一种治疗菌群失调所致腹泻的中医药微生态制剂

摘要

一种治疗菌群失调所致腹泻的中医药微生态制剂，所述制剂的有效成分含20%-50%剂量超微七味白术散、0.2-0.5×1010个汉逊德巴利酵母菌(Debaryomyces hansenii)，即20%-50%剂量超微七味白术散与0.2-0.5×1010个汉逊德巴利酵母菌混匀吸附就可以达到1剂量七味白术散的疗效；每剂量的七味白术散是人参6g、木香6g、白茯苓10g、炒白术10g、藿香叶10g、葛根10g、甘草3g，每剂量的超微七味白术散是将1剂量的七味白术散通过中药超微技术制成。本发明将超微七味白术散与汉逊德巴利酵母菌进行配伍，对新型中医药制剂的研发利用具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于中医药微生态制剂领域，确切地说是一种将中药复方与酵母菌配伍来防治菌 群失调所致腹泻的药剂。

背景技术

近年来，抗生素的广泛使用导致菌群失调甚至产生耐药性的现象日益严重。七味白术散 出自钱乙《小儿药证直诀》，主治脾虚泄泻，方中人参、白术健脾益气，茯苓、广藿香、木 香和中化湿理气，葛根升清气，其立方严谨，配伍精当，全方融补、运、升、降为一体，补 而不滞。临床实践及现代药理研究证明，七味白术散对小儿迁延性腹泻、霉菌性肠炎、溃疡 性结肠炎、脾虚湿盛型腹泻等多种肠道疾病有很好的治疗效果。李春颖进行了七味白术散加 味治疗抗生素相关性腹泻的研究，证明七味白术散加味对抗生素相关性腹泻有显著治疗作用， 谭周进等证实了七味白术散复方对肠道微生物和酶活性具有明显的调控作用，且超微七味白术散 50%剂量即可达到传统饮片全量的疗效，能够节约中药材。

微生态调节菌剂在肠道内定居、繁殖、以促进和维持肠道内微生态平衡，调整生理平衡， 对肠道内病原菌直接产生影响或通过对肠道微生态结构或免疫系统的调整间接产生影响，从 而可排除致病菌和条件致病菌侵袭。目前，乳杆菌属、双歧杆菌属、芽孢菌类和酵母菌属的 多个菌株已作为微生态调节剂应用于临床。酵母菌能够产生大量的B族维生素和氨基酸，既 可帮助消化，促进营养物质的吸收，刺激有益菌的生长，又可为动物提供蛋白质。酵母菌能 直接参与生物屏障的构成，发挥对致病菌和条件致病菌的拮抗作用，促进优势种群生长，调 整微生态平衡。肠道酵母菌还可通过其代谢产物来进行肠道内的微生态调节，从而增强机体 的免疫力和抗病力。

中药与微生态制剂联用已成为当今的一个重要研究领域。崔法新利用白头翁加甘草阿胶 汤与微生态制剂金双歧联用治疗对抗生素无效小儿细菌性痢疾取得了较好的效果，有研究表 明中药与微生态制剂联用能显著提高肉鸡血清中的SOD、GSH-Px的活性，降低血清中MDA 的含量，明显提高机体的抗氧化能力。本申请人研究了超微七味白术散与汉逊酵母菌联合治 疗小鼠菌群失调腹泻的效果，还探讨了其疗效与肠道菌群之间的关系及超微七味白术散与汉 逊酵母菌的最佳配伍，本发明首次采用超微七味白术散与汉逊酵母菌联合治疗菌群失调腹泻 小鼠，并获得了较理想的效果。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种中医药微生态制剂，对菌群失调所致腹泻具有良好的治疗效 果，并可有效地节约中药材，节约资源，并进一步减少抗生素的使用。

一种治疗菌群失调所致腹泻的中医药微生态制剂，是由以下方式制备而成的：

1）以人参6g、木香6g、白茯苓10g、炒白术10g、藿香叶10g、葛根10g、甘草3g 组成1个剂量的七味白术散，取1个剂量的七味白术散的20-50%，然后超微粉碎成粒径大小 0.01-500μm的粉末，得到超微饮片；

2）将汉逊德巴利酵母菌活化，接种到马铃薯蔗糖液体培养基，28℃150转/分摇床振荡 培养36h后，3000rpm离心10min，弃上清液，沉淀重复洗涤1-2次，得到酵母菌菌体；

3）将步骤1）制备的20%-50%剂量的超微七味白术散饮片加入步骤2）得到的酵母菌菌 体0.2-0.5×10¹⁰个，混合均匀吸附，得到固体中医药微生态制剂。

所述的治疗菌群失调所致腹泻的中医药微生态制剂，优先选用25%剂量的超微七味白术 散+0.25×10¹⁰个酵母菌混合吸附制备得到中医药微生态制剂。

申请人在进行国家自然科学基金(81173214；81070295)研究的过程中，发现人参和甘草对 肠道酵母菌产生了抑制作用，其中人参的最低抑菌浓度为0.7936g/ml，甘草的最低抑菌浓度 为0.3949g/ml；茯苓、白术、葛根对肠道酵母菌的生长产生了促进作用，葛根对肠道酵母菌 生长的促进效果最好，茯苓次之；而木香和藿香对肠道酵母菌的生长在本次研究中未表现出 明显的抑制或促进作用。七味白术散复方在低浓度下对肠道酵母菌的生长产生了促进作用， 且通过比较分析，七味白术散超微饮片对肠道酵母菌生长的促进效果要优于传统饮片。如是， 我们研究了超微七味白术散与酵母菌配伍治疗菌群失调腹泻的问题，并得到了本发明内容。 本发明首次采用超微七味白术散与汉逊酵母菌联合治疗菌群失调腹泻小鼠，并获得了较理想 的效果。

具体实施方式

以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例1

1动物清洁级昆明小鼠，雌雄各半，体质量20±2g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公 司提供。

2药物1剂量七味白术散各组分用量为：人参6g、木香6g、白茯苓10g、炒白术10g、 藿香叶10g、葛根10g、甘草3g；制成50%剂量、25%剂量、12.5%剂量的七味白术散的超 微饮片时，也就是每种组分均只取各自用量的50%量、25%量或12.5%量，混合后经超微粉 碎成粒径大小0.01-500μm粉末，制成超微饮片，4℃冰箱中保存备用。

汉逊德巴利酵母菌：将汉逊德巴利酵母菌活化，接种到马铃薯蔗糖液体培养基，28℃150 转/分摇床振荡培养36h后，3000rpm离心10min，弃上清液，沉淀重复洗涤（用无菌水洗 涤）1-2次（每次3000rpm离心10min），得到酵母菌菌体。4℃冰箱内保存备用。

3动物分组小鼠适应性饲养4d后随机分成7组，即正常组、模型组、50%剂量超微 七味白术散组、50%剂量超微七味白术散+0.125×10¹⁰个酵母组、25%剂量超微七味白术散 +0.25×10¹⁰个酵母组、12.5%剂量超微汤药+0.5×10¹⁰个酵母组、10¹⁰个酵母组。每组6只，雌 雄各半，分笼饲养。饲料及场地由湖南中医药大学动物实验中心提供。

4造模方法将头孢拉定胶囊和硫酸庆大霉素注射液用无菌生理盐水配成浓度为62.5 g/L的抗生素混合液(即6支庆大霉素（2mL/支）+3粒头孢(0.25g/粒)配制成混合液)，4℃冰箱 中保存备用。正常组给予无菌生理盐水0.35mL/（只·次）灌胃，其余各组采用抗生素混合液 0.35mL/(只·次)灌胃。每天2次，连续5d，粪便变得“稀湿”即造模成功。

5给药方法及剂量造模成功后，每天灌胃给药2次，连续3d。正常组及模型组给予 无菌生理盐水，其余各组按七味白术散传统饮片全量临床用药剂量等效给药。

6效果分析方法造模成功后、治疗结束后分别称取小鼠体重，观察动物的饮食活动、 精神状况、粪便稀释度、死亡情况等，并计算体重变化率，计算公式如下：治疗后体重变化 率（％）=（最终体重－造模后体重）/最终体重×100。并且在治疗结束后将处死的小鼠立即 放于超净工作台上，无菌采集各组空肠到回肠段的肠道内容物，收集同组小鼠肠道内容物通 过无菌操作进行混匀。按组分别无菌操作称取一定量的肠道内容物放入装有玻璃珠的无菌水 瓶中，混菌法计数，细菌、大肠菌群在37℃培养箱中培养24h后计数菌落，真菌在30℃培 养箱中培养48h后计数菌落，乳酸菌、双歧杆菌在37℃厌氧培养箱中培养48h后计数菌落， 每一个稀释度做3次重复，求其平均值并计算每克肠道内容物所含的菌数。用DPS v7.05软 件处理数据，各分组所得计量数据采用平均值±标准差表示，两组间均数比较用t检验， P<0.05有统计学意义。

7超微七味白术散与酵母菌联用对小鼠菌群失调腹泻的疗效

见表1。小鼠治疗前后粪便颜色、含水量、黏度等均发生变化，治疗第1日，小鼠新鲜粪 便颜色都仍为黑色，且比较湿润；治疗第2日，所有小鼠粪便较治疗第1日更稀，可能是抗生 素致泻的延迟反应，治疗组小鼠新鲜粪便颜色开始变黄，模型组小鼠粪便仍为黑色；治疗第3 日，50%剂量超微七味白术散组、50%剂量超微七味白术散+0.125×10¹⁰个酵母组、25%剂量超 微七味白术散+0.25×10¹⁰个酵母组小鼠粪便转干，颜色变淡，而模型组、12.5%剂量超微汤药 +0.5×10¹⁰个酵母组、10¹⁰个酵母组小鼠粪便仍较稀湿，颜色较深。

表1超微七味白术散与酵母菌协同治疗小鼠菌群失调腹泻的效果

注：＋表示粪便干燥，－表示粪便稀湿。

8超微七味白术散与酵母菌协同对菌群失调腹泻小鼠体重的影响

由表2可知，造模后给药组和模型组小鼠体重增长率低于正常组，灌胃结束后，给药组 和模型组体重增长率高于正常组，但和正常对照组比较均无统计学意义（P>0.05），这与治 疗过程中，各给药组小鼠腹泻症状不断缓解，模型组小鼠也在不断自我恢复，各组小鼠的精 神状态好转，进食量增加有关，七味白术散与酵母菌联用对小鼠体重影响不显著。

表2超微七味白术散与酵母菌协同对菌群失调腹泻小鼠体重的影响

9超微七味白术散与酵母菌协同对菌群失调腹泻小鼠肠道微生物的影响

由表3可知，治疗结束后，模型组大肠杆菌数、真菌数明显高于正常组（P<0.01或P<0.05）, 细菌总数、双歧杆菌数和乳酸菌数显著低于正常组（P<0.01或P<0.05）,50%剂量超微七味 白术散组、50%剂量超微七味白术散+0.125×10¹⁰个酵母菌组、25%剂量超微七味白术散 +0.25×10¹⁰个酵母组、12.5%剂量超微七味白术散+0.5×10¹⁰个酵母组及10¹⁰个酵母组的大肠杆 菌数较模型组均显著降低（P<0.05）,其中经50%剂量超微七味白术散和25%剂量超微七味白 术散+0.25×10¹⁰个酵母治疗后的大肠杆菌数与正常组最为接近，但差异不显著(P>0.05)。各 治疗组细菌数、双歧杆菌数、乳酸菌数及真菌数较模型组均有所增加（P<0.01或P<0.05）， 其中25%剂量超微七味白术散+0.25×10¹⁰个酵母组的细菌数与正常组的最为接近（P>0.05）； 50%剂量超微七味白术散+0.125×10¹⁰个酵母组和25%剂量超微七味白术散+0.25×10¹⁰个酵母 组的双歧杆菌数和乳酸菌数与50%剂量超微七味白术散组接近,差异不显著（P>0.05）。酵母 组的双歧杆菌数、乳酸菌数和真菌数均高于其他组别（P<0.01或P<0.05）。因此，25%剂量 超微七味白术散+0.25×10¹⁰个酵母对菌群失调腹泻小鼠肠道微生物的调控作用与50%剂量超 微七味白术散的疗效最为接近，10¹⁰个酵母对肠道有益菌双歧杆菌和乳酸菌增殖具有显著促 进作用（p<0.01或p<0.05）。

表3超微七味白术散与酵母菌协同对菌群失调腹泻小鼠肠道微生物的影响

注：同正常组组比较,a：P＜0.01,A：P＜0.05；同模型组比较，b:P＜0.01,B P＜0.05同50% 剂量超微七味白术散组比较，c：P＜0.01，C：P＜0.05；同50%剂量超微七味白术散+0.125×10¹⁰个酵母组比较，d:P＜0.01,D:P＜0.05;同25%剂量超微七味白术散+0.25×10¹⁰个酵母组比较e： P＜0.01，E：P<0.05;同12.5%剂量超微七味白术散+0.5×10¹⁰个酵母组比较：f：P＜0.01，F： P＜0.05

本发明证实，25%剂量的超微七味白术散+0.25×10¹⁰个酵母菌混合吸附为最佳配伍，其治 疗菌群失调小鼠腹泻的效果与超微七味白术散50%剂量相当，可以达到七味白术散传统饮片 全量的疗效，为临床治疗和新药的开发与生产提供了实验依据。