假单胞菌JY-Q菌株及其用于降解再造烟叶浓缩液中尼古丁的应用

摘要

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株新的尼古丁高效降解菌及其用于降解再造烟叶浓缩液中的尼古丁。假单胞菌（

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株新的尼古丁高效降解菌及其用于降解再造烟叶浓缩液中的尼古丁。

背景技术

尼古丁(Nicotine，烟碱)，化学名称为1-甲基-2(3-吡啶基)-吡咯烷，做为天然生物碱在烟草植物中占主要成分，是环境重要污染物之一。一些微生物可以通过不同的代谢途径（如吡啶途径，吡咯途径，脱甲基化途径等）利用尼古丁，其中一些菌株具有应用价值。近年来，利用微生物降解尼古丁已成为国内外研究的热点之一。

再造烟叶浓缩液中的尼古丁含量偏高是目前薄片企业急待解决的实际问题。在造纸法再造烟叶生产工艺中，烟末和烟梗被水提成母液、浓缩成浓缩液后，重新回涂到再造烟叶片基上。而烟末中含有约2-3 %的烟碱，易造成薄片产品的尼古丁含量偏高和不可调控。目前主要靠低烟碱烟梗浓缩液与高烟碱含量的烟末浓缩液的比配来实现，但这种通过物理手段的调配（如增加烟梗母液的参配比例），对薄片品质的负面影响较大。因而需要研究和利用其他技术（如生化技术）来直接处理浓缩液，实现对尼古丁指标的可调可控。 

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的一个目的是提供一株假单胞菌（Pseudomonas sp.）JY-Q菌株，该菌株是从造纸法再造烟叶生产工艺线的烟末母液中分离筛选得到，并可应用于生产工艺线的浓缩液中尼古丁的生物降解。本发明的二个目的是提供该菌株在降解尼古丁中的应用。本发明的二个目的是提供用于所述的假单胞菌JY-Q菌株的富集培养基，

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

假单胞菌（Pseudomonas sp.）JY-Q菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2013年5月28日，保藏编号：CCTCC NO: M 2013236。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：上述的假单胞菌JY-Q菌株的应用，该菌株用于尼古丁的降解。

作为优选，该菌株用于再造烟叶浓缩液中尼古丁的降解。作为再优选，所述的再造烟叶浓缩液的pH为6.5-7.0。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

用于所述的假单胞菌JY-Q菌株的富集培养基，其特征在于该培养基包括以下组分构成：Na₂HPO₄ 5.57 g·L^-1, KH₂PO₄ 2.44 g·L^-1,（NH₄）₂SO₄ 1 g·L^-1, MgCl₂·6H₂O 0.2 g·L^-1, MnCl₂·4H₂O 0.0004 g·L^-1, FeCl₃·6H₂O 0.001 g·L^-1, CaCl₂ 0.001 g·L^-1，尼古丁 2 g·L^-1, pH=7.0。

本发明的菌株是从杭州利群环保纸业公司提供的烟末母液中筛选得到，24h可将基本培养基中含量为5 g/L的尼古丁完全降解，在造纸法再造烟叶生产工艺中有广泛的工业化应用前景。

附图说明

图1. 电镜图片Electron micrograph (25000×)。

图2. 基因组电泳图。

图3. 16s rDNA PCR电泳图。

图4. 基于菌株16S rDNA序列构建的系统发育树。

图5. 不同尼古丁浓度对Pseudomonas sp. JY-Q降解影响图。

图6. 不同温度对Pseudomonas sp.JY-Q降解影响图。

图7. 不同pH对Pseudomonas sp.JY-Q降解影响图。

图8. Pseudomonas sp.JY-Q在5%浓缩液中降解应用图。

微生物保藏声明

假单胞菌（Pseudomonas sp.）JY-Q菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2013年5月28日，保藏编号：CCTCC NO: M 2013236。

具体实施方式

实施例1菌株筛选及鉴定

1.1 菌株筛选

1.1 .1 样品

造纸法再造烟叶生产工艺中的烟末母液，由杭州利群环保纸业公司提供。

1.1 .2 菌株筛选分离

    培养基

基本无机盐培养基（basic inorganic salt medium,BSM）：Na₂HPO₄ 5.57 g·L^-1, KH₂PO₄ 2.44 g·L^-1, K₂SO₄ 1 g·L^-1, MgCl₂·6H₂O 0.2 g·L^-1, MnCl₂·4H₂O 0.0004 g·L^-1, FeCl₃·6H₂O 0.001 g·L^-1, CaCl₂ 0.001 g·L^-1, 尼古丁（根据需要含量添加），pH=7.0。

富集培养基：Na₂HPO₄ 5.57 g·L^-1, KH₂PO₄ 2.44 g·L^-1,（NH₄）₂SO₄ 1 g·L^-1, MgCl₂·6H₂O 0.2 g·L^-1, MnCl₂·4H₂O 0.0004 g·L^-1, FeCl₃·6H₂O 0.001 g·L^-1, CaCl₂ 0.001 g·L^-1，尼古丁 2 g·L^-1, pH=7.0。

