中得到。上述染色体组序列还可以从NCBI(National Center for Biotechnology Information)和DDBJ(DNA Data Bank Japan)中获得。其它具有上述活性的基因由衍生自棒状杆菌的metB和metY以及衍生自假单胞菌属的metZ中获得。
胱硫醚伽马合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶如下反应式所示具有将O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转化成的胱硫醚或高半胱氨酸的活性。因而，菌株中删除或削弱上述活性的基因时，在培养液中显示出O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸的积聚。
L-半胱氨酸+O-琥珀酰基-L-高丝氨酸<=>琥珀酸盐+胱硫醚
L-半胱氨酸+O-乙酰基-L-高丝氨酸<=>醋酸盐+胱硫醚
HS-+O-琥珀酰基-L-高丝氨酸<=>琥珀酸盐+高半胱氨酸
HS-+0-乙酰基-L-高丝氨酸<=>醋酸盐+高半胱氨酸
在步骤2中,thrB基因编码在步骤1中制备的菌株中的高丝氨酸激酶被删除或削弱。该thrB基因参与从高丝氨酸合成O-含磷高丝氨酸,该高丝氨酸接着被thrC基因转化成苏氨酸。删除或削弱thrB基因用在所有已制得的高丝氨酸中以用于蛋氨酸前体的合成。
在步骤3中,metJ基因是metA基因的转录调节剂并被删除或削弱。metA基因包含在蛋氨酸前体的合成中，其通过蛋氨酸的反馈调节系统进行调节并且metJ基因作为阻抑物包含在metA基因的转录中。为了在构成上过表达该metA基因并激活合成的蛋氨酸前体,对metA基因消除其转录的阻抑物是有用的。因此，在E.coli中metJ基因被消除并metA基因的表达增加,从而大量生产L-蛋氨酸前体。
上述步骤2和3可根据一种前体生产菌株可进行修改且其并不是该前体生产菌株所必需的。然而，在埃希氏菌属微生物中为了提高前体的产量的方法其可以优选实施。
在步骤4中,作为蛋氨酸生物合成阶段第一阶段中的酶介质的可编码高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶或高丝氨酸O-乙酰基转移酶的metA或metX基因，其表达的提高可以促进蛋氨酸前体的合成。metA基因是可编码高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶的基因的通用术语,并且metX基因是可编码高丝氨酸O-乙酰基转移酶的基因的通用术语。为了提高metA或metX基因的表达,可以引入基因的附加复本或5'-UTR或修饰启动子或突变每个基因的ORF区。这种基因的放大表达导致了L-蛋氨酸前体合成的显著增加。
如果蛋氨酸被认为是菌株生长所必须的，引入的metA或metX基因可从反馈调节剂中释放。在这个实施例中，L-蛋氨酸前体的合成与介质中蛋氨酸的含量无关并且在介质中添加的蛋氨酸促进了L-蛋氨酸前体的合成以及细胞的生长。
为了增加从O-琥珀酰基高丝氨酸生产菌株中的O-乙酰基高丝氨酸的产量,编码染色体中存在的高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶的metA基因可被删除。其中O-琥珀酰基高丝氨酸的产量因metA基因的删除受到抑制并且通过引入附加的metX基因生产O-乙酰基高丝氨酸,O-乙酰基高丝氨酸与现存的metA基因中引入metX基因的实例相比可以得到较高的产量。
通过删除编码存在于菌株染色体中的高丝氨酸O-乙酰基转移酶的metX基因，使得在O-乙酰基高丝氨酸生产菌株中增加O-琥珀酰基高丝氨酸的产量是可能的。其中O-乙酰基高丝氨酸的产量由于metX基因的删除而受到抑制并且O-琥珀酰基高丝氨酸由于另外引入metA基因而产生，O-琥珀酰基高丝氨酸以较高产量产出。
通过选取上述步骤1-4中的有益部分或全部工艺，可以使O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸、L-蛋氨酸前体在菌株中积累。
该L-蛋氨酸前体生产菌株可以由L-赖氨酸、L-苏氨酸或L-异亮氨酸菌株生产，优选地，它可以采用L-苏氨酸生产菌株进行制备。在这种菌株中,高丝氨酸的合成率已经提高，从而蛋氨酸前体的产量也相应地增加。因此，蛋氨酸前体的积聚是通过删除或敲除（knocking-out）在苏氨酸生物合成渠道中包含的基因实现，以及接下来的metA或metY或MetZ基因采用L-苏氨酸生产菌株。更优选地是首先删除或削弱thrB基因，并且接着metB,metY或metZ以合成蛋氨酸前体。同时，增加了metA或metX基因的表达从而使合成的蛋氨酸前体增加。
本发明中"L-苏氨酸生产菌株"指的是原核微生物菌株或真核微生物菌株，其能够在体内产生L-苏氨酸。例如，该菌株包括在属于埃希氏菌属（Escherichia sp.）、欧文氏菌属（Erwinia sp.）、沙雷氏菌属（Serratia sp.）、普罗威登斯菌属（Providencia sp.）、棒状杆菌属（Corynebacterium sp.）和短杆菌属（Brevibacterium sp.）中的L-苏氨酸生产微生物菌株。 它们之中，优选埃希氏菌属（Escherichia sp.）微生物并且大肠杆菌（Escherichia coli.）是更优选的。
该L-苏氨酸生产菌株不但包括自然界中的微生物还包括它们的突变株，这些突变株可举例为如下微生物：通过那些对异亮氨酸具有渗漏需要并且对L-赖氨酸类似物和α-氨基丁酸具有抑制作用的微生物；和通过至少添加引入内源性磷酸烯醇丙酮酸盐羧化酶(ppc)基因的额外复本进行突变的微生物；和灭活参与草酰乙酸盐(OAA)转化到磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)过程的pckA基因的微生物，其中草酰乙酸盐(OAA)是L-蛋氨酸的一种中间体；和灭活tyrR基因的微生物，上述tyrR基因可抑制参与L-蛋氨酸生物合成的tyrB基因的表达;和灭活galR基因的微生物，上述galR基因可抑制参与葡萄糖转移的galP基因的表达。文中的L-赖氨酸的类似物（analoges）可以是选自包含S-(2-氨乙酸)-L-半胱氨酸和δ-甲基-L-赖氨酸的组中的一种或多种化合物。
