一种表面引发制备温敏型分子印迹聚合物的方法

摘要

本发明涉及一种表面引发制备温敏型分子印迹聚合物的方法，属环境功能材料制备技术领域。本发明以酵母菌作为印迹支架材料，温敏型分子印迹聚合物采用头孢氨苄(CFX)作为模板分子，丙烯酰胺作为识别模板分子的功能单体，异丙基丙烯酰胺作为温敏单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯作为交联单体，CuCl2为催化剂，抗坏血酸为还原剂，通过电子转移原子转移自由基聚合的方法，在酵母菌表面制备温敏型分子印迹聚合物(T-MIPs)。并将印迹聚合物应用于水溶液中，进行选择性识别和释放头孢氨苄。该产品的制备利用了廉价的酵母菌为载体，降低了成本，合成中实现了绿色可控聚合过程；产品对模板分子具有较好的选择性吸附效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种表面引发制备温敏型分子印迹聚合物的方法，属环境功能材料制备技术领域。 

背景技术

可控/活性自由基聚合反应(CLRP)已经广泛使用到合成分子印迹聚合物中，包括原子转移自由基聚合(ATRP)，可逆加成断裂链转移聚合(RAFT)，氮氧[自由基]调控聚合(NMP)和引发-转移-终止剂。其中，原子转移自由基聚合使用卤素Cu(I)作为催化剂，并在温和的条件下，在低的温度下各种不同的单体可以发生反应。然而，常见的原子转移自由基聚合存在一些缺点，因为原子转移自由基聚合系统的催化剂包括金属化合物的转移，所以对氧气很敏感，在低氧状态下很容易被氧化成高的氧化态。因此，聚合反应很容易被氧气抑制。为了克服这些缺点，电子转移原子转移自由基聚合(AGET ATRP)利用金属铜和抗坏血酸消耗氧气的电子转移，而提供无氧环境。电子转移原子转移自由基聚合方法还有其它的优势，如降低催化剂成本和避免不稳定的Cu(I)催化剂的使用。 

近期，智能和功能分子印迹聚合物引起人们广泛的兴趣，例如温敏型、酸敏型、磁敏型和光敏型。在这个领域里，聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)一直受到高度重视，是因为它的温度敏感性的性质。在分子印迹中使用特殊功能单体（如N-异丙基丙烯酰胺）可以获得温敏响应性分子印迹聚合物，它能根据环境温度的改变而吸收和释放模板分子。 

酵母菌(yeast)是一种重要的受关注的微生物群体之一，被认为是人类和动物真核细胞的理想模型。与其它印迹支架材料相比，如硅胶、纳米管膜和石墨烯，酵母菌具有成本低，易获得资源，细胞壁含有丰富的活性生物分子，从而不需要进一步的修饰过程。    

发明内容

本发明以酵母菌作为印迹支架材料，温敏型分子印迹聚合物采用头孢氨苄(CFX)作为模板分子，丙烯酰胺(AAm)作为识别模板分子的功能单体，异丙基丙烯酰胺作为温敏单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)作为交联单体，CuCl₂为催化剂，以及抗坏血酸(AsAc)作为还原剂，通过电子转移原子转移自由基聚合的方法，在酵母菌表面制备温敏型分子印迹聚合物(T-MIPs)。并将印迹聚合物应用于水溶液中，进行选择性识别和释放头孢氨苄。 

本发明采用的技术方案是：

（1）AGET ATRP引发剂的制备

将安琪酵母粉用0.85%-0.95%的饱和食盐水溶液和乙醇分别洗涤三次，室温下干燥。在氮气保护下，干燥后的酵母菌、四氢呋喃、三乙胺按照（2.5-3.5g）：(25-35ml):（0.5-1.5ml）的比例，将干燥后的酵母菌加入到四氢呋喃和三乙胺的混合溶液中，冰水浴30分钟，按酵母菌：2-溴异丁酰溴为（2.5-3.5g）：（0.5-1.5mL）的比例逐滴加入2-溴异丁酰溴引发剂引发反应，在氮气保护下室温搅拌12小时，所获得的AGET ATRP引发剂酵母菌引发剂(yeastBr)用乙醇和蒸馏水洗几次，25℃下真空干燥12小时。

