S100A9蛋白检测物在制备筛查肝细胞癌试剂盒中的应用

摘要

本发明公开了一种用于检测S100A9蛋白浓度的物质的新用途。本发明所提供的新用途为用于检测S100A9蛋白浓度的物质在制备筛查或辅助筛查肝细胞癌产品中的应用。实验证明，S100A9蛋白可作为肝细胞癌(HBV-HCC)的肿瘤标志物；在以正常人为筛查对象的情况下进行筛查，判定为HBV-HCC患者的阈值为S 100A9蛋白浓度＞3.12ng/ml；此时，其灵敏度为80％、特异度为95％，约登指数为0.75；在以LC患者为筛查对象的情况下进行筛查，判定为HBV-HCC患者的阈值为S100A9蛋白浓度＞3.02ng/ml；此时，其灵敏度为80％、特异度为100％，约登指数为0.8；S100A9蛋白用于在LC人群中筛查HCC，结果准确，操作简便，具有很大的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测S100A9蛋白浓度的物质的新用途。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内的恶性肿瘤之一，有 较高的发病率和死亡率，每年约650000人死于HCC，且其发病率有增高的趋势。 该病多发于东南亚和非洲，其中约有50％以上发生于中国，位居我国癌症死亡率的 第二位。肝细胞癌的发生情况是一个多因素，多阶段，复杂的过程，乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus，HBV)慢性感染是重要的高危因素。肿瘤抑制、肝脏切除和移 植是现阶段肝癌的主要治疗方法，但约60％以上的患者会术后复发。因此，在高危 人群特别是肝硬化(liver cirrhosis，LC)患者中筛查早期肝癌患者，及时采取治疗 措施，可提高继发于乙型肝炎病毒感染的肝细胞癌患者的生存率。

但HCC早期诊断较难，病情进展快，预后水平低。目前肝炎、肝硬化等HCC 高危人群的筛查和HCC临床诊断与病情监测等仍主要依赖于B超等影像学检查联 合血清标志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平的检测。而AFP作为目前HCC 诊断和病情监测一个最主要的生物标志物，其灵敏度和特异度仍不理想。Des-gamma carboxy-prothrombin(DCP)和lectin-bound AFP(AFP-L3)也被认为是很有潜力的 HCC诊断标志物，有研究结果表明，AFP对于HCC早期诊断的效果要优于DCP和 AFP-L3(Marrero，J.A.et al.alpha-Fetoprotein，Des-gamma Carboxyprothrombin，and  Lectin-Bound alpha-Fetoprotein in Early Hepatocellular Carcinoma.Gastroenterology (2009)。

所以，寻找敏感的肝细胞癌生物标记物，对于早期发现和诊断肝细胞癌非常重 要。针对肝脏细胞癌发生过程中具有标志性变化的血清蛋白建立一种检测方法，有 助于肿瘤的临床诊断。

S100A9蛋白(S100caleium-binding protein)是分布于中性粒细胞和单核细胞的 细胞浆和细胞外液中的钙结合蛋白，是S100蛋白家族的主要成员之一，具有广泛的 细胞内和细胞外生物学功能。

S100A9通过对钙离子的调节及与靶蛋白的相互作用，发挥重要的生物学作用， 参与细胞周期活动、细胞分化、肿瘤生长以及细胞外基质分泌活动等过程，S100A9 与肿瘤的发生发展关系密切。但尚无应用于肝细胞癌诊断的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测S100A9蛋白浓度的物质的新用途。

本发明所提供的用于检测S100A9蛋白浓度的物质的新用途具体为用于检测 S100A9蛋白浓度的物质在制备筛查或辅助诊断肝细胞癌(HCC)相关产品中的应用。

在本发明的一个实施例中，所述肝细胞癌具体为继发于HBV感染的肝细胞癌。

所述S100A9蛋白为人S100A9蛋白。

所述筛查或辅助诊断肝细胞癌相关产品可为用于筛查或辅助诊断肝细胞癌的 各种试剂或试剂盒。

在本发明的一个实施例中，所述用于检测S100A9蛋白浓度的物质为S100A9 蛋白抗体，具体为Western blot所用S100A9抗体(Abcam公司，ab24111)或ELISA 所用S100A9抗体(CircuLex公司，货号：CY-8062)。当然，也可以为其它类型的抗 体或是其他可用于检测S100A9蛋白浓度的物质。

所述检测S100A9蛋白浓度具体可为检测人血清、血浆或组织间隙液(Tissue  Interstitial Fluid，TIF)中的S100A9蛋白浓度。

在本发明中，所述产品的筛查或诊断对象是肝硬化(LC)患者或健康人。

在本发明的一个实施例中，所述肝硬化(LC)患者具体为HBV感染的肝硬化 患者。

实验证明，S100A9蛋白可作为肝细胞癌(HCC)的肿瘤标志物。当以健康人 作为筛查对象时，判定为HBV-HCC患者的阈值为S100A9蛋白浓度＞3.12ng/ml，此 时，其灵敏度为75％、特异度为95％，约登指数为0.75。在以LC患者为筛查对象 的情况下进行筛查，判定为HBV-HCC患者的阈值为S100A9蛋白浓度＞3.02ng/ml。 此时，其灵敏度为80％、特异度为100％，约登指数为0.8。可见S100A9蛋白可用 于在LC患者中筛查HBV-HCC，且结果准确，操作简便，具有很大的应用价值。

附图说明

图1为S100A9蛋白表达水平在癌旁TIF(对照组，N)和HBV-HCC TIF组(实 验组，T)的Western blot检测结果。

图2为S100A9蛋白水平在正常人20例(N)、慢性乙型肝炎病毒感染组(HBV) 20例、HBV感染肝硬化组(LC)20例、HBV相关肝细胞癌组(HBV-HCC)20例 的血清样本中的ELISA检测结果。

图3为正常组和HCC患者组、HBV患者组和HCC患者组、LC患者组和HCC 患者组血清中S100A9蛋白水平的ROC曲线分析结果。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的名词解释：

约登指数(Youden Index)也叫正确诊断指数，其取值范围在(0～1)之间，越接 近于1代表诊断准确性越好，本发明方法中将诊断标准定在正确诊断指数最大处。

受试者工作特征(receiver(relative)operating characteristic，ROC)反映了灵敏度与 特异度间的平衡，ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标。分别计算各个试验的 ROC曲线下的面积(AUCROC)进行比较，面积大者，试验的诊断价值大。

灵敏度(真阳性率)：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏 度越大越好，理想灵敏度为100％。

特异度(真阴性率)：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异 度越大越好，理想特异度100％。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、S100A9蛋白在HBV-HCC病人TIF中表达量上调

一、实验材料

TIF配对样本：7例肝细胞癌(HCC)组织间隙液(TIF)样本(实验组)，每一 例均包括同一患者配对的癌旁组织间隙液(对照组)实验材料。

二、实验方法

首先，经过同位素标记的相对绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute  quantitation，iTRAQ)，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)分 析，Mascot搜索引擎(版本2.2)搜索Swiss-Prot(版本20100713)数据库，卡值：ratio＞1.3 和ratio＜0.7，生物信息学分析得到对照组和实验组差异表达的蛋白结果。其中，发 现S 100A9蛋白在HCC病人TIF中表达量上调。

接着，采用免疫印迹技术(western blot)进一步验证S100A9蛋白在HCC病人 TIF中表达量上调这一结论，具体的实验方法如下：首先对TIF配对样本进行常规 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转到硝酸纤维素膜上后放入封闭液(TBST 中5％脱脂奶粉)中封闭1h，在1∶100稀释S100A9一抗(Abcam公司，ab24111) 中4℃孵育过夜，TBST洗膜5次，加入1∶5000稀释羊抗兔二抗(KPL公司，074-1806) 室温下孵育1h，TBST缓冲液洗膜5次，ECL试剂盒(Pierce公司)显色。以细胞 骨架蛋白GAPDH为内参。

结果如图1所示，7例患者中，与对照组相比，实验组中S 100A9蛋白的表达水 平均明显上升。这一结果表明S100A9蛋白的表达水平可用于检测或辅助检测肝细 胞癌。

实施例2、酶联免疫吸附实验临床验证HCC病人S100A9蛋白表达上调

一、实验材料

血清样本来自：健康的正常人(N)20例；乙型肝炎病毒感染患者(未转化为 肝硬化及肝细胞癌，CHB)20例；HBV感染肝硬化患者(未转化为肝细胞癌，LC) 19例；继发于HBV感染的肝细胞癌患者(HCC)20例。

其中，正常人血清来自健康自愿者；经临床乙肝五项诊断为慢性乙型肝炎感染 患者，肝硬化患者和肝细胞癌患者(检测血清中AFP联合影像学检测的方法确诊) 均为临床确诊病人的血清样本，这四种临床血清样本由北京肿瘤医院及解放军302 医院提供。

二、实验方法

对血清样本中的S100A9蛋白水平进行ELISA检测，所用试剂盒为CircuLex公 司S100A9/MRP14 ELISAKit(货号：CY-8062)，具体方法如下：

1、将浓度为0.1mg/ml的S100A9蛋白一抗(CircuLex公司，CY-8062，随试剂 盒配备)用包被缓冲液(CircuLex公司，CY-8062，随试剂盒配备的coating buffer) 进行稀释，按照S100A9蛋白一抗与包被缓冲液的体积比为1∶100的比例稀释后加入 到酶标板中，每孔100μL，4℃湿盒内包被过夜。

2、洗板：每孔加350μl洗液(CircuLex公司，CY-8062，随试剂盒配的wash buffer)， 洗涤4次。

3、封闭：每孔加入120μL封闭液(CircuLex公司，CY-8062，随试剂盒配备的 block solution)，湿盒内37℃孵育1h，然后甩掉封闭液。

4、一方面，分别取浓度为0pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、400pg/ml、 800pg/ml、1600pg/ml和3200pg/ml的S100A9标准蛋白，重复3次，每孔100μL， 用于制作标准曲线。

另一方面，用样品稀释液(CircuLex公司，CY-8062随试剂盒配的sample buffer)， 按照1∶50的比例将步骤一中各组血清样品进行稀释，然后每孔加入100μL，重复3 次。

5、各样本室温(18-25℃)水平摇床(300rpm)孵育1h后，每孔加350μl洗液 (CircuLex公司，CY-8062，随试剂盒配的wash buffer)，洗涤4次。

6、每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的人S100A9抗体100μl，室温(18-25℃) 水平摇床(300rpm)孵育1h后，每孔加200μl洗液，洗涤4次。

7、加入显色底物试剂(底物为TMB)100μl/孔，室温(18-25℃)显色10-15 分钟；加入终止液(2M H₂SO₄)100μl/孔，450/540nm波长测定各孔样本的OD值。

8、通过S100A9标准蛋白浓度和其对应的OD值绘制标准曲线。通过各孔血清 样本所测得的OD值，利用GraphPad Prism 5软件对S100A9的标准曲线进行拟合， 计算各血清样本中S100A9蛋白的含量。

9、用SPSS软件分别对健康的正常人(N)、乙型肝炎病毒感染患者(CHB)、 肝硬化患者(LC)和肝细胞癌患者(HCC)血清中S100A9蛋白水平进行ROC曲 线分析。

S100A9蛋白表达水平在正常组、慢性乙型肝炎病毒感染组、LC患者组、HCC 患者组的血清样本中的ELISA检测结果如图2和表1所示，其中正常组S100A9蛋 白的浓度平均值为1.97ng/ml，慢性乙型肝炎病毒感染组为2.34ng/ml，LC患者组为 1.29ng/ml，HCC患者组为8.56ng/ml。对各组样本中S100A9蛋白含量进行统计学分 析，发现正常组和HCC患者组、HBV感染组与HCC患者组、LC患者组和HCC 患者组血清S100A9蛋白水平均有显著性差异。

以正常组为对照组，HCC患者组为疾病组，对血清中S100A9蛋白水平进行ROC 曲线分析，曲线下面积AUC＝0.883(如图3中A所示)；以LC患者组为对照组， HCC患者组为疾病组，AUC＝0.955(如图3中B所示)。

根据约登指数(灵敏度+特异度-1)计算最佳工作点：

(1)以正常组为对照组、HCC患者组为疾病组，即在不知道待检测者是否患 病，患有何种疾病的情况下进行检测，判定为HCC患者的阈值为S100A9蛋白浓度 ＞3.12ng/ml。此时，其灵敏度为80％、特异度为50％，约登指数为0.75。详见表2 (将诊断标准定在正确诊断指数最大处，表中粗体部分)。具体的，当以正常人作为 筛查对象时，根据上述结果，得到筛查结果判定标准如下：如果筛查对象的血清中 S 100A9蛋白的浓度大于3.12ng/ml，则判定该筛查对象患有或疑似患有肝细胞癌 (HCC)。

(2)以LC患者组为对照组、HCC患者组为疾病组，即在已知待检测者患LC 的情况下进行检测，判定为HCC患者的阈值为S100A9蛋白浓度＞3.02ng/ml。此时， 其灵敏度为80％、特异度为100％，约登指数为0.8。详见表3(将诊断标准定在正 确诊断指数最大处，表中粗体部分)。具体的，当以肝硬化患者作为筛查对象时，根 据上述结果，得到筛查结果判定标准如下：如果筛查对象的血清中S100A9蛋白的 浓度大于3.02ng/ml，则判定该筛查对象患有或疑似患有肝细胞癌(HCC)。

表1各样本血清中S100A9蛋白的浓度(ng/ml)

  编号   N   CHB   LC   HCC   1   2.182   1.112   0.737   1.735   2   1.537   4.421   1.081   4.638   3   2.284   1.268   0.881   6.415   4   1.333   1.962   0.762   1.772   5   1.662   3.491   0.841   3.817   6   1.554   1.772   1.467   3.971   7   3.035   0.004   1.052   24.720   8   2.061   4.340   2.561   3.152