在本发明的一个优选实施例中,CJM002,该L-苏氨酸产生和L-蛋氨酸-独立菌株突变自TF4076(KFCC10718,韩国专利号92-8365),采用该产生L-苏氨酸的E.coli突变菌株。TF4076需要蛋氨酸,并且具有与蛋氨酸类似物(例如,α-氨基-β-羟基戊酸,AHV),赖氨酸类似物(例如,S-(2-氨乙酸)-L-半胱氨酸,AEC),和异亮氨酸类似物(例如,α-氨基丁酸)的抵抗性。包含在上述韩国专利中的信息包含在本发明权利要求的范围内。由于TF4076为需要蛋氨酸的菌株，而不能在体内合成蛋氨酸。在本发明中，为了通过解除对蛋氨酸的需要性从而使将这种菌株作为蛋氨酸生产菌株来使用，本发明者采用NTG人工突变制备解除了对蛋氨酸的需要性的L-苏氨酸生产菌株E.coli CJM002。所述E.coli CJM002被称为大肠杆菌（Escherichia coli.）MF001并于2004年4月9日保藏在KCCM(韩国微生物保藏中心,友林大厦,弘济1洞,西大门区,首尔,361-221,韩国)(保藏号:KCCM-10568).O-琥珀酰基高丝氨酸通过上述方法产生制 备的大肠杆菌（Escherichia coli.）CJM-BTJ(pMetA-CL)也于2006年7月21日保藏(保藏号:KCCM-10767)并且大肠杆菌（Escherichia coli.）CJM-BTJ(pCJ-MetA-CL)在2007年7月5日保藏(保藏号:KCCM-10872).O-乙酰基高丝氨酸通过本发明的上述方法产生制备的大肠杆菌（Escherichia coli.）CJM-BTJA(pCJ-MetX-CL)于2007年7月5日保藏(保藏号:KCCM-10873)。
上述制备的L-蛋氨酸前体生产菌株培养基可以通过现有技术中已知的常规介质和条件实现。本领域人员易于理解根据所选择的菌株采用的培养基的方法也容易调节。例如，该培养基方法包括但并不限于分批（batch）,连续培养（continous culture）和分批培养（fed-batch）。各种不同的培养基方法在下面的参考文献中有描述:"生物化学技术"由James M.Lee撰写,Prentice-Hall International Editions,pp138-176.
所述介质必须满足特定菌株的培养基条件。各种不同的微生物培养基介质在下列文献中有描述:"普通细菌学方法手册(Manual of Methods for General Bacteriology)"，美国细菌学会,华盛顿,,USA,1981。那些介质包含不同的碳源、氮源和示踪原子。碳源举例为碳水化合物如葡萄糖,、蔗糖,、乳糖,、果糖,、麦芽糖、淀粉、纤维素;脂类如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油;油脂酸如棕榈酸、硬脂酸、和亚油酸;醇类如甘油和乙醇;以及有机酸如乙酸。这些化合物中的一种或它们的混合物可作为碳源。氮源举例为，有机氮源如胨、酵母膏、肉汁、麦芽提取物、玉米浆(CSL)和黄豆粉以及无机氮源如尿素、硫酸胺、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些化合物中的一种或它们的混合物可作为氮源。这里的介质还包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和以及相应的含钠盐作为磷酸盐的来源。所述介质还包括金属盐，如硫酸镁或硫酸铁。此外，氨基酸、维他命以及常规的前体也可以加进来。所述介质或前体可以分批处理或连续地加入培养基中。培养基的pH在培养过程中通过以适当的方式添加如氢氧 化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸的化合物来进行调节。在培养过程中通过采用抗发泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制气泡的产生。为了维持培养基的需氧条件，可将氧气或含氧气体(例如，空气)通入培养基中。培养基的温度通常在20-45°C,优选为25-40°C。培养周期在L-蛋氨酸前体的产量在达到所需水平之前一直是连续的，优选的培养时间是10–160小时。
步骤2)的过程包括经酶反应产生L-蛋氨酸和有机酸的过程，所用的酶是具有活性的胱硫醚合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或在使用时含有这些酶的活性菌株。O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸产自上述L-蛋氨酸前体生产菌株以甲基硫醇作为底物。
更特别的是,本发明提供了一种通过酶反应产生L-蛋氨酸的方法，所用酶是胱硫醚合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶，通过采用由上述方法作为底物积聚的高丝氨酸,O-含磷高丝氨酸,O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸。本发明优选采用O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸作为底物。
在本发明中,所述胱硫醚伽马合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶可以衍生自埃希氏菌属（Escherichia sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、钩端螺旋体菌属（Leptospira sp.）、棒状杆菌属（Corynebacterium sp.）、酵母菌属(Saccharomyces sp.）、色素杆菌属（Chromobacterium sp.）、奴卡氏菌属（Nocardia sp.）、博斯特属（Bradyrhizobium sp.）、生丝单胞菌属（Hyphomonas sp.）、甲基球菌属(Methylococcus sp.)、Methylo杆菌属（Methylobacillus sp.）、亚硝化单细胞菌属（Nitrosomonas sp.）、Klesiella sp.、杆菌属（Bacillus sp.）、志贺氏菌属（Shigella sp.）、Colwellia sp.、沙门氏菌属（Salmonella sp.）、酵母或真菌类。
在步骤2)的过程中，其中O-琥珀酰基高丝氨酸用作L-蛋氨酸前体,优选采用的是衍生自假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、奴卡氏菌属（Nocardia sp.）或色素杆菌属（Chromobacterium sp.）的胱硫醚伽马合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶,更优选用的是衍生自Pseudomonas aurogenosa、鼻疽诺卡菌(Nocardia Farcinica）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）或青色素杆菌（Chromobacterium Violaceum）。