（2） AGET ATRP制备头孢氨苄表面温敏印迹聚合物 

将头孢氨苄和丙烯酰胺按照摩尔比为0.14mmol:4.22mmol的比例加入到体积比为2：1的甲醇和去离子水的混合溶液中， 控制头孢氨苄的浓度为4.8-4.93mmol/L，混合溶液通氮气存储1.5 h，使头孢氨苄和功能单体自组装之后， 接着按照摩尔比头孢氨苄：异丙基丙烯酰胺为1：（22.94-25.75）的比例，在预组装体系中加入N-异丙基丙烯酰胺。室温下，按照每1mmol头孢氨苄加入0.4-0.5g酵母菌引发剂的比例，在以上溶液中加入酵母菌引发剂，同时按摩尔比为头孢氨苄：EGDMA为1：（0.14-0.15）的比例加入EGDMA，获得预聚合溶液，0.5小时后，按摩尔比头孢氨苄：CuCl₂：N,N,N',N',N''-五甲基二乙烯为1：（0.68-0.89）：（9.94×10^-4-1.24×10^-3）的比例逐步加入CuCl₂和N,N,N',N',N''-五甲基二乙烯三胺，加热到30℃，浓度为抗坏血酸(3.775 mg/mL)加入到溶液中，抗坏血酸的用量为：头孢氨苄：上述浓度的抗坏血酸为（0.12-0.137mmol）:( 1.5-2.5 mL)。使Cu²⁺转化为Cu⁺开始聚合反应，溶液在40℃下连续不断的搅拌8小时，聚合后，获得物用去离子水和乙醇多洗几次，之后用索氏提取甲醇/乙酸(体积比90:10，v/v)去除模板分子，最后，所获得的分子印迹聚合物在50℃下真空干燥24小时。非印迹聚合物(NIPs)通过相同的方法制备，但反应过程不加入头孢氨苄。

其中步骤（1）中的酵母粉购买于中国宜昌安琪酵母有限公司的安琪酵母粉。 

本发明的技术优点：该产品温敏型分子印迹聚合物(T-MIPs)的制备利用了廉价的酵母菌为载体，降低了成本，合成中实现了绿色可控聚合过程；产品的产品对模板分子具有较好的选择性吸附效果；同时T-MIPs具有温敏的性能，可以实现选择性识别和释放头孢氨苄。 

  

附图说明

图1 为实施例1中酵母菌（A）和温敏印迹聚合物（B和C）的扫描电镜图。从图中可知酵母粒子是椭圆形的，表面比较光滑， 温敏印迹聚合物的表面粗糙，从放大图中可以看出， 温敏印迹聚合物没有完全地包在酵母的表面。 

图2为实施例1中酵母(A)、温敏印迹聚合物(B)和温敏非印迹聚合物(C)的热重分析(TGA)图。从图中可知在初始温度范围200℃之内，酵母、温敏印迹聚合物和温敏非印迹聚合物的重量损失分别为5.60%、5.24%和4.89%，主要是由于残余水份的流失。随着温度增加到800℃，酵母、温敏印迹聚合物和温敏非印迹聚合物的重量显著损失。在这个阶段，温敏印迹聚合物和温敏非印迹聚合物没有显著性差异，重量损失分别为97.66%和99.06%。温敏印迹聚合物和温敏非印迹聚合物存在很小差异(约1.40%)，是由于温敏印迹聚合物中有残余的模板分子造成的。 

图3 为实施例1中酵母、酵母-Br和温敏印迹聚合物的红外光谱图。在酵母和酵母-Br的光谱中可看出，3383 cm^-1、1649 cm^-1、1535 cm^-1和1050 cm^-1位的峰，分别是-OH,amide I,amide II和P=O的伸缩振动峰。但是，酵母-Br在812 cm^-1处产生一个新的峰值，表明引发剂成功接到酵母菌表面上。从图中可看出，温敏印迹聚合物在1162、1327、1724和759 cm^-1处有显著的峰值，分别是酯(EGDMA)的C-O对称和非对称拉伸振动、异丙基-CH(CH₃)₂的拉伸振动(PNIPAAm)、-CONH₂的拉伸振动和聚丙烯酰胺中N-H键的振动。 

图4 为实施例1中温度对温敏印迹聚合物和温敏非印迹聚合物的吸附容量(Q_e)和印迹因子(IF)影响图。从图中可知Q_e和IF的最大值都出现在35 ^oC左右，可推断空穴的形状与官能团的分布正好与模板分子的构想记忆一致。在35 ^oC温度下，温敏印迹聚合物的吸附量随着温度的增长而增长，是因为聚合物和模板分子疏水性增加引起的。当温度达到45 ^oC，温敏印迹聚合物的特异结合性显著下降。 

具体实施方式

实施例1： 

（1）AGET ATRP引发剂的制备

4.5g安琪酵母粉所示用0.85%的饱和食盐水溶液和乙醇分别洗涤三次，室温下干燥。在氮气保护下，酵母菌、四氢呋喃、三乙胺按照（2.5g）：(25ml):（0.5ml）的比例，将酵母菌加入到四氢呋喃和三乙胺的混合溶液中，冰水浴30分钟。之后，逐滴加入0.5mL的2-溴异丁酰溴引发剂引发反应，在氮气保护下室温搅拌12小时。所获得的AGET ATRP引发剂酵母菌引发剂(yeastBr)用乙醇和蒸馏水洗几次，25℃下真空干燥12小时。

（2） AGET ATRP制备头孢氨苄表面温敏印迹聚合物 

0.04g的头孢氨苄和0.25g的丙烯酰胺加入到甲醇和去离子水(体积比为20ml/10ml)的混合溶液中，混合溶液通氮气存储1.5 h，使头孢氨苄和功能单体自组装。之后，0.35g的异丙基丙烯酰胺加入到上述溶液中。在室温下，加入3.46mL的EGDMA和0.4g的酵母菌引发剂(yeastBr)，获得预聚合溶液。0.5小时后，18.2 mg的CuCl₂和25 μL的N,N,N',N',N''-五甲基二乙烯三胺逐步加入到混合溶液中，加热到30℃。1.5 mL的抗坏血酸(3.775 mg/mL)加入到溶液中，使Cu²⁺转化为Cu⁺开始聚合反应，溶液在40℃下连续不断的搅拌8小时。聚合后，获得物用去离子水和乙醇多洗几次，之后用索氏提取甲醇/乙酸(体积比90:10，v/v)去除模板分子。最后，所获得的分子印迹聚合物在50℃下真空干燥24小时。非印迹聚合物(NIPs)通过相同的方法制备，但反应过程不加入头孢氨苄。

  

2、吸附性能分析测试 

（1） 在30C恒温水浴中，10 mg的温敏印迹聚合物/非温敏印迹聚合物加入到10 mL的不同头孢氨苄初始浓度(5-150 mg/L)中，24小时之后，混合物离心，水相中残留的头孢氨苄的量用紫外可见分光光度计测量，波长为261 nm。并根据结果计算吸附容量。结果表明印迹聚合物的最大吸附容量为59.41 mg/g，而非印迹聚合物的吸附容量为23.32 mg/g，温敏印迹聚合物的吸附能力比温敏非印迹聚合物的吸附能力高

在303 K水浴中，10 ml的初始浓度为50 mg/L的头孢氨苄与10 mg的温敏印迹聚合物/非温敏印迹聚合物反应，溶液震荡至所需时间(10-480min)后，离心混合物，水相中残留的头孢氨苄量用紫外可见分光光度计测量。所有的实验同一条件下测三次，并取平均值。结果表明温敏印迹聚合物比温敏非印迹聚合物表现出更高的吸附能力和更快的传质能力。温敏印迹聚合物比温敏非印迹聚合物的吸附头孢氨苄的平衡时间分别是120分钟和240分钟。

（2） 在50℃温度下，温敏印迹聚合物/非温敏印迹聚合物加入到10 mL的浓度分别为5-150 mg/L头孢氨苄溶液中，24小时后达到吸附平衡，离心取混合固体，用蒸馏水清洗，过滤纸吸干，之后加入10 mL蒸馏水，放置24小时。释放的头孢氨苄的量用紫外可见分光光度计测量。释放动力学研究取固定时间间隔，取出试样的释放溶液，其中头孢氨苄的量用紫外可见分光光度计测量。结果表明温敏印迹聚合物的释放量比温敏非印迹聚合物的高。CFX的释放遵循准二级动力学模型，表明化学过程是CFX的释放过程的决速步。 

（3） 各取10 mg的温敏印迹聚合物/非温敏印迹聚合物加入到五个烧杯中，每个烧杯分别含有10 mL的浓度为30 mg/L的头孢氨苄，四环素，磺胺二甲嘧啶，氨苄西林和洛美沙星溶液。之后，温敏印迹聚合物/非温敏印迹聚合物对头孢氨苄的竞争吸附是，在头孢氨苄存在下，和上述提到的一种试剂混合，浓度均为30 mg/L。温度为303 K，12小时后分离混合物，并用高效液相色谱分析(25%甲醇、75%去离子水混合溶液)，检测波长为261nm。结果表明T-MIPs对每种吸附质的去除率的依次顺序为：头孢氨苄>氨苄西林>洛美沙星>磺胺二甲嘧啶>四环素。当竞争抗生素存在于头孢氨苄的溶液中时， 温敏印迹聚合物仍然显示出高的去除率，并且对头孢氨苄的特异选择性很明显，表明温敏印迹聚合物的吸附行为受竞争的抗生素影响不大。 

3、材料的理化性能测试 

（1） 测试了实施例1中酵母菌（A）和温敏印迹聚合物（B和C）的扫描电镜（如图1所示）。从图中可知酵母粒子是椭圆形的，表面比较光滑， 温敏印迹聚合物的表面粗糙，从放大图中可以看出， 温敏印迹聚合物没有完全地包在酵母的表面。

（2） 测试了实施例1中酵母(A)、温敏印迹聚合物(B)和温敏非印迹聚合物(C)的热重分析(TGA)图（如图2所示）。从图中可知在初始温度范围200℃之内，酵母、温敏印迹聚合物和温敏非印迹聚合物的重量损失分别为5.60%、5.24%和4.89%，主要是由于残余水份的流失。随着温度增加到800℃，酵母、温敏印迹聚合物和温敏非印迹聚合物的重量显著损失。在这个阶段，温敏印迹聚合物和温敏非印迹聚合物没有显著性差异，重量损失分别为97.66%和99.06%。温敏印迹聚合物和温敏非印迹聚合物存在很小差异(约1.40%)，是由于温敏印迹聚合物中有残余的模板分子造成的。 

（3） 测试了实施例1中酵母、酵母-Br和温敏印迹聚合物的红外光谱图（如图3所示）。在酵母和酵母-Br的光谱中可看出，3383 cm^-1、1649 cm^-1、1535 cm^-1和1050 cm^-1位的峰，分别是-OH,amide I,amide II和P=O的伸缩振动峰。但是，酵母-Br在812 cm^-1处产生一个新的峰值，表明引发剂成功接到酵母菌表面上。从图中可看出，温敏印迹聚合物在1162、1327、1724和759 cm^-1处有显著的峰值，分别是酯(EGDMA)的C-O对称和非对称拉伸振动、异丙基-CH(CH₃)₂的拉伸振动(PNIPAAm)、-CONH₂的拉伸振动和聚丙烯酰胺中N-H键的振动。 

（4）测试了实施例1中温度对温敏印迹聚合物和温敏非印迹聚合物的吸附容量(Q_e)和印迹因子(IF)影响图（如图4所示）。从图中可知Q_e和IF的最大值都出现在35 ^oC左右，可推断空穴的形状与官能团的分布正好与模板分子的构想记忆一致。在35 ^oC温度下，温敏印迹聚合物的吸附量随着温度的增长而增长，是因为聚合物和模板分子疏水性增加引起的。当温度达到45 ^oC，温敏印迹聚合物的特异结合性显著下降。 

实施例2：

（1）AGET ATRP引发剂的制备

5.5g购买于中国宜昌安琪酵母有限公司的酵母粉用0.95%的饱和食盐水溶液和乙醇分别洗涤三次，室温下干燥。在氮气保护下，酵母菌、四氢呋喃、三乙胺按照（3.5g）：(35ml):（1.5ml）的比例，将酵母菌加入到四氢呋喃和三乙胺的混合溶液中，冰水浴30分钟。之后，逐滴加入1.5mL的2-溴异丁酰溴引发剂引发反应，在氮气保护下室温搅拌12小时。所获得的AGET ATRP引发剂酵母菌引发剂(yeastBr)用乙醇和蒸馏水洗几次，25℃下真空干燥12小时。

（2） AGET ATRP制备头孢氨苄表面温敏印迹聚合物 

0.06g的头孢氨苄和0.35g的丙烯酰胺加入到甲醇和去离子水(体积比为20ml/10ml)的混合溶液中，混合溶液通氮气存储1.5 h，使头孢氨苄和功能单体自组装。之后， 0.45g的异丙基丙烯酰胺加入到上述溶液中。在室温下，加入4.46mL的EGDMA和0.5g的酵母菌引发剂(yeastBr)，获得预聚合溶液。0.5小时后，20.2 mg的CuCl₂和45 μL的N,N,N',N',N''-五甲基二乙烯三胺逐步加入到混合溶液中，加热到30℃。2.5 mL的抗坏血酸(3.775 mg/mL)加入到溶液中，使Cu²⁺转化为Cu⁺开始聚合反应，溶液在40℃下连续不断的搅拌8小时。聚合后，获得物用去离子水和乙醇多洗几次，之后用索氏提取甲醇/乙酸(体积比90:10，v/v)去除模板分子。最后，所获得的分子印迹聚合物在50℃下真空干燥24小时。非印迹聚合物(NIPs)通过相同的方法制备，但反应过程不加入头孢氨苄。

2、吸附性能分析测试 

（1） 在30C恒温水浴中，10 mg的温敏印迹聚合物/非温敏印迹聚合物加入到10 mL的不同头孢氨苄初始浓度(5-150 mg/L)中，24小时之后，混合物离心，水相中残留的头孢氨苄的量用紫外可见分光光度计测量，波长为261 nm。并根据结果计算吸附容量。结果表明印迹聚合物的最大吸附容量为57.38 mg/g，而非印迹聚合物的吸附容量为21.51 mg/g，温敏印迹聚合物的吸附能力比温敏非印迹聚合物的吸附能力高

在303 K水浴中，10 ml的初始浓度为50 mg/L的头孢氨苄与10 mg的温敏印迹聚合物/非温敏印迹聚合物反应，溶液震荡至所需时间(10-480min)后，离心混合物，水相中残留的头孢氨苄量用紫外可见分光光度计测量。所有的实验同一条件下测三次，并取平均值。结果表明温敏印迹聚合物比温敏非印迹聚合物表现出更高的吸附能力和更快的传质能力。温敏印迹聚合物比温敏非印迹聚合物的吸附头孢氨苄的平衡时间分别是135分钟和270分钟。

（2）在50℃温度下，温敏印迹聚合物/非温敏印迹聚合物加入到10 mL的浓度分别为5-150 mg/L头孢氨苄溶液中，24小时后达到吸附平衡，离心取混合固体，用蒸馏水清洗,过滤纸吸干,之后加入10 mL蒸馏水,放置24小时。释放的头孢氨苄的量用紫外可见分光光度计测量。释放动力学研究取固定时间间隔,取出试样的释放溶液,其中头孢氨苄的量用紫外可见分光光度计测量。结果表明温敏印迹聚合物的释放量比温敏非印迹聚合物的高。头孢氨苄的释放遵循准二级动力学模型，表明化学过程是头孢氨苄的释放过程的决速步。 

（3）各取10 mg的温敏印迹聚合物/非温敏印迹聚合物加入到五个烧杯中，每个烧杯分别含有10 mL的浓度为30 mg/L的头孢氨苄，四环素，磺胺二甲嘧啶，氨苄西林和洛美沙星溶液。之后，温敏印迹聚合物/非温敏印迹聚合物对头孢氨苄的竞争吸附是，在头孢氨苄存在下，和上述提到的一种试剂混合，浓度均为30 mg/L。温度为303 K，12小时后分离混合物，并用高效液相色谱分析(25%甲醇、75%去离子水混合溶液)，检测波长为261nm。结果表明T-MIPs对每种吸附质的去除率的依次顺序为：头孢氨苄>氨苄西林>洛美沙星>磺胺二甲嘧啶>四环素。当竞争抗生素存在于头孢氨苄的溶液中时， 温敏印迹聚合物仍然显示出高的去除率，并且对头孢氨苄的特异选择性很明显，表明温敏印迹聚合物的吸附行为受竞争的抗生素影响不大。