一种基于微流体构图技术的单细胞阵列培养玻璃芯片及其制备方法

摘要

本发明公开了一种基于微流体构图技术的单细胞阵列培养玻璃芯片及其制备方法，属于生物微机电系统领域。该芯片在玻璃基底4上有一层PHEMA水凝胶图形2，PHEMA水凝胶图形2将玻璃基底4表面划分为多个的矩形细胞生长区域1，用于产生单细胞阵列。其制备过程是：通过PDMS弹性印章在玻璃片表面图形化PHEMA。本发明的有益效果是：采用稳定的表面化学修饰，在玻璃表面图形化抗细胞黏附的水凝胶，构成包含细胞黏附和抗细胞黏附的图形化表面，用于单细胞阵列培养；制备过程简单易操作。将该芯片应用于细胞培养中，可获得单细胞生长阵列，将为基础细胞生物学研究提供一种新型的工具。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于微流体构图技术（microfluidic patterning，uFLP）实现的单细 胞阵列培养玻璃芯片结构及制备方法，属于生物微机电系统（Bio-MEMS）领域。

背景技术

细胞培养是生物学、医学、新药研发等领域最重要的基础科学之一。在过去的两 百多年间，细胞培养在疫苗研发、遗传分析、生物学研究等方面做出了巨大贡献。随 着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许 多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力。常规的贴壁细胞的培养方式很多，以细胞 群体培养为特点，如细胞培养瓶、细胞培养皿、细胞多孔培养板等。然而，上述的细 胞培养方式均具有以下缺点：一、不能观察单个或数个细胞对细胞微环境的即时反应； 二、在细胞群体培养的条件下，分析得到的结果是一种平均指标，导致细胞间一些微 弱但非常重要的反应被掩盖；三、不能集成到新型的微型分析平台，实现针对细胞反 应的长期检测、分析等功能。

近年来，因微细加工技术可获得与生物大分子相近的特征尺寸，在生物研究和生 物医学领域应用日趋广泛。同时，微细加工技术也为单细胞培养提供了新的实现途径。 基于微细加工技术实现单细胞的培养已有相关探索研究，主要有以下几种方法：一、 细胞培养基底进行表面化学修饰；二、在细胞培养基底实现物理阻隔；三、微流控技 术。其中，表面化学修饰构建单细胞图形是研究较多的一类方法。结合不同的生物分 子及特性基团，如特异性蛋白、细胞促粘附因子、多糖、烷硫醇、SAMs、聚合电解质 等，在表面实现生物分子及特性基团的图形化，诱导产生单细胞图形。

微流体构图技术是一种基于表面化学修饰实现细胞微图形化的重要技术：将制作 好的弹性印章贴合于基底表面，通过自密闭作用形成微通道网络，用于表面化学修饰 的材料借助微通道网络在基底表面形成图形化薄层，使接种后的细胞在限定的区域内 生长。微流体构图技术具有加工过程简单易行、化学修饰材料密度便于控制等优点， 但它主要用于形成连续分布的细胞图形，限制了该技术在单细胞培养领域的进一步应 用。Sinclair J等人（Sinclair J,Salem A K.Rapid localized cell trapping on biodegradable  polymers using cell surface derivatization and microfluidic networking[J].Biomaterials, 2006,27(9):2090-2094.）利用微流体构图技术在可生物降解材料聚乳酸-聚(乙二醇)表 面嫁接抗生物素蛋白，形成聚乳酸-聚(乙二醇)-抗生物素蛋白图形化的表面，细胞选择 性的生长在有抗生物素蛋白的条带区域，形成了条带状细胞图形。微流体构图技术中 常用微通道网络是直通道，使得促进细胞黏附的化学修饰材料在基底表面构成条带状 图形，难以控制细胞在条带状修饰材料表面的个数及位置，不能实现单细胞阵列培养。

发明内容

现有技术中存在如下问题：基于微流体构图技术对细胞生长基底进行促进细胞黏 附的化学修饰，所获得的是与微通道网络平面结构相同的条带状修饰图形，不能形成 封闭区域，因此，该方法获得的表面修饰不能限制细胞的生长位置和形状，不能获得 单细胞阵列。

本发明的重点是：新颖的微通道网络平面结构，结合抗细胞黏附的修饰材料，通 过微流体构图技术可获得限制单个细胞的生长位置和形状的细胞生长区域。

本发明的目的是：提出了一种基于微流体构图技术可实现单细胞阵列培养的细胞 阵列培养玻璃芯片结构及制备方法。

本发明的技术方案是：

一种可实现单细胞阵列培养玻璃芯片结构：

在玻璃基底4上有一层PHEMA（poly(2-hydroxyethyl methacrylate)，Poly-HEMA, 聚甲基丙烯酸二羟乙酯）水凝胶图形2。PHEMA水凝胶图形2将玻璃基底4表面划 分为多个的矩形细胞生长区域1，用于产生单细胞阵列。具体结构尺寸如下：矩形细 胞生长区域1的边长尺寸分别为a,b，相邻两个细胞生长区域1中心 线之间的横向间距为w1，相邻两个细胞生长区域1中心线之间的 纵向间距为w2，PHEMA水凝胶图形2的水凝胶图形凸起的线宽 为c，高度为e，水凝胶的线条宽度为d， 两条相邻PHEMA水凝胶间最窄的距离为h，其中为待培养细胞3的平均直径。

一种可实现单细胞培养的细胞阵列培养玻璃芯片制备方法：

步骤1：准备干净的玻璃片。清洗后，干燥备用；

步骤2：准备合适浓度的PHEMA乙醇溶液；

步骤3：通过压印复形的方法制作PDMS弹性印章，所述PDMS弹性印章上具有 微通道网络，所述微通道网络的平面结构与所制备的玻璃芯片上的PHEMA水凝胶图 形2一致；

步骤4：在玻璃片表面图形化PHEMA：将PDMS弹性印章与玻璃可逆键合，在 PDMS弹性印章微通道入口处添加PHEMA乙醇溶液，完成微通道内溶液的填充，将 键合后的PDMS弹性印章与玻璃放在干燥箱内加热，直至乙醇完全挥发；去掉PDMS 弹性印章，在玻璃表面获得PHEMA粉末图形；

步骤5：将表面具有图形化PHEMA粉末的玻璃片浸泡于纯水，得到具有PHEMA 水凝胶图形的玻璃表面，即所述的单细胞培养的单细胞阵列培养玻璃芯片。

本发明的有益效果是：突破了已有的基于微流体构图技术不能实现单细胞培养的 限制，提出了一种用于单细胞培养的单细胞阵列培养玻璃芯片结构及制备方法。采用 稳定的表面化学修饰，在玻璃表面图形化抗细胞黏附的水凝胶，构成包含细胞黏附和 抗细胞黏附的图形化表面，用于单细胞阵列培养。

本发明提出的单细胞阵列培养芯片制备过程简单易操作，以玻璃作为基底材料， 不需要复杂的表面处理过程；芯片中设计的图形结构简单，硅模版的加工可以通过成 熟的微加工工艺完成，参数便于控制，PDMS印章可以通过重复复制硅模板获得，具 有较高的经济性。将该芯片应用于细胞培养中，可获得单细胞生长阵列，将为基础细 胞生物学研究提供一种新型的工具。

附图说明

图1为本发明提出的单细胞阵列培养玻璃芯片的芯片效果图

图2为本发明提出的单细胞阵列培养玻璃芯片的PDMS印章效果图

图3为本发明提出的单细胞阵列培养玻璃芯片结构示意图

图4为实施例中芯片制备过程中所使用的硅模板加工工艺路线

图5为实施例中单细胞阵列培养玻璃芯片的制作工艺路线

图中：1.细胞生长区域，2.PHEMA水凝胶图形，3.细胞，4.玻璃基底

具体实施方式

实施例1：

本实施例中的芯片用于培养单个成骨细胞MC3T3-E1来进行细胞接触性连接研 究。MC3T3-E1平均直径为20μm。

参阅图1～图3。本实施例中将单细胞阵列培养玻璃芯片用于MC3T3-E1细胞培养。 其中，单细胞阵列培养玻璃芯片的结构尺寸如下：细胞生长区域1的尺寸 a＝b＝50μm；相邻两个细胞生长区域1中心线之间的横向间距w1＝70μm；相邻两 个细胞生长区域1中心线之间的纵向间距w2＝80μm；PHEMA水凝胶图形2的线宽 d＝20μm，水凝胶图形凸起部分尺寸c＝e＝20μm；两条相邻PHEMA水凝胶间最窄 的距离h＝20μm。

本实施例中基于微流体构图技术实现单细胞阵列培养玻璃芯片制备方法，采用 MEMS技术及微流体构图技术完成，具体包括如下步骤：

步骤1：准备干净的玻璃片。清洗方法：玻璃片用洗洁精清洗干净，烘干；玻璃 片在重铬酸钾溶液浸泡时间长于12h；大量水冲洗，干燥备用。

步骤2：准备浓度为50%的PHEMA乙醇溶液。按照质量浓度（即溶质质量/溶剂 体积）为50%进行配制，称量一定量的PHEMA白色粉末和分析纯的乙醇，进行混合， 静置两天后，得到澄清透明的PHEMA乙醇溶液。

步骤3：通过压印复形的方法制作PDMS弹性印章：

首先准备混合均匀PDMS。按照质量比10：1配置PDMS预聚物及交联剂，混合 均匀后抽真空脱气4～5次，在混合溶液中肉眼观察不到气泡为止。

将上述准备好的PDMS缓缓倾倒于加工好的硅模板上，若PDMS液体中再次出现 气泡，重复脱气一次；将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中加热80℃1h，使 PDMS发生交联反应，固化。从硅模板上剥离PDMS，得到具有微通道网络的PDMS 弹性印章，所述微通道网络的平面结构与所制备的玻璃芯片上的PHEMA水凝胶图形 2一致；

步骤4：在玻璃表面图形化PHEMA。基于PDMS材料的自密闭特性，使PDMS 弹性印章与玻璃可逆键合，使用移液枪或胶头吸管在微通道入口处添加一定量 PHEMA乙醇溶液，利用毛细力驱动溶液自动填充，整个过程完成需要数分钟；溶液 填充完成后，将PDMS弹性印章与玻璃放在干燥箱内加热100℃15min，直至乙醇完 全挥发；去掉PDMS弹性印章，在玻璃表面获得PHEMA粉末图形。

步骤5：获得单细胞阵列培养玻璃芯片。将表面具有图形化PHEMA粉末的玻璃 片浸泡于纯水中12h以上，得到具有PHEMA水凝胶图形的玻璃表面，即得到所述基 于微流体构图技术实现的单细胞阵列培养玻璃芯片。

实施例2：

本实施例中的芯片用于培养人乳腺上皮细胞HMEC来进行细胞的生长特性研究。 HMEC平均直径为45μm。

参阅图1～图3。本实施例中将单细胞阵列培养玻璃芯片用于HMEC细胞培养。其 中，单细胞阵列培养玻璃芯片的结构尺寸如下：细胞生长区域1的尺寸a＝b＝80μm； 相邻两个细胞生长区域1中心线之间的横向间距w1＝120μm；相邻两个细胞生长区域 1中心线之间的纵向间距w2＝140μm；PHEMA水凝胶图形的线宽d＝40μm，水凝胶 图形凸起部分的尺寸c＝e＝40μm；两条相邻PHEMA水凝胶间最窄的距离 h＝20μm。

本实施例中基于微流体构图技术实现单细胞阵列培养玻璃芯片制备方法，采用 MEMS技术及微流体构图技术完成，具体包括如下步骤：

步骤1：准备干净的玻璃片。清洗方法：玻璃片用洗洁精清洗干净，烘干；玻璃 片在重铬酸钾溶液浸泡时长大于12h；大量水冲洗，干燥备用。

步骤2：准备浓度为50%的PHEMA乙醇溶液。按照质量/体积比=50%，称量一定 量的PHEMA白色晶体和分析纯的乙醇，进行混合，静置两天后，得到澄清透明的 PHEMA乙醇溶液。

步骤3：通过压印复形的方法制作PDMS弹性印章：

首先准备混合均匀PDMS。按照质量比10：1配置PDMS预聚物及交联剂，混合 均匀后抽真空脱气4～5次，在混合溶液中肉眼观察不到气泡为止。

将上述准备好的PDMS缓缓倾倒于加工好的硅模板上，若PDMS液体中再次出现 气泡，重复脱气一次；将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中加热80℃1h，使 PDMS发生交联反应，固化。从硅模板上剥离PDMS，得到具有微通道网络的PDMS 弹性印章，所述微通道网络的平面结构与所制备的玻璃芯片上的PHEMA水凝胶图形 2一致；

步骤4：在玻璃表面图形化PHEMA。基于PDMS材料的自密闭特性，使PDMS 弹性印章与玻璃可逆键合，使用移液枪或胶头吸管在微通道入口处添加PHEMA乙醇 溶液，利用毛细力驱动溶液自动填充，整个过程完成需要数分钟；溶液填充完成后， 将PDMS弹性印章与玻璃放在干燥箱内加热100℃15min，直至乙醇完全挥发；去掉 PDMS弹性印章，在玻璃表面获得PHEMA粉末图形。

步骤5：获得单细胞阵列培养玻璃芯片。将表面具有图形化PHEMA粉末的玻璃 片浸泡于纯水中12h以上，得到具有PHEMA水凝胶图形的玻璃表面，即得到所述基 于微流体构图技术实现的单细胞阵列培养玻璃芯片。