在步骤2)的过程中,其中O-乙酰基高丝氨酸用作L-蛋氨酸前体,优选采用衍生自钩端螺旋体菌属（Leptospira sp.）、色素杆菌属（Chromobacterium sp.）或生丝单胞菌属（Hyphomonas sp.）的胱硫醚伽马合酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶,更优选用衍生自Leptospira meyeri、Pseudomonas aurogenosa、Hyphomonas Neptunium或青色素杆菌（Chromobacterium Violaceum）。
上述的酶反应如下列反应式所示，并且其结构式如图2所示。
CH3SH+O-琥珀酰基-L-高丝氨酸<=>琥珀酸盐+蛋氨酸
CH3SH+O-乙酰基-L-高丝氨酸<=>乙酸盐+蛋氨酸
在上述反应中,如图2公式所示,CH3S-甲基硫醇残基被O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸的琥珀酸盐或乙酸盐残基取代以产生蛋氨酸在反应中甲硫醇(CH3SH)可以不同的形态加入。
具有上述酶活性的基因编码酶序列可以从美国的NCBI数据库,和日本的DNA数据库(KEGG)中获得。
为了生物转化反应，将获得的基因序列克隆，然后将其诱导加入到表达载体。待表达的酶以活性状态来自重组菌株。酶表达菌株和已表达的酶二者都可直接用于反应。
从上述基因或微生物菌株表达的那些酶可以直接进行混合或部分混合或不混合，在发酵的上清或肉汁积聚L-蛋氨酸前体以开始反应。在本 发明优选的实施例中，O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸积聚在发酵溶液中可以由酶转化成蛋氨酸，所述酶是衍生自假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、色素杆菌属（Chromobacterium sp.）、钩端螺旋体菌属（Leptospira sp.）或生丝单胞菌属（Hyphomonas sp.）的胱硫醚伽马合酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶。
更优选地,O-琥珀酰基高丝氨酸积聚在发酵溶液中可以由酶转化成蛋氨酸，所述酶是衍生自Pseudomonas aurogenosa、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）或青色素杆菌（Chromobacterium Violaceum）胱硫醚伽马合酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶。O-乙酰基高丝氨酸积聚在发酵溶液中可以由酶转化成蛋氨酸，所述酶是衍生自Leptospira meyeri、Hyphomonas Neptunium或青色素杆菌（Chromobacterium Violaceum）的胱硫醚伽马合酶或O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶。
pCL-CJl载体(CJ,韩国)中的每个表达基因,E.coli的表达用载体,以及被表达的蛋白从采用超声波降解法分解细胞制备的酶溶液中获得。所述酶溶液加入积聚有O-琥珀酰基高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸的发酵溶液,并将和甲基硫醇溶液也加入其中以开始反应。该反应采用DTNB(5,5-二硫基-双(2-硝基-苯甲酸,Sigma,美国)控制并且反应产物由HPLC进行分析。
在本发明中,在没有分离步骤下，通过CH3SH分别与O-琥珀酰基高丝氨酸和O-乙酰基高丝氨酸反应可以额外得到副产物如琥珀酸或乙酸。
附图说明
本发明的优选实施例的应用参照附图可以很好地理解，其中:
图1显示的是蛋氨酸前体生产菌株的基因处理图。
图2显示的是步骤2中蛋氨酸产物的化学结构。
图3是由pMetA-CL得到metA基因表达的原理图。
图4是由pCJ-MetB-CL得到metB基因表达的原理图。
图5是反应曲线图，显示了与不同的酶反应的O-琥珀酰高丝氨酸使用量。
每种酶溶液的来源如下。酶溶液#21是一种不包含特定基因的细胞提取液。
图6是反应曲线图，显示了与不同的酶反应的O-乙酰基高丝氨酸使用量（consumptions）。每一数字如图5中所示。
图7及图8显示了用于转化反应的每种酶的氨基酸序列，按照DNAstar的megalign排列。
具体实施方式
本发明实用的和当前优选的实施例如下所示。
然而，本领域技术人员应当理解，鉴于本文的公开在本发明的精神 和范围之内可对其进行修改和改进。
实施例1：构建蛋氨酸前体生产菌株
<1-1>删除metB基因
为了在E.coli菌株中删除编码胱硫醚合酶的metB基因，实施FRT一步PCR删除(FRT-one-step PRC deletion)操作(PNAS(2000)vol97:P6640-6645)。序列1和序列2的引物用于PCR，采用pKD3载体(PNAS(2000)vol97:P6640-6645)作为模板,导致缺失基因盒的结构。PCR操作如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸1分钟，循环以上操作30回。
PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，之后对从1.2kbp带获得的DNA进行纯化。回收的DNA片段在E.coli(K12)W3110中经电穿孔与pKD46载体(PNAS(2000)vol97:P6640-6645)转化。在电穿孔之前,W3110在带有pKD46下，在30°C含有100μg/L的氨苄青霉素和5mM的1-阿拉伯糖的LB介质中孵育，直到OD600达到0.6。然后用无菌蒸馏水清洗培养基菌株2次，再用10％甘油清洗一次。在2500V下电穿孔。该回收的菌株在含有25μg/L的氯霉素LB平板介质中涂布，接着在37°C下在培养基中培养过夜。然后，选择显示抗生素抗性的菌株。
采用选择的菌株作为模板以及上述相同的引物在相同的条件下进行PCR扩增。通过在1.0%琼脂糖凝胶中识别大小为1.2kb的菌株从而确认metB基因的删除。然后该菌株与pCP20载体(PNAS(2000)vol97:P6640-6645)进行转化并在LB介质中孵育。最后构建成敲除（knock-out）metB的菌株，其中metB基因在相同的条件下通过在1.0%琼脂糖凝胶中PCR扩增，大小减至150bp。确认氯霉素标记物被消除。构建的菌株称为W3-B。
<l-2>删除thrB基因
本发明者试图通过删除thrB基因编码高丝氨酸激酶来增加由高丝氨 酸到O-琥珀酰高丝氨酸的合成。特别是，采用苏氨酸生产菌株，由于采用的高丝氨酸的活性非常强删除这种基因是相当必需的。为了从上述构建的W3-B菌株中删除thrB基因，通过上述删除metB基因相同的方法进行FRT一步PCR删除。