培养基在115 ℃下灭菌30 min后使用。

尼古丁降解菌的筛选分离：在100 mL无菌水中加10 mL烟末母液， 180 r·min^-1下振荡10 min；取10 mL浸出液添加到100 mL富集培养基中（尼古丁含量2g/L），在180 r·min^-1、30 ℃条件下富集培养5天。将富集培养液稀释至10^-1-10^-5倍，涂布在BSM琼脂培养基上（尼古丁含量2g/L），30 ℃下培养48 h。挑取单菌落，划线在新鲜的BSM琼脂培养基上，直到获得纯化的菌。再将获得的已纯化的菌接种至液体BSM中，30 ℃摇床培养，观察培养液变化。

1.2 菌株鉴定

1.2.1 尼古丁降解菌Pseudomonas sp. JY-Q形态学鉴定

如图1所示，菌落浅黄色，有金属光泽，圆形，凸起，润泽，边缘整齐，无芽孢，电镜观察菌体呈杆状，大小为（0.6~0.8）μm×（2.0~1.2 ）μm，端生鞭毛，鞭毛数1~2根。

1.2 .2 尼古丁降解菌Pseudomonas sp. JY-Q生理生化鉴定

菌株能以尼古丁为唯一碳氮源和能源生长，好氧，革兰氏染色呈阴性，4℃生长，42℃不生长，可以利用葡萄糖、果糖，接触酶试验阳性，甲基红试验阳性。

1.2 .3 尼古丁降解菌Pseudomonas sp. JY-Q分子生物学鉴定

16s rDNA测序：

E.Z.N.A.TM Bacterial DNA Kit试剂盒提取基因组，以提取的基因组为模板，16s rDNA 通用引物（其正向引物序列:5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,反向引物序列为:5‘-CGGCTACCTTGTTACGACTTC-3’）进行PCR扩增。

PCR 50μL体系：

   Takara Taq                         0.6μL

   10× PCR Buffer （Mg²⁺）           5μL

   dNTP                              4μL

   模板                              2μL

   引物1                             1μL

   引物2                             1μL

   ddH₂O                             36.4μL。

PCR程序：

1.    94℃                  4min

2.    94℃                  50s

3.    52℃                  1min

4.    72℃                  2min

5.    循环2---4步骤 29次

6.    72℃                  10min

7.    16℃                  恒温。

图2为基因组电泳图，Line 1 DNA marker；Line 2 genome；图3为 16s rDNA PCR电泳图， Line 1 DNA marker；Line 2 16s rDNA PCR fragment 。

16s rDNA测序结果：

TGGTACCGTCCTCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTGTGAGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGCATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAAATCTCAAGGATTCCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCGTACTCTAGCTTGCCAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCCAACTTAACAAACCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACAGCAAGGTATTAACTTACTGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTTCCTTTCGAAACGTTGTCCCCCACTACCAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTGAATCAAGGAGCAAGCTCCCGTCATCCGCTCGACTTGCATGTGT。

将测序结果提交至genebank，获得登录号KC963965。

并将菌株保存至中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2013236。

经形态，生理生化，16S rDNA同源性分析，鉴定该菌株属于Pseudomonas .，命名为Pseudomonas sp. JY-Q。

实施例2 菌种Pseudomonas sp. JY-Q的降解特性

2.1不同尼古丁浓度对Pseudomonas sp. JY-Q降解影响

在250mL三角瓶中，将1mL菌液接种到50mL含有不同尼古丁含量（1g/L, 2g/L, 3g/L, 4g/L, 5g/L）的基本培养基中。180r/min，37℃摇床培养。连续测定尼古丁的降解及菌体的生长状况，如图5所示。Pseudomonas sp. JY-Q具有较高的尼古丁耐受性和降解效率。12h可将基本培养基中含量为2-3 g/L尼古丁完全降解，24 h可将基本培养基中含量为5 g/L尼古丁完全降解。

2.2不同温度对Pseudomonas sp.JY-Q降解影响

在250mL三角瓶中，将1mL菌液接种到50mL尼古丁含量为2g/L的基本培养基中。180r/min，不同温度（25℃,30℃,37℃）摇床培养。连续测定尼古丁的降解及菌体的生长状况，如图6所示。Pseudomonas sp. JY-Q在25℃,30℃,37℃三个温度范围内，37℃下降解速度最快，12h可将尼古丁含量为2g/L的基本培养基完全降解。但不同温度对菌株降解尼古丁影响不大。

2.3 不同pH对Pseudomonas sp.JY-Q降解影响

在250mL三角瓶中，将1mL菌液接种到50mL尼古丁含量为2g/L的基本培养基中。180r/min，37℃,不同pH（5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 9）摇床培养。培养12h时检测尼古丁的降解及菌体的生长状况，如图7所示。Pseudomonas sp. JY-Q降解尼古丁最适pH为6.5-7，当pH小于6或大于7.5都会对菌株降解尼古丁造成较大的抑制作用。

2.4 Pseudomonas sp.JY-Q在浓缩液中的降解应用

在250mL三角瓶中，将适量菌液接种到50mL尼古丁含量为1.139g/L的5%浓缩液中。180r/min，37℃摇床培养。连续测定尼古丁的降解情况，如图8所示。Pseudomonas sp.JY-Q对5%浓缩液中尼古丁具有降解作用，12h可将其全部降解。

序列表

<110>浙江中烟工业有限责任公司

<120>假单胞菌JY-Q菌株及其用于降解再造烟叶浓缩液中尼古丁的应用

<160>1

 

<210> 1

<211> 1412

<212> 16s rDNA

<213> 假单胞菌（Pseudomonas sp.）JY-Q菌株

<400> 1

   1 TGGTACCGTC CTCCCGAAