用于嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶基因同源表达的方法

摘要

用于嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶基因同源表达的方法，涉及嗜酸硫化芽孢杆菌。可以在嗜酸硫化芽孢杆菌中实现硫氧化还原酶基因的同源表达。还提供一种大肠杆菌和嗜酸硫化芽孢杆菌接合转移进行质粒转化的方法，该方法克服了大肠杆菌和嗜酸硫化芽孢杆菌生长条件的巨大差异。采用的菌株属于中等嗜热菌的嗜酸硫化芽孢杆菌，具有潜在的开发应用价值。首次在嗜酸硫化芽孢杆菌中实现了硫氧化还原酶基因的同源表达。

说明书

技术领域

本发明涉及嗜酸硫化芽孢杆菌，尤其是涉及用于嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶基因同 源表达的方法。

背景技术

微生物浸矿是指借助某些微生物的催化作用，使矿石中金属溶解的湿法冶金过程，它特 别适合于处理贫矿、废矿、表外矿及难采、难选、难冶矿的堆浸和就地浸出，具有设备简单、 操作方便、成本低、环境友好等优点。

根据生长的最适温度范围的不同可将常见浸矿微生物分为三种，即嗜中温细菌 (Mesophiles)、中等嗜热细菌(Moderate thermophiles)和极端嗜热细菌(Extreme thermophiles)。

中等嗜热细菌最适生长温度为45～50℃，由于有坚固的细胞壁，因此能耐受较高的矿浆 浓度。研究表明，硫化芽孢杆菌属(Sulfobacillus)能在较高温度下氧化Fe²⁺和硫化矿自养生长， 有坚固的细胞壁，能耐受较高的矿浆浓度和较高浓度的金属离子，因此该菌属在从硫化矿提 取金属特别是从难选冶金矿回收金属方面展现了潜在的应用前景([1]Golovacheva RS, karavailo GI.Sulfobacillus-a new genus of spore-forming thermophilic bacteria.Microbiology, 1979,48:658-665;[2]Norris PR,Marsh RM,Lindstrom EB.Growth of mesophilic and  thermophilic acidophilie bacteria on sulfur and tetrathionate.Biotechnol.Appl.Bioc.,1986,8: 318-329.)。

生物浸矿微生物具有生长缓慢、难以在固体平板上培养等特点，因此对它们的遗传操作 十分困难，导致对这类微生物的分子生物学研究一直处于比较落后的局面。一些嗜酸氧化亚 铁流杆菌(A.ferrooxidans)的基因在大肠杆菌(E.coli)里进行了异源克隆表达。但是受制于分子 操作系统的局限，在浸矿微生物里同源表达基因或进行基因敲除的报道寥寥无几。电转化和 接合转移是是比较常用基因转化方法。1992年，Kusano等人([3]Kusano T,Sugawara K,Inoue  C,Takeshima T,Numata M,Shiratori T.Electrotransformation of Thiobacillus ferrooxidam with  Plasmids Containing a mer Determinant.J.Bacteriol.,1992,174(20):6617-6623.)尝试用电转化的 方法将质粒转移到A.ferrooxidans中，但在被检测的30株转化子菌株中只有一株获得成功， 并且转化效率极低。因此，在此后的几个成功报道的转化案例中都是使用接合转移的方法进 行的。1994年，彭基斌等([4]Peng JB,Yan WM,Bao XZ.Plasmid and transposon transfer to  Thiobacillus ferrooxidans.J.Bacteriol.,1994,176:2892-2897.)首次在大肠杆菌(E.coli)和嗜酸氧 化亚铁流杆菌(A.ferrooxidans)之间建立了接合转移系统，将外源质粒成功转入。基于这个系 统，他([5]Peng JB,Yan WM,Bao XZ.Expression of Heterogenous Arsenic Resistance Genes in  the Obligately Autotrophic Biomining Bacterium Thiobacillus ferrooxidans.Appl.Environ.Microb., 1994,60(7):2653-2656.)又成功实现了异源抗砷基因在A.ferrooxidans中的表达并提高了A. ferrooxidans的抗砷能力，获得了高效浸矿工程菌。2011年，Liu Wei等人([6]Liu W,Lin JQ,Pang  X,Cui S,Mi S,Lin JQ.Overexpression of Rusticyanin in Acidithiobacillus ferrooxidans  ATCC19859Increased Fe(II)Oxidation Activity.Curr.Microbiol.,2011,62:320-324.)以pJRD215 质粒为载体，利用E.coli SM10的接合转移作用将A.ferrooxidans ATCC19859的铜蓝蛋白基 因在其自身进行同源表达，获得Fe²⁺离子氧化活性增强的浸矿突变菌株。

尽管人们在嗜酸氧化亚铁流杆菌(A.ferrooxidans)中进行了基因同源表达的尝试，然而在 嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)中进行基因同源表达还未见报道。

本申请人在申请号201110026855.8的中国专利申请中提供了用于硫氧化还原酶基因的同 源表达的嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY，该菌株从太平洋深海热液口 （12.2`29``N，104.2`01``W，水深3083米）分离到，已于2010年8月16日保藏于中国典型 培养物保藏中心（地址：中国.武汉.武汉大学），保藏编号为CCTCC NO：M2010203。

该菌为短杆状，大小为（0.3～0.5）μm×（2.0～2.5）μm，革兰氏阳性菌，最适生长温度 为50℃，最适生长pH值1.8。该菌既能利用亚铁、单质硫自养生长，也能够利用酵母粉、 葡萄糖、蛋白胨和甘油等有机物异养生长。以亚铁或单质硫为能源生长时，添加少量酵母提 取物，细菌更易生长。此外，嗜酸硫化芽孢杆菌TPY也能氧化黄铜矿和黄铁矿。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶基因同源表达的方法。

本发明的另一目的在于利用所述嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶基因同源表达的方法表 达硫氧化还原酶。

本发明所述用于嗜酸硫化芽孢杆菌硫氧化还原酶基因同源表达的方法包括以下步骤：

1）从嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY的基因组GenBank Accession  Number为CP002901，克隆硫氧化还原酶基因sor，在基因组中的标签为0405，硫氧化还原 酶氨基酸序列为：

MPVPYIAVNKARVLNAPSSFETFTSVGPKVCMVTANHEGFVGFQNHVQVGVFPMGGRYG  AAKMDMHEELNPIGIVQYTMWRHWEDHEAMHYENFDSIFRLCSQCLNMVVEGPWEPLYE  IVAHDLPENVSMTDVPAALGAAWMAGQPVPAVSLPYGQRIVAASDHTVIPGREKDFEQAI  VDVMTAFKKAPGFLGYMVMKQIGASAIGAMQLTPQGIHQALQTRGDNPPRDKEGNFQPM  QAHSSPQEYVVHMEWADMNSAMMGISRVVVNHKMRMIHDRVLETVLKGPYVTLWNPIM  EDTSWREYLHS；

将获得的硫氧化还原酶基因sor克隆到表达载体pTrc99A（购自金维克(中国)生命科学技 术中心）中构建质粒pTrc99A-sor；所述嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY是从 太平洋深海热液口（12.2`29``N，104.2`01``W，水深3083米）分离到，已于2010年8月16 日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国.武汉.武汉大学），保藏编号为CCTCC No： M2010203（参见本申请人的在先专利申请，申请号为CN201110026855.8）；

2）从质粒pEx18Tc(参见文献：Hoang TT,Karkhoff-Schweizer RR,Kutchma AJ,Schweizer  HP.A broadhost-range Flp-FRT recombination system for site-specific excision of  chromosomally-located DNA sequences:application for isolation of unmarked Pseudomonas  aeruginosa mutants.Gene,1998,212:77-86.)克隆接合转移元件oriT连入pTrc99A-sor构建表达 载体pTrc99A-sor-oriT，将构建好的重组质粒pTrc99A-sor-oriT转化至大肠杆菌S17-1(E.coli  S17-1)中,以构建供体菌E.coli S17-1(pTrc99A-sor-oriT)；

3）37℃下将供体菌和嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY在接合培养基上 共培养，将质粒pTrc99A-sor-oriT接合转移到嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY 中，利用氨苄青霉素筛选工程菌嗜酸硫化芽孢杆菌TPY-SOR，将该工程菌在以Fe₂SO₄为能 源的SA液体培养基中50℃振荡培养至对数期，利用Western Blot检测目的蛋白SOR的表达 情况。

在步骤2）中，所述oriT元件来源于质粒pEx18Tc；所述将构建好的重组质粒 pTrc99A-sor-oriT转化至大肠杆菌S17-1(E.coli S17-1)中的方法可采用氯化钙（CaCl₂）法。