为了构建thrB缺失基因盒，采用pKD4载体(PNAS(2000)vol97:P6640-6645)作为模板进行PCR扩增，所用的引物为序列3和序列4，如下;在94°C下变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸1分钟，循环以上操作30回。PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中进行电穿孔，接着将得到的1.6kbp带的DNA进行纯化。将回收的DNA片段经电穿孔成W3-B菌株与pKD46载体进行转化。将回收的菌株在含有50μg/L的卡那霉素的LB平板介质中涂布，接着在37°C下在培养基中培养过夜。然后，显示抗性的菌株被选择。
采用选择的菌株作为模板利用序列3和序列4的引物在上述相同条件下进行PCR扩增。通过在1.0%琼脂糖凝胶中选择大小为1.6kb的菌株从而确认ThrB基因的删除。然后该菌株用pCP20载体进行转化，并在LB介质中培养。最终构建出thrB敲除（knock out）菌株，其中thrB基因的大小在1.0%琼脂糖凝胶中在相同条件下通过PCR减至150kb。确认卡那霉素标记物被消除。构建的菌株称为W3-BT。
<l-3>metJ基因的删除
为了删除metJ基因，其为包含在蛋氨酸前体合成中的metA基因的调节基因，采用与删除metB基因相同的方法即FRT一步PCR进行操作。
为了构建metJ缺失基因盒,PCR扩增使用序列5和序列6的引物，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸1分钟，循环以上操作30回。PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中进行电穿孔，接着将得到的1.2kbp带的DNA进行纯化。将回收的DNA片段经电穿孔成W3-BT菌株与pKD46载体进行转化。将回收的菌株在含有氯霉素 的LB平板介质中涂布，接着在37°C下在培养基中培养过夜。然后，选择显示抗生素抗性的菌株。
采用选择的菌株作为模板利用序列7和序列8的引物在上述相同条件下进行PCR扩增。通过在1.0%琼脂糖凝胶中选择大小为1.6kb的菌株从而确认metJ基因的删除。然后该菌株用pCP20载体进行转化，并在LB介质中培养。最终构建出metJ敲除（knock out）菌株，其中metJ基因的大小在1.0%琼脂糖凝胶中在相同条件下通过PCR减至600kb。确认氯霉素标记物被消除。构建的菌株称为W3-BTJ。
<l-4-l>过表达metA基因
为了增加蛋氨酸前体的合成,metA基因编码参与O-琥珀酰高丝氨酸合成中的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶，该蛋氨酸前体被过表达。
采用E.coli w3110的染色体作为模板进行PCR扩增，所用引物为序列9和序列10，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作25回。
该PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，接着将得到的1.2kbp带的DNA进行纯化。回收的DNA片断与另一通过用Smal消化的pCL1920载体中获得的DNA片断连接。E.coli与所述连接的载体转化，接着置于含有50μg/L的奇放线菌素中的LB介质中孵育，随后经过选择。因而构建的载体称为pMetA-CL。pMetA-CL的原理图如图3所示。W3-BTJ菌株与所述载体转化。构建后的菌株称为W3-BTJ/pMetA-CL并且在那里观察到O-琥珀酰高丝氨酸量的增加。
增加metA基因表达的另一个方法是，metA基因通过采用CJl启动子(CJ,韩国)和EcoRV与pCL1920载体连接。E.coli与接连的载体进行转化，其接着置于含有50μg/L的奇放线菌素中的LB介质中孵育，随后经过选择。因而构建的载体称为pCJ-MetA-CL。W3-BTJ菌株与所述载体进行转化。构建后的菌株称为W3-BTJ/pCJ-MetA-CL并且在那里 观察到O-琥珀酰高丝氨酸量的增加。
<l-4-2>metX基因的过表达
为了合成O-乙酰基高丝氨酸,metX基因编码参与O-乙酰基高丝氨酸合成的高丝氨酸O-乙酰基转移酶，该蛋氨酸前体被过表达。
采用Leptospira meyeri的染色体作为模板进行PCR扩增，所用引物为序列11和序列12，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作25回。
该PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，接着将得到的1.1kbp带的DNA进行纯化。回收的DNA片段通过采用CJl启动子和EcoRV连接到pCL1920载体。E.coli与所述连接的载体转化，接着置于含有50μg/L的奇放线菌素中的LB介质中孵育，随后经过选择。因而构建的载体称为pCJl-MetXlme-CL。W3-BTJ菌株与所述载体转化。构建后的菌株称为W3-BTJ/pCJ-MetXlme-CL并且在那里观察到O-乙酰基高丝氨酸量的增加。
过表达metX基因的另一个方法是通过PCR扩增，采用棒状杆菌的染色体作为模板，所用引物为序列68和序列69，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作25回。该PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，接着将DNA进行纯化。回收的DNA片段通过采用CJl启动子和EcoRV连接到pCL1920载体。E.coli与所述连接的载体转化，接着置于含有50μg/L的奇放线菌素中的LB介质中孵育，随后经过选择。因而构建的载体称为pCJ-MetXcgl-CL。W3-BTJ菌株与所述载体转化。构建后的菌株称为W3-BTJ/pCJ-MetXcgl-CL并且在那里观察到O-乙酰基高丝氨酸量的增加。
<l-4-3>metA基因的删除
为了增加O-乙酰基高丝氨酸的产量,在W3-BTJ菌株中删除编码 高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的metA基因。基于发现只有metX基因诱导导致O-琥珀酰高丝氨酸的积聚，希望metA基因缺失带来O-乙酰基高丝氨酸(表3)的积聚量的提高。为了删除metA基因,进行FRT一步PCR操作。
为了构建metA缺失基因盒,进行PCR扩增，所用引物为序列70和序列71，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸1分钟，循环以上操作30回。
该PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，接着将得到的1.2kbp带的DNA进行纯化。将回收的DNA片段经电穿孔成E.coli W3-BTJ菌株与pKD46载体进行转化。将回收的菌株在含有氯霉素的LB平板介质中涂布，接着在37°C下在培养基中过夜。然后，显示抗性的菌株被选择。
采用选择的菌株作为模板利用序列70和序列71的引物在上述相同条件下进行PCR扩增。metA基因的删除通过在1.0%琼脂糖凝胶中确认大小为1.1kb的基因进行识别。然后该菌株用pCP20载体进行转化，并在LB介质中培养。最终构建出metA敲除（knock out）菌株，其中metA基因的大小在1.0%琼脂糖凝胶中在相同条件下通过PCR减至100kb。确认氯霉素标记物被消除。构建的菌株称为W3-BTJA。W3-BTJA菌株与pCJ-MeTXlme-CL载体进行转化并将得到的菌株称为W3-BTJA/pCJ-MetX-CL。该菌株在上述相同的方法下孵育，结果没有观测到O-琥珀酰高丝氨酸的积聚，但O-乙酰基高丝氨酸的产量相比较W3-BTJ显著地增加了大约20％。
<l-5>L-苏氨酸生产菌株的转化
蛋氨酸前体生产菌株通过与所述实施例<1-1>到<l-3>采用的E.coli CJM002(KCCM-10568)相同的方式构建,该L-苏氨酸分离于所需的蛋氨酸。构建的菌株分别称为CJM-BTJ,CJM-BTJ/pMetA-CL和CJM-BTJ/pCJ-MetA-CL。该metA基因敲除（knock-out）菌株还可以通 过<l-4-3>中采用CJM-BTJ菌株相同的方式进行构建，以及所得菌株被称为CJM-BTJA。
实施例2：发酵产生L-蛋氨酸前体
<2-l>瓶装培养基实验
为了检测实施例1中构建的菌株的蛋氨酸前体产量的能力,采用锥形瓶培养基操作。W3-BTJ、CJM-BTJ和W3-BTJ与metA和metX的表达载体进行转化在含有奇放线菌素的LB平板介质中31°C下孵育过夜。单菌落与含有奇放线菌素的LB介质3ml接种，随后在在31°C下孵育5小时。该培养溶液是在含有25ml的蛋氨酸前体产生介质的250ml锥形瓶中以200倍稀释,随后在31°C下培养,200rpm时间是64小时。采用以比较蛋氨酸前体产生能力(表2和表3)。结果是,在蛋氨酸前体生产菌株中蛋氨酸的产生能力显著增加，该蛋氨酸前体生产菌株由L-苏氨酸生产菌株制备分离于所需要的蛋氨酸。
[表1]用于蛋氨酸前体产物的瓶装介质混合物
[0115] [表2]由瓶装培养基得到的蛋氨酸前体(O-琥珀酰高丝氨酸)产物
[表3]由瓶装培养基得到的蛋氨酸前体(O-乙酰基高丝氨酸)产物
<2-2>大规模发酵
实施例1中的菌株显示了最高的蛋氨酸前体生产能力，被选作批量 生产蛋氨酸前体,其随后在5L发酵器中发酵。CJM-BTJ/pCJ-metA-CL或CJM-BTJA/pCJ-metXlme-CL接种在含有奇放线菌素的LB介质中,随后在31°C下孵育过夜。然后，单菌落与含有奇放线菌素的LB介质10ml接种，其在31°C下孵育5小时。该培养溶液在含有200ml的蛋氨酸前体种子介质的1000ml锥形瓶中稀释100倍,随后在31°C下培养,200rpm时间是3-10小时。该培养液在5L发酵器中接种，在接下来经分批补料（fed-batch）发酵中进一步培养50-100小时。在发酵液中该蛋氨酸前体的浓度经HPLC测量，结果显示在表5中。
[表4]用于蛋氨酸前体产物的发酵器介质混合物
[表5]发酵器中的蛋氨酸前体产物
实施例3：蛋氨酸转化酶产物
<3-l>衍生自E.coli的胱硫醚伽马合酶
克隆对衍生自E.coli的胱硫醚伽马合酶编码的metB基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用E.coli的染色体作为模板，所用引物为序列13和序列14，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作25回。
得到的DNA片段用Ncol/Hindlll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。得到的载体称为pCJ-MetB-CL，其原理图如图4所示。E.coli W3110用克隆的载体转化，然后在含有50μg/L of奇放线菌素的LB平板介质中培养，随后经菌落选择。该选择的菌落在含有50μg/L of奇放线菌素的3ml LB介质中接种，随后在37°C下孵育过夜。回收培育的细胞，用0.1M的磷酸钾缓冲液(pH7.5)冲洗干净，在200μl的磷酸钾缓冲液中悬浮,并用超声波降解法破碎5次间隔时间为30秒。该细胞溶解物在12,000rpm下离心分离10分钟并取所得的上清液采用Bio-Rad蛋白质定量溶液(BIO-Rad,USA)量化整个蛋白质的量。该蛋白表达通过SDS-PAGE识别。从细胞提取物中得到的上清液用于酶转化反应。
<3-2>O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶衍生于假单胞菌属（Pseudomonas sp.）
克隆对衍生自假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。作为假单胞菌属 （Pseudomonas sp.）微生物,Pseudomonas aeruginosa和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）被采用。
PCR扩增采用每一菌株的染色体作为模板，Pseudomonas aeruginosa时所用的引物为序列15和序列16以及恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）时所用的引物为序列17和序列18，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Pacl消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<1-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-3>衍生自假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶编码的metY基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用Pseudomonas aeruginosa的染色体作为模板，所用引物为序列19和序列20，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Pacl消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-4>衍生自谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）的胱硫醚合酶
