一种治疗肺部感染性疾病的药物及其应用

摘要

一种治疗肺部感染性疾病的药物及其应用，属于药物技术领域。该药物包含从四方蒿或风轮菜提取的总黄酮、新橙皮苷二氢查耳酮、柚皮苷二氢查耳酮、7-甲氧基汉黄芩素、6,7-二甲氧基黄芩素或其药学上可接受的盐中任意1种物质或任意2种以上物质的组合物。本发明一方面提供了一种治疗肺部感染性疾病的药物，该药物具有抗病毒，抑制病毒诱导的肺损伤、肺水肿、肺炎，降低支气管黏液分泌等药理作用，本发明另一方面确定了一种治疗肺部感染性疾病的药物的应用，其可作为治疗急性肺炎、病毒性肺炎、肺水肿或支气管炎药物使用。

说明书

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及一种治疗肺部感染性疾病的药物及其应用。

背景技术

肺部感染在呼吸系统疾病或感染性疾病中占有较大的比重。由于目前医疗条件的限制，医源性及续发性肺部感染的几率日趋严重。尽管近年来抗生素和其它抗微生物药物的应用，有效控制了病情的发展，但随着病原微生物基因变异速度的加快及耐药菌（如超级细菌）的出现，以及患者药敏性的降低，肺部感染总体发病率和死亡率并无明显降低，且抗生素类药物的长期使用，具有较为明显的毒副作用。天然药物在治疗肺部感染性疾病方面具有一定的优势，可通过多途径，多靶点而发挥疗效。

四方蒿Elsholtzia blanda Benth.或风轮菜Clinopodium chinense（Benth.）O.Kuntze [Calamintha Chinensis Benth.]为传统中药材，具有疏风清热、解毒消肿的功效，临床用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、肝炎、肠炎等症。在江浙地区资源丰富。但其药效物质及药理作用尚不清楚。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种治疗肺部感染性疾病的药物及其应用的技术方案。

所述的一种治疗肺部感染性疾病的药物，其特征在于包含从四方蒿或风轮菜提取的总黄酮、新橙皮苷二氢查耳酮、柚皮苷二氢查耳酮、7-甲氧基汉黄芩素、6,7-二甲氧基黄芩素或其药学上可接受的盐中任意1种物质或任意2种以上物质的组合物。

所述的一种治疗肺部感染性疾病的药物，其特征在于活性成分占总重量的1‰～99.9％，所述的活性成分为从四方蒿或风轮菜提取的总黄酮、新橙皮苷二氢查耳酮、柚皮苷二氢查耳酮、7-甲氧基汉黄芩素、6,7-二甲氧基黄芩素或其药学上可接受的盐。

所述的一种治疗肺部感染性疾病的药物在制备治疗肺部感染性疾病药物中的应用。

所述的一种治疗肺部感染性疾病的药物的应用，其特征在于所述的肺部感染性疾病为急性肺炎、病毒性肺炎、肺水肿或支气管炎。

本发明一方面提供了一种治疗肺部感染性疾病的药物，该药物具有抗病毒，抑制病毒诱导的肺损伤、肺水肿、肺炎，降低支气管黏液分泌等药理作用，本发明另一方面确定了一种治疗肺部感染性疾病的药物的应用，其可作为治疗急性肺炎、病毒性肺炎、肺水肿或支气管炎药物使用。

附图说明

图1 药物对病毒感染小鼠肺损伤保护作用的HE染色病理观察图（放大倍数×200）

图2药物对病毒感染小鼠肺组织AQP5蛋白表达的影响结果图（放大倍数×200）

图3 药物对病毒感染小鼠气管及肺组织MUC5AC蛋白表达的影响结果图（放大倍数×200）。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：四方蒿或风轮菜总黄酮、新橙皮苷二氢查耳酮、柚皮苷二氢查耳酮、7-甲氧基汉黄芩素、6,7-二甲氧基黄芩素的制备

1）将5Kg四方蒿或风轮菜根茎粉碎后，加药材质量10倍的水提取，浓缩至流浸膏（含水量12％左右），趁热加浸膏体积5倍量的95％乙醇醇沉；

2）减压浓缩乙醇提取物，至流浸膏（含水量12％左右），加浸膏体积3倍量的蒸馏水混悬，以乙酸乙酯萃取4－5次，每次用量为混悬液体积3倍量的乙酸乙酯，减压或真空干燥浓缩乙酸乙酯提取物至干浸膏，即得到四方蒿或风轮菜总黄酮；

3）取20g四方蒿或风轮菜总黄酮湿法装柱，进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯和石油醚（溶剂比例1：20→10：1）或乙酸乙酯和氯仿（溶剂比例1：5→5：1）洗脱；

4）硅胶薄层检测层析流份，每50mL收集一流份，以石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸（7 : 3 : 0.5）为展开剂，经碘熏后日光下检识，具有相同斑点的流份合并，浓缩至干，分别得到新橙皮苷二氢查耳酮、新柚皮苷二氢查耳酮、7-甲氧基汉黄芩素和6,7-二甲氧基黄芩素。

实施例2：药效试验

1  材料与方法

利巴韦林泡腾片（批号：091210），浙江艾康礼德制药有限公司。

甲型流感病毒小鼠肺适应株A/PR/8/34，病毒效价为1 : 512。本实验在浙江省医学科学院ABSL2生物安全实验室中进行。

1.1 动物与分组

清洁级ICR小鼠，雌雄各半，18～22g，由浙江省实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(浙) 2008-0033。按体重随机分为6组：正常对照组、模型对照组、利巴韦林给药组和新橙皮苷二氢查尔酮（NHDC）给药组、柚皮苷二氢查尔酮（NDC）给药组，四方蒿或风轮菜提取的总黄酮（TF）给药组，每组10只。

1.2 模型建立及给药

除正常对照组给予等剂量生理盐水滴鼻外，其余各组在乙醚轻度麻醉下以10 LD50病毒量滴鼻感染小鼠，30 μL/只。于感染后24 h开始灌胃给药。正常对照组和模型对照组在同等条件下给予生理盐水灌胃，每天1次，连续4d。

1.3 取材及保存

于末次给药后禁食禁水8 h，称重，摘眼球取血后处死，迅速取肺组织，用生理盐水洗净并用无菌滤纸吸干后称全肺重，并计算肺指数及肺指数抑制率。取左侧肺叶称湿量（W），80℃烘箱中烘烤48 h后称干量（D），计算肺组织W/D比值。取右侧肺组织10%福尔马林液固定，用于HE染色和免疫组化分析。

1.4 血清炎性介质的测定

将摘眼球后所取血液置试管中4℃，3000 rpm/min离心20min，吸取上清，置-20℃冰箱中，备用。采用双抗体夹心ABC-ELISA法，分别测定小鼠血清中IL-6、LTB4和ICAM-1含量。检测程序按照试剂盒说明书进行。

1.5 肺脏形态学观察

将固定后的肺组织样本行石蜡包埋切片，切片5 μm，经HE染色、中性树胶封固后显微镜观察照相。

1.6 免疫组化分析

肺组织常规包埋切片后，脱蜡、透明。采用一步法，一抗浓度为4 mg/mL，同时设立阴性对照片（用抗体稀释液体PBS替代一抗），DAB颜色，苏木精复染，中性树胶封片。阳性结果为细胞膜（AQP5或MUC5AC）上显棕黄色颗粒沉淀；阴性对照片显示细胞核及细胞膜呈蓝色，胞质及整片组织呈淡蓝色背景。采用Imagepro-Plus 4.0软件分析，计算图像光密度值。

1.7 药物对病毒增殖的抑制作用

取对数生长期细胞Hep-2或MDCK，以RPMI-1640培养液稀释至浓度约1×10⁴个/mL，接种于96孔板，每孔加入50 μL（100 TCID₅₀）呼吸道合胞病毒或流感病毒溶液，置37℃，50mL/LCO₂培养箱中培养2h，弃上清，加入不同浓度的含药维持液，每孔0.2mL，继续培养48h。当细胞病变达到75％以上时，每孔加入含5.0 g/L MTT的培养液50μL，继续培养2 h，弃上清，每孔加DMSO溶解液100 μL，混匀10 min，于570 nm波长处，测其吸光度（OD）值。计算药物对RSV抑制率。

2.0 统计方法

实验数据采用SPSS 17.0统计分析软件进行统计学处理，所得结果以均数±标准差（                                                ±s）表示。取P﹤0.05作为显著性差异水平。

3 结果

3.1 药物对病毒感染小鼠肺损伤及肺水肿的保护作用结果

表1  药物对病毒感染小鼠肺损伤及肺水肿的保护作用（n=10, ±s）

注：与模型对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

从宏观上肺指数值的大小可以反映肺部病变的严重程度，而肺W/D比值可作为衡量肺组织毛细血管通透性增加、间质和肺泡水肿的指标。由表1结果表明，模型对照组肺指数及肺W/D值均显著升高，与正常对照组比较，具有显著性差异（P﹤0.01），表明流感病毒诱导的炎症反应可导致肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞严重受损，造成病毒性肺损伤和肺水肿。新橙皮苷二氢查尔酮（NHDC）、柚皮苷二氢查尔酮（NDC）和总黄酮（TF）给药组均可明显降低感染小鼠的肺指数和肺W/D值，提高肺指数抑制率，减轻小鼠流感病毒所致肺炎的病变程度，表明三种药物均能明显减轻流感病毒导致的肺水肿。

3.2 药物对病毒感染小鼠肺组织病理损伤的保护作用结果，如图1所示。

光镜下观察各组小鼠肺脏病理组织学变化，正常对照组肺泡大小较一致，肺泡壁较薄，支气管上皮完整，管腔内无分泌物，其外周未见炎性细胞浸润。模型对照组则呈重度间质性肺炎病变，可见支气管上皮脱落，肺泡间隔增厚，充血，肺泡壁和细支气管壁周围大量单个核细胞浸润，形成实变区，肺泡腔内大量浆液性惨出。与模型对照组相比，经NHDC、NDC和TF治疗后，各组感染小鼠肺损伤病变程度均较模型对照组明显减轻，肺泡和血管内中性粒细胞聚集不明显，肺组织间隙中性粒细胞浸润明显减少，红细胞渗出不明显，提示三种药物均能改善病毒诱导的肺组织病理症状。

3.3药物对病毒感染小鼠血清炎性介质的抑制作用结果

表2  药物对病毒感染小鼠血清炎性介质的抑制作用（n=10, ±s）

注：与模型对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。

模型对照组小鼠血清中IL-6、LTB4和ICAM-1含量明显升高，与正常对照组相比较，具有显著性差异（P<0.01），表明流感病毒可诱导感染小鼠机体炎性介质的大量释放，促进肺气血屏障损伤；而经NHDC、NDC和TF给药治疗后血清中IL-6、LTB4和ICAM-1含量均明显降低，与模型对照组相比较，均具有极显著性差异（P<0.01或P<0.05），表明三种药物均可抑制流感病毒感染引起的炎症反应的作用。

3.4药物对病毒诱导小鼠肺组织AQP5表达的抑制作用，如图2所示。

水通道蛋白5（AQP5）是近年来发现的一种调节机体内外环境水液代谢平衡的关键蛋白，是肺脏通调水液转运的生理基础。AQP5阳性物质呈棕黄色、颗粒状，主要在肺泡上皮细胞的肺泡腔面，气道分泌上皮顶质膜上分布。由图2结果可知，在正常对照组小鼠肺组织中AQP5蛋白表达较多，表现为细胞浆或细胞核内弥漫性黄色或棕黄色颗粒，而病毒模型组小鼠肺细胞核中AQP5蛋白表达则明显减少。与模型对照组相比较，经NHDC、NDC和TF给药治疗后各组感染小鼠肺组织AQP5表达较正常对照组明显增加（P<0.01），提示三种药物均可上调流感病毒引起的肺组织AQP5表达减少，从而减轻病毒诱导的肺水肿。

3.5 药物对病毒诱导小鼠气管及肺组织MUC5AC表达的抑制作用，如图3所示。

肺损伤的另一重要病理生理特征为黏液高分泌，在小鼠黏液分泌物中的粘蛋白主要是MUC5AC，是气道和肺组织黏液的主要成分之一。由图3结果可知，正常小鼠肺组织上皮细胞几无MUC5AC蛋白表达，仅在气管上皮细胞中有少量表达。流感病毒感染后小鼠肺组织MUC5AC含量明显增加，气管及肺泡上皮细胞中均可见大量MUC5AC阳性细胞表达。但给予NHDC、NDC和TF治疗后，感染小鼠肺组织及气管上皮细胞MUC5AC蛋白表达明显降低，提示NHDC、NDC和TF可通过下调流感病毒引起的气管及肺组织MUC5AC表达增加，从而减轻病毒诱导的气道炎症及肺水肿。

3.6 药物对病毒增殖的抑制作用结果

表3 药物对病毒增殖的抑制作用（n＝3）

呼吸道合胞病毒或流感病毒可造成细胞肿胀、变圆，折光性减弱，合胞体形成；经NHDC、NDC、7-甲氧基汉黄芩素、6,7-二甲氧基黄芩素和TF给药干预后，可在一定程度上抑制病毒对细胞的病变程度。Kruskal-Wallis法比较各加药组与病毒对照组细胞病变程度，结果表明NHDC、NDC、7-甲氧基汉黄芩素、6,7-二甲氧基黄芩素和TF对流感病毒或呼吸道合胞病毒在Hep-2或MDCK细胞株中的复制有较强抑制作用，治疗指数高于利巴韦林，提示药物对呼吸道合胞病毒或流感病毒体外复制具有较强的抑制作用。

实施例3：药效试验

1实验材料

清洁级ICR小鼠，雌雄各半，18～22g，由浙江省实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(浙) 2008-0033。

地塞米松片（批号：070941），浙江仙琚制药股份有限公司；脂多糖（LPS，批号：L2880-50MG），美国sigma公司。

2实验方法

2.1 模型的建立及分组

小鼠适应环境后，随机分为6组：正常对照组，模型组，地塞米松治疗组，正常对照组、模型对照组、利巴韦林给药组和新橙皮苷二氢查尔酮（NHDC）给药组、柚皮苷二氢查尔酮（NDC）给药组，总黄酮（TF）给药组；每组10只小鼠。连续腹腔注射给药3d，1次/天，于末次给药后0.5h，除正常对照组给予同剂量生理盐水外，其余各组均腹腔注射LPS 5mg/kg。继续饲养。

2.2 检测指标的测定

于腹腔注射LPS 12h后，小鼠摘眼球取血，2000 rpm离心10min，取其上清液采用BCA法检测血浆蛋白含量。处死小鼠，打开胸腔，用止血钳夹闭右侧主支气管，在气管上段剪断，插入16号针头，用4℃无菌生理盐水进行左肺灌洗，每次2ml，反复灌洗后抽出，共抽洗2次。灌洗液经2000 rpm离心10min，取其上清液采用BCA法检测蛋白含量，以BALF与血浆中蛋白含量的比值表示，计算肺通透指数。

另取小鼠右肺，称湿重后，迅速转移到冰盒上，以试剂盒提供的试剂为匀浆介质，按重量体积比1：19加匀浆介质。充分匀浆，制备成5%的组织匀浆，按试剂盒要求测定PLA₂含量。并以全肺湿重与动物体重的重量百分比为肺指数。

3 实验结果

3.1 药物对LPS诱导小鼠急性肺损伤的保护作用结果

表4 药物对LPS诱导小鼠急性肺损伤的保护作用（±s, n=10）

组别剂量（mg/kg）肺指数肺通透性指数（％）PLA₂（U）正常对照组-0.7±0.4**49.1±9.2**23.8±6.5**模型组-1.58±0.675.8±16.748.0±6.5NDC给药组1001.4±0.4*55.3±5.6*31.4±5.0**NHDC给药组1001.3±0.36**54.2±7.1*30.8±8.3**TF给药组2001.0±0.1**52.3±7.5*28.6±5.8**地塞米松组151.0±0.2**52.2±6.5*27.9±6.4**

注：与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01

由表4结果可知，新橙皮苷二氢查尔酮（NHDC）、柚皮苷二氢查尔酮（NDC）和总黄酮（TF）给药组与模型组相比，肺指数、肺通透性指数、肺组织匀浆中PLA2活性明显降低，提示三种药物均能显著抑制LPS致小鼠的急性肺组织损伤。

本发明中采用新橙皮苷二氢查耳酮、柚皮苷二氢查耳酮、7-甲氧基汉黄芩素、6,7-二甲氧基黄芩素药学上可接受的盐（如水溶性盐）进行与实施例2和3的相同试验，最后也能够得到与实施例2和3相同的技术效果。