在步骤3）中，所述工程菌嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY-SOR已于2013 年6月7日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国.武汉.武汉大学），保藏编号为CCTCC No：M2013254；所述接合培养基由以下A部分、B部分和C部分组成，所述A部分为 Na₂S₂O₃·5H₂O（1～5）g溶于20mL蒸馏水；所述B部分为(NH₄)₂SO₄（4～8）g、KCl（0.1～ 0.5）g、MgSO₄·7H₂O（0.7～1.5）g、酵母粉（0.5～3）g溶于500mL蒸馏水中，后用H₂SO₄ 将pH值调节至4.8；所述Ｃ部分为（8～15）g Sigma公司生产的Gum溶于480mL蒸馏水； A部分过滤除菌，B部分与C部分121℃高温高压灭菌20min，待B部分与C部分冷却到 80℃左右时，将A部分、B部分和C部分混合，即得接合培养基；

所述以Fe₂SO₄为能源的SA液体培养基的组成如下：(NH₄)₂SO₄3.0g、MgSO₄·7H₂O0.5g、 K₂HPO₄0.5g、KCl0.1g、Ca(NO₃)₂0.01g、酵母提取物0.2g、蒸馏水1L，使用H₂SO₄调节 pH至1.8，121℃高温高压灭菌，再加入FeSO₄·7H₂O（采用0.22μM滤膜过滤除菌）使其 终浓度为13.9g/L，pH调至1.8。

与现有技术相比，本发明的突出优点在于，它可以在嗜酸硫化芽孢杆菌中实现硫氧化还 原酶基因的同源表达。此外，本发明还提供了一种大肠杆菌和嗜酸硫化芽孢杆菌接合转移进 行质粒转化的方法，该方法克服了大肠杆菌和嗜酸硫化芽孢杆菌生长条件的巨大差异。大肠 杆菌生长条件是LB培养基、pH7.0及37℃；而嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus) TPY的生长条件无机盐基础培养基SA培养基以Fe²⁺或S提供代谢能源，pH1.8、50℃。

本发明采用的菌株属于中等嗜热菌的嗜酸硫化芽孢杆菌，具有潜在的开发应用价值。

本发明首次在嗜酸硫化芽孢杆菌中实现了硫氧化还原酶基因的同源表达。

附图说明

图1是硫氧化还原酶表达载体pTrc99A-sor-oriT的结构示意图。

图2是基因工程菌嗜酸硫化芽孢杆菌TPY-SOR同源表达硫氧化还原酶的Western Blot检 测结果。在图2中，M：PageRuler预染蛋白分子量标准；1泳道：嗜酸硫化芽孢杆菌TPY 全菌裂解液；2,3泳道：嗜酸硫化芽孢杆菌TPY-SOR全菌裂解液。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明。

实施例1、硫氧化还原酶表达载体pTrc99A-sor-oriT的构建

以嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY的全基因组(GenBank Accession  Number:CP002901)为模板，以pTrc99A_sor_fwd和pTrc99A_sor_rev为引物扩增硫氧化还原 酶基因sor片段（在基因组中的标签为0405），该对引物所要扩增的目的片段长957bp，包括 SOR蛋白的编码基因以及编码基因上游的Shine-Dalgarno序列，还有六个组氨酸标签和终止 密码子。其中上游引物pTrc99A_sor_fwd含有EcoRI酶切位点，下游引物pTrc99A_sor_rev含 有BamHI酶切位点。引物序列如下：

上游引物pTrc99A_sor_fwd：5’-CGGAATTCCTGGAGATGAAGATACCTATGCCCGT  ACCGTACA T-3’（下划线标注为EcoRI酶切位点）；

下游引物pTrc99A_sor_rev：5’-CGGGATCCTTAGTGATGATGATGATGATGTGAGT  GCAAATACTCTC-3’（下划线标注为BamHI酶切位点和六个组氨酸标签）。

扩增条件如下：预变性94℃5min，然后变性94℃30s，退火61℃30s，延伸72℃ 1min。完成30个循环后，72℃延伸10min。

将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳后利用胶回收试剂盒回收目的条带，用EcoRI和BamHI 双酶切，与同样用这两个酶双酶切的质粒pTrc99A进行连接，构建载体pTrc99A-sor。尔后利 用引物pTrc99A_oriT_fwd和pTrc99A_oriT_rev从质粒pEx18Tc克隆oriT元件，也连入 pTrc99A-sor多克隆位点，构建质粒pTrc99A-sor-oriT。引物序列如下：pTrc99A_oriT_fwd： 5’-CGGGATCC CTAGAGTCGATCTTCGCCAG-3’（下划线标注为BamHI酶切位点）； pTrc99A_oriT_rev：5’-CCAAGCTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTAC-3’（下划线标注为 HindIII酶切位点）。引物扩增程序同上。硫氧化还原酶表达载体pTrc99A-sor-oriT的结构示意 图如图1所示，该质粒大小为6kb，含有pBR322ori元件、AmpR氨苄抗性基因和AmpR  promoter，同时含有LacIq基因、连入的sor基因和oriT元件，多克隆位点含有EcoRI、BamHI 及HindIII等酶切位点，多克隆位点前面是trc promoter。

实施例2、嗜酸硫化芽孢杆菌TPY基因工程菌的构建

硫氧化还原酶表达载体pTrc99A-sor-oriT采用氯化钙法转化E.coli S17-1构建供体菌E. coli S17-1(pTrc99A-sor-oriT)，将E.coli S17-1(pTrc99A-sor-oriT)用LB液体培养基37℃振荡 培养至对数中期，离心收集菌体，用菌体洗涤液洗涤三次以清除残存的LB培养基，避免培 养基中的有机质对嗜酸硫化芽孢杆菌的毒性。菌体洗涤液配置如下：(NH₄)₂SO₄4.5g、KCl0.15 g、MgSO₄·7H₂O0.75g溶于1L蒸馏水中，用H₂SO₄将pH值调节至4.8。嗜酸硫化芽孢杆菌 (Sulfobacillus acidophilus)TPY在以Fe₂SO₄为能源的SA液体培养基中50℃振荡培养至对数 期，离心收集菌体。所收集的菌体用菌体洗涤液洗涤至没有明显的高铁沉淀存在。用菌体洗 涤液重悬供体菌和受体菌至相同密度，然后按2:1体积比混合后取适量的菌悬液（0.1～0.2mL） 加到硝酸纤维素滤膜上（直径6cm、孔径0.45μm），滤膜置于接合平板上37℃培养72h左 右，使之接合。取滤膜用1mL菌体洗涤液洗下硝酸纤维素滤膜上的菌体，接种到含有100 μg/mL氨苄青霉素的以Fe₂SO₄为能源的SA液体培养基中，同时相同条件下培养嗜酸硫化芽 孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY并观察。将在抗性培养基上生长的嗜酸硫化芽孢杆菌继 续在抗性培养基上传代培养，最终获得嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY同源 表达硫氧化还原酶基因sor的突变株嗜酸硫化芽孢杆菌TPY-SOR。

实施例3、嗜酸硫化芽孢杆菌TPY-SOR同源表达硫氧化还原酶的检测

利用Western Blot检测同源表达的硫氧化还原酶以区别于嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus  acidophilus)TPY本身的硫氧化还原酶。将利用Ni柱纯化制备好的蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳，然后电泳后的聚丙烯酰胺凝胶浸泡于电转缓冲液中平衡5min，裁剪与凝胶大小相同的 硝酸纤维素膜（PVDF），在甲醇中浸泡5min，将在电转移缓冲液中浸泡过的海绵与滤纸取出 来，在按照阳极、海绵、滤纸、硝酸纤维素膜、聚丙烯酰胺凝胶、滤纸、海绵、阴极顺次叠 放成电转移三明治，100V的恒压，4℃电转1h。然后把膜取出来，用TBST溶液洗涤两次， 每次5min，放在封闭液中，放在脱色摇床上轻轻摇动，封闭1h以上，然后转移膜用TBST 溶液洗涤两次，每次5min。再放入含有罗氏公司的一抗鼠抗His标签单克隆抗体的封闭液中， 放在脱色摇床上轻轻摇动，反应1h，再用TBST漂洗2次，后转移膜至含有Thermo公司的 二抗polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/HRP的封闭液中，放在脱色摇床上轻轻摇 动，反应1h。用TBST漂洗3～5次，（NBT/BCIP）显色10min。Western Blot检测结果如图 2所示，在嗜酸硫化芽孢杆菌TPY-SOR全菌裂解液中可见一条预期大小的反应条带（2，3 泳道），而在嗜酸硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus acidophilus)TPY全菌裂解液中未见相应的反应 条带（1泳道）。