克隆对衍生自谷氨酸棒杆菌的胱硫醚合酶编码的metB基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用谷氨酸棒杆菌的染色体作为模板，所用引物为序列21和序列22，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环如下操作30回。
得到的DNA片段用NcoI/HindШ消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-5>衍生自谷氨酸棒杆菌的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自谷氨酸棒杆菌的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用谷氨酸棒杆菌的染色体作为模板，所用引物为序列23和序列24，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下扩展2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/AvrⅡ消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-6>衍生自钩端螺旋体菌属（Leptospira sp.）的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自Leptospira meyeri的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶编码的metY基因，其可用于将作为蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用Leptospira meyeri的染色体作为模板，所用引物为序列25和序列26，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-7>衍生自Saccharomyces sp.的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶编码的met25基因,其可用于将作为蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的染色体作为模板，所用引物为序列27和序列28，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Pacl消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-8>衍生自色素杆菌属（Chromobacterium sp.）的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自青色素杆菌（Chromobacterium Violaceum）的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用青色素杆菌（Chromobacterium Violaceum）的染色体作为模板，所用引物为序列29和序列30，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-9>衍生自奴卡氏菌属（Nocardia sp.）的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自鼻疽诺卡菌（Nocardia Farcinica）的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用鼻疽诺卡菌（Nocardia Farcinica）的染色体作为模板，所用引物为序列31和序列32，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-10>衍生自博斯特属（Bradyrhizobium sp.）的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自鼻疽诺卡菌（Nocardia Farcinica）的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium Japonicum）的染色体作为模板，所用引物为序列33和序列34，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-l1>衍生自生丝单胞菌属（Hyphomonas sp.）的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自Hyphomonas Neptunium的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用Hyphomonas Neptunium的染色体作为模板，所用的 引物为序列35和序列36，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用BamHII/HindIII消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-12>衍生自Methylococcus sp.的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自甲基球菌（Methylococcus Capsulatus）的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用甲基球菌（Methylococcus Capsulatus）的染色体作为模板，所用的引物为序列37和序列38，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-13>衍生自Methylo杆菌属（Bacillus sp.）的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶
克隆对衍生自Methylobacillus Flagellatus的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用Methylobacillus Flagellatus的染色体作为模板，所用引物为序列39和序列40，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，操作以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-14>衍生自亚硝化单细胞菌属（Nitrosomonas sp.）的O-琥珀酰honioserine硫化氢解酶
克隆对衍生自Nitrosomonas Europaea的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶编码的metZ基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用Nitrosomonas Europaea的染色体作为模板，所用引物为序列41和序列42，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-15>衍生自Klesiella sp.的胱硫醚合酶
克隆对衍生自Klesiella Pneumoniae的胱硫醚合酶编码的metB基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用Klesiella Pneumoniae的染色体作为模板，所用的引物为序列43和序列44，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-16>衍生自杆菌属（Bacillus sp.）的胱硫醚合酶
克隆对衍生自枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）的胱硫醚合酶编码的metB基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）的染色体作为模板， 所用的引物为序列45和序列46，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/AvrⅡ消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-17>衍生自志贺氏菌属（Shigella sp.）的胱硫醚合酶
克隆对衍生自痢疾杆菌2457T（Shigella flexneri2457T）的胱硫醚合酶编码的metB基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用痢疾杆菌2457T（Shigella flexneri2457T）的染色体作为模板，所用的引物为序列47和序列48，如下;在94°C变性30个循环时间30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-18>衍生自Colwellia sp.的胱硫醚合酶
克隆对衍生自Colwellia Psychrerythraea的胱硫醚合酶编码的metB基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用Colwellia Psychrerythraea的染色体作为模板，所用的引物为序列49和序列50，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清夜，并用于酶转化反应。
<3-19>衍生自沙门氏菌属（Salmonella sp.）的胱硫醚合酶
克隆对衍生自Salmonella enterica serovar Paratyphi A的胱硫醚合酶编码的metB基因,其可用于将用作蛋氨酸前体的O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰基高丝氨酸转移为蛋氨酸。
PCR扩增采用Salmonella enterica serovar Paratyphi A的染色体作为模板，所用引物为序列51和序列52，如下;在94°C变性30秒,在55°C下退火30秒,在72°C下延伸2分钟，循环以上操作30回。
得到的DNA片段用Ndel/Avrll消化并克隆到用同样酶消化的pCL-CJl载体(CJ,韩国)。采用上述实施例<3-1>描述的相同的方法克隆的载体，得到细胞提取物的上清液，并用于酶转化反应。
<3-20>OSHS用作底物转化酶活性的比较
将实施例<3-l>到<3-19>得到的每种酶溶液的活性进行比较以选出最佳蛋氨酸转移酶。
首先,将0-琥珀酰高丝氨酸(Sigma,USA)溶解在0.1M的磷酸钾缓冲液(pH7.5)中得到浓度为3mM。将吡哆醛5'-磷酸盐(Sigma,USA)作为辅酶加入反应液中，得最后的浓度为10μM甲基硫醇(甲基硫醇,Tokyo Kasei Organic Chemicals,日本)作为另一种底物加入反应液中，得到浓度为2mM。将1ml反应液置于37℃中,加入每种酶溶液10μl(蛋白浓度:5mg/ml)。每隔5-10分钟收集100μl反应液，并加入900μl浓度为4mg/ml的DTNB(Sigma,USA)溶液。测量OD415以确认反应继续。
DTNB与甲基硫醇的SH基团反应并存在反应液中，并接着合成一种黄色物质。因此，不管反应是否继续，通过观察反应液中黄色物质的消失检测甲基硫醇向蛋氨酸的转化反应。
如图5所示,衍生自色素杆菌属（Chromobacterium sp.）的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶,衍生自诺卡氏菌属的O-琥珀酰高丝氨酸硫化 氢解酶,衍生自假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶显示出较高的酶活性。其它酶液显示了某种程度的活性，但它们的反应速度相对较慢。
每种酶与底物的反应性概括在表6中。完全反应（Upon completion）1小时,采用HPLC以确认蛋氨酸和琥珀酸最后的产量。结果显示在表7中。
<3-21>OAHS用作底物转移酶的活性比较
采用O-乙酰基高丝氨酸实施与上述实施例<3-20>进行相同的试验。O-乙酰基高丝氨酸是从发酵溶液的上清液中纯化的。采用与O-琥珀酰高丝氨酸用于试验时相同的反应液和酶溶液。如图6所示,衍生自Hypomononas sp.的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶,衍生自假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶,衍生自色素杆菌属（Chromobacterium sp.）的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和衍生自钩端螺旋体菌属（Leptospira sp.）的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶其它酶液显示了某种程度的活性，但它们的反应速度相对较慢。每种酶与底物的反应性概括在表6中。完全反应（Upon completion）1小时,采用HPLC以确认蛋氨酸和琥珀酸最后的产量。结果显示在表8中。
[表6]通过衍生自每种菌株中的酶O-琥珀酰高丝氨酸和O-乙酰基高丝氨酸的转化反应
[表7]通过每种酶由O-琥珀酰高丝氨酸得到蛋氨酸和琥珀酸的生产能力
[表8]通过每种酶由O-乙酰基高丝氨酸得到蛋氨酸和乙酸的产量
<3-22>对转移酶反馈抑制的识别
在蛋氨酸中是否存在反馈抑制通过与所述实施例<3-20>和<3-21>相同的方法予以识别。通过上述相同的方法制备的反应液以及通过在每一反应液中添加或不添加5g/L的蛋氨酸以进行相同的反应。在没有蛋氨酸时反应液的反应速度作为100%,基于它在蛋氨酸中保留的活性计算为%.结果显示在表9中。
结果是,衍生自假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶,衍生自诺卡氏菌属的O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和衍生自钩端螺旋体菌属(Leptospira sp.)的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的每种活性受到蛋氨酸的抑制，揭示了在存在蛋氨酸时那些酶的活性受到反馈系统的抑制。没有反馈系统的酶可用于进一步反应。推知上述实施例中受反馈系统抑制的酶可以用于其中的突变菌株分离自反馈系统的同样的反应中。
[表9]受蛋氨酸抑制的酶活性
<3-23>转化酶中的同源性比较
转化酶中的同源性用作转化反应与检测O-琥珀酰高丝氨酸和O-乙酰基高丝氨酸以及反馈抑制的相互反应相比较。
在这里所用的转化酶之间的同源性比较可以确认,与编码O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的metZs之间的同源性和编码O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的metYs之间的同源性相比metZs和metYs之间的同源性要高。关于上述实施例,编码O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的metZ存在许多例子，其并不显示反馈抑制性。然而，由于实施例中用到的所有的酶受反馈抑制，所以受抑制的编码O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶的metY可以被相关的高反馈系统识别出来。关于对O-琥珀酰高丝氨酸和O-乙酰基高丝氨酸的选择性，该metZ基因基团显示出对O-琥珀酰高丝氨酸的高选择性，而该metY基因基团对O-乙酰基高丝氨酸显示出高选择性。同时，衍生自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的metY以及衍生自青色素杆菌（Chromobacterium Violaceum）的metZ对二者的底物都显示出高的特异性选择。
这里用的所有酶的氨基酸序列由Clustal W program(DNAstar)进行排列。结果是，它们都具有被下列片段取代的域。因此，具有如下域的酶可以由同样的方法产生蛋氨酸。
域1:Y-(S,I,T,V)-R-X-X-(N,S)
域2:
(V,A,I)-(V,L,I)-D-N-X-(F,V,M,I)-X-(T,S)-(P,A)-X-(L,I)-(Q,C,V)-X-(P,G)-(L,F)-X-(L,M,H)-G-(A,V)-(D,H)
域3:
(S,A,G,P)-(P,A,V)-F-(N,D)-(A,S)-(W,F,Y)-X-X-X-(K,Q,R,S)-G-(L,M,V,I,M)-(E,K,D,R)-T-(L,M)-
域5:
(H,Y)-(P,A)-(A,S)-(T,S)-(T,M,Q)-(T,S)-H
域6:(V,I,L)-R-(V,I,L,F)-(S,A)-(V,I,T)-G-(L,I)-E-
实施例4;通过蛋氨酸转移酶的蛋氨酸转化反应
<4-l>转移酶的大量生产
为了大量生产在实施例2(2-2和2-8)中构建的产生蛋氨酸转移酶的菌株，该菌株在1L发酵器中培养。菌株(W3110)采用衍生自假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的metZ表达载体或衍生自生丝单胞菌属（Hyphomonas sp.）的metZ表达载体进行转移。所述转化后的菌株在含有奇放线菌素的LB平板介质上接种，随后在30-40°C的培养基中孵育过夜。得到的单一菌落在含有奇放线菌素的40ml的LB介质中接种5小时。将孵育的衍生自假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的metZ表达菌株和衍生自生丝单胞菌属（Hyphomonas sp.）的metZ表达菌株置于1L发酵器中在30-40°C,600-900rpm下孵育15–30小时。所用培养基的介质混合物如表10所示。
该蛋氨酸转移酶溶液通过对发酵溶液采用超声波降解法将细胞均匀化进行制备。
[表10]用于产生转移酶的介质混合物
[0244]
<4-2>蛋氨酸转化反应
通过采用衍生自假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的O-琥珀酰高丝氨酸转移酶溶液和衍生自生丝单胞菌属（Hyphomonas sp.）的O-乙酰基高丝氨酸转移酶溶液进行蛋氨酸转化反应，所述转移酶溶液是分别在实施例4(4-1)中在实施例2(2-2)中制备的O-琥珀酰高丝氨酸和O-乙酰基高丝氨酸的发酵溶液中制备的。
将0.1L的细胞分解酶培养基溶液加入到2.0L未去处细胞的蛋氨酸前体的发酵溶液中,并加入0.3L的15%Na-甲基硫醇以激发反应。2小时之后，回收发酵溶液并将细胞去除。进行HPLC以确认蛋氨酸的产生。结果显示在表11中。
[表11]
结果是,在传统方法中L-蛋氨酸产生浓度以低至10g/L产生，而以本发明的方法L-蛋氨酸可以大量生产浓度达到30g/L。
工业实用性
本发明的方法能够得到可选择的L-蛋氨酸产物，其领先于在传统的化学合成中D-蛋氨酸和L-蛋氨酸一并产生的方法,并且在不添加额外的工艺条件下得到有机酸的副产物，如琥珀酸和乙酸。
机译： 生产微生物的L-蛋氨酸前体和由L-蛋氨酸前体生产L-蛋氨酸和有机酸的方法
机译： 微生物生产L-蛋氨酸的前体和由L-蛋氨酸的前体生产L-蛋氨酸和有机酸的方法
机译： L-蛋氨酸前体的生产微生物以及由L-蛋氨酸前体生产L-蛋氨酸和有机酸的方法