  9   1.519   1.626   0.841   29.098   10   1.885   137.549   1.809   4.421   11   0.965   1.608   1.022   20.224   12   2.243   6.975   0.854   1.982   13   1.236   1.433   1.220   1.626   14   2.121   1.662   1.268   19.199   15   1.067   4.556   0.000   6.292   16   3.082   1.189   2.715   14.059   17   2.081   1.885   1.220   5.170   18   4.049   1.772   2.896   7.517   19   1.716   2.041   0.895   6.943   20   1.866   1.502   1.753   4.529   平均值   1.974   2.348   1.294   8.564

注：编号为10的CHB样本血清中S100A9蛋白的浓度为137.549ng/ml，该数值在CHB样本组 中是一个偏离较远的数值，故而在计算平均值时将其删除。

表2以正常组为对照组的阈值、灵敏度、特异度及约登指数

  阈值   灵敏度   1-特异度   约登指数   0.964   1.000   1.000   0.000   1.016   1.000   0.950   0.050   1.151   1.000   0.900   0.100   1.284   1.000   0.850   0.150   1.426   1.000   0.800   0.200   1.528   1.000   0.750   0.250   1.546   1.000   0.700   0.300   1.590   1.000   0.650   0.350   1.644   0.950   0.650   0.300   1.689   0.950   0.600   0.350   1.726   0.950   0.550   0.400   1.753   0.900   0.550   0.350   1.819   0.850   0.550   0.300   1.876   0.850   0.500   0.350   1.934   0.850   0.450   0.400   2.021   0.800   0.450   0.350   2.071   0.800   0.400   0.400   2.101   0.800   0.350   0.450   2.151   0.800   0.300   0.500   2.212   0.800   0.250   0.550

  2.264   0.800   0.200   0.600   2.660   0.800   0.150   0.650   3.058   0.800   0.100   0.700   3.117   0.800   0.050   0.750   3.485   0.750   0.050   0.700   3.894   0.700   0.050   0.650   4.010   0.650   0.050   0.600   4.235   0.650   0.000   0.650   4.475   0.600   0.000   0.600   4.584   0.550   0.000   0.550   4.904   0.500   0.000   0.500   5.731   0.450   0.000   0.450   6.354   0.400   0.000   0.400   6.679   0.350   0.000   0.350   7.230   0.300   0.000   0.300   10.788   0.250   0.000   0.250   16.629   0.200   0.000   0.200   19.711   0.150   0.000   0.150   22.472   0.100   0.000   0.100   26.909   0.050   0.000   0.050   29.099   0.000   0.000   0.000

表3以LC患者组为对照组的阈值、灵敏度、特异度及约登指数

  阈值   灵敏度   1-特异度   约登指数   0.736   1.000   1.000   0.000   0.750   1.000   0.947   0.053   0.802   1.000   0.895   0.105   0.847   1.000   0.789   0.211   0.868   1.000   0.737   0.263   0.888   1.000   0.684   0.316   0.959   1.000   0.632   0.368   1.037   1.000   0.579   0.421   1.067   1.000   0.526   0.474   1.151   1.000   0.474   0.526   1.244   1.000   0.368   0.632   1.368   1.000   0.316   0.684   1.546   1.000   0.263   0.737   1.680   0.950   0.263   0.687   1.744   0.900   0.263   0.637

  1.763   0.900   0.211   0.689   1.791   0.850   0.211   0.639   1.896   0.850   0.158   0.692   2.272   0.800   0.158   0.642   2.638   0.800   0.105   0.695   2.806   0.800   0.053   0.747   3.024   0.800   0.000   0.800   3.485   0.750   0.000   0.750   3.894   0.700   0.000   0.700   4.196   0.650   0.000   0.650   4.475   0.600   0.000   0.600   4.584   0.550   0.000   0.550   4.904   0.500   0.000   0.500   5.731   0.450   0.000   0.450   6.354   0.400   0.000   0.400   6.679   0.350   0.000   0.350   7.230   0.300   0.000   0.300   10.788   0.250   0.000   0.250   16.629   0.200   0.000   0.200   19.711   0.150   0.000   0.150   22.472   0.100   0.000   0.100   26.909   0.050   0.000   0.050   29.099   0.000   0.000   0.000

本发明S100A9蛋白在由肝硬化晚期诊断为肝细胞癌方面的灵敏度和特异度均 优于现有技术公开的AFP蛋白(Wang，C.S.，C.L.Lin，H.C.Lee，et al.Usefulness of  serum des-gamma-carboxy prothrombin in detection of hepatocellular carcinoma.World J Gastroenterol.2005，11(39)：6115-6119)，具体如表4所示。

表4S100A9蛋白和AFP蛋白在由肝硬化晚期诊断为肝细胞癌方面的灵敏度和特 异度的比较

上述结果说明S100A9是可用作从健康人及肝硬化患者中筛查判别诊断HCC 的潜在标志物，且依靠检测筛查对象血清中的S100A9蛋白浓度筛查HCC的方法 结果准确，操作简便。