一种含大环化合物的新型亲和分离材质制备方法及应用

摘要

本发明提供一种含大环化合物的新型亲和分离材质的制备方法及应用。本发明提供一种亲和分离材质的制造方法，该制造方法包括：将大环化合物和聚合物材质以共混的方式结合形成共混材质的工序，聚合物材质包括乙烯-乙烯醇共聚物(EVAL)和聚醚砜(PES)等；利用配基(活性染料)与共混材质中大环化合物间的化学反应将配基固载到共混材质，从而得到亲和分离材质的工序；本发明同时提供一种亲和分离材质的应用：该新型亲和分离材质用于吸附牛血清蛋白(BSA)等生物大分子的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及亲和分离材质的制备方法及应用，具体就是将大环化合物和聚 合物材质(PES、EVAL等)共混制备共混分离材质后，利用配基与共混分离材 质中大环化合物间的化学反应实现配基的固载，最终制备亲和分离材质，并将 该亲和分离材质用于牛血清蛋白(BSA)等生物大分子的吸附应用。原料多为 商业化产品、操作简洁且产率较高，同时对于大环化合物特殊功能和结构的深 入认识、亲和分离技术的拓展具有重要意义。

背景技术

近十几年来，随着生命科学和生物工程的迅速发展，对于蛋白质、酶、核 苷酸等生物大分子纯化分离的要求越发严格。传统的分离方法，如沉淀、结晶、 离心等在很多情况下难以满足临床要求。亲和分离材质技术具有选择性强、处 理量大、易于放大等显著优点，广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离，已经 发展成为亲和分离的一个重要分支。

活性染料作为配基用于亲和分离不仅与BSA等生物大分子具有较好的结合 能力，而且解决了天然配体价格昂贵、通用性差等局限性，三嗪染料如汽巴蓝 (Cibacron Blue F3GA)和活性蓝5(Procion Blue MX-R)等已广泛用于蛋白纯化 分离。

到目前为止，染料亲和分离材质所选用的基质材料大多为纤维素、壳聚糖 等含有大量活性基团(如羟基)的聚合物，原因在于通过活性基团与染料配基 间的共价作用赋予分离材质亲和性能(吸附蛋白质等)。而大环化合物如环糊 精(Cyclodextrin，简称CD)与纤维素的分子结构式相似，一方面，环糊精环糊 精含有丰富的活性基团(羟基)，能提供偶联配基反应时需要的特异性基团， 另一方面，其特殊的空腔结构和外部亲水、内部疏水的性质，对蛋白质等生物 大分子的吸附有一定的“诱导”和包合作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种含大环化合物并且以以染料为配基的新型亲和分 离材质的制备方法及其应用，该发明对于环糊精特殊功能和结构的深入认识、 亲和分离材质技术的拓展具有重要意义。同时该方法快速、简便、廉价、高效， 可高效吸附牛血清蛋白等生物大分子，适用于规模化生产。

本发明涉及以染料Procion Blue MX-R为配基的含大环化合物新型亲和分离 材质的制备方法，包括下列步骤：

一.共混分离材质制备：

将大环化合物和聚合物材质EVAL或PES在二甲基亚砜溶剂中、加热以及 搅拌的条件下混合均匀，利用相转化法制备共混分离材质。

二.亲和分离材质制备：

(1)将上述制备好的共混分离材质放入到适量体积、一定浓度的染料 Procion Blue MX-R溶液中反应；

(2)加入适量体积、一定浓度的NaCI溶液处理，使吸附反应容易进行， 最终将染料分子固载到共混分离材质上；

(3)调节气浴温度，加入适量体积、一定浓度的Na₂CO₃溶液中进行固色 反应；

(4)将反应液冷却，依次用去离子水、甲醇、NaCl溶液、尿素溶液充分洗 涤后，最后再次用去离子水冲洗，并保存于Tris-HCI缓冲液中，得到以染料 Procion Blue MX-R为配基的含大环化合物新型亲和分离材质。

所述的分离材质是用以聚合物EVAL或PES为基质，采用相转化法制备而 成的；

所述的大环化合物为环糊精，包括α、β、γ-环糊精；

所述步骤一中共混分离材质制备的反应温度为60℃，同含量为10～20％，反 应时间为4～6h。

所述染料Procion Blue MX-R的浓度是10mg／ml，用量为100ml；

所述步骤(1)中的反应是40～60℃的气浴振荡反应20～50min；

所述步骤(2)中的NaCI溶液处理是用20ml、20wt％的NaCI溶液在40～60℃ 气浴振荡处理50～80min；

所述步骤(3)中的Na₂CO₃固色反应是用1wt％Na₂CO₃在60～90℃气浴振 荡反应20～40min；

所述步骤(4)中的洗涤液用的是含量为99.5～100％的甲醇、2mol／L的NaCI 溶液、6mol／L的尿素溶液。

尿素洗涤，洗涤程度是所洗后的洗涤液为无色；

以染料Procion Blue MX-R为配基的含大环化合物新型亲和分离材质可应用 于BSA等生物大分子的吸附。

发明效果：

(1)本发明对于大环化合物特殊功能和结构的深入认识、亲和分离技术的 拓展具有重要意义；

(2)本发明的方法操作简单，耗时较少，吸附效果良好；

(3)本发明所使用的原材料多为工业化产品，廉价易得，降低了生产成本。 所选聚合物基质EVAL中含有丰富的活性基团(如羟基)，有利于染料固载反应 的进行，同时具有较好的机械强度和抗污染性；

(4)探明了各种影响因素对于亲和吸附性能的影响，建立了各种因素与吸 附的对应关系。

附图说明

图1是牛血清蛋白初始浓度的变化对吸附性能的影响曲线；

图2是反应pH的变化对牛血清蛋白吸附的影响曲线；

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围，此外应理解，在阅读了本发明讲授的内 容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样 落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：

(1)共混分离材质制备：

将聚合物基质材料EVAL和溶剂DMAc按一定比例混合，加入适量的β-环 糊精，其中EVAL的同含量为20％，β-环糊精的固含量为2％，40℃下机械搅拌 4h至完全溶解，真空脱泡，采用相转化法制备分离材质，放入凝固浴(去离子 水)中静置3天，期间换水5次，放入干燥器内贮存备用。

(2)亲和分离材质制备：

取3张(1)中制备的共混分离材质放入100ml、1g／L的染料溶液中；混合 液在60℃下密封振荡30min，接着加20％wt的NaCl溶液，反应60min。将水浴 锅逐渐加热到80℃，加入1％wt的Na₂CO₃溶液使混合液的pH值保持在10-11 的范围内，继续反应30min后冷却，用去离子水洗涤至无色，然后依次加入甲 醇、2mol／L的NaCl溶液和6mol／L的尿素溶液，最后再次用去离子水冲洗。并 用Tris-HCl缓冲液保存。

实施例2：

以染料Procion Blue MX-R为配基的含大环化合物新型亲和分离材质的应 用，具体步骤如下：

(1)牛血清蛋白浓度初始浓度的确定：

称取5组各0.1g亲和分离材质，加入的缓冲液和浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、 1.2mg／ml的牛血清蛋白中，于25℃下振荡4h。采用考马斯亮蓝法测定牛血清蛋 白的浓度，进而计算出吸附容量。图1是牛血清蛋白初始浓度的变化对吸附性 能的影响曲线，结果表明吸附容量随着牛血清蛋白初始浓度的增大而增大，综 合考虑，选择牛血清蛋白的初始浓度为1.0mg／ml。

(2)反应pH值的确定：

称取5组各0.06g亲和分离材质，加入10ml磷酸盐缓冲液配制的牛血清蛋 白溶液进行吸附实验，溶液的pH值分别为3.8、4.4、5.0、5.8和6.5，于25℃ 下振荡4h。采用考马斯亮蓝法测定牛血清蛋白的浓度，进而计算出吸附容量。 图2是反应pH的变化对牛血清蛋白吸附的影响曲线，当反应体系的pH值为5.0 时，吸附量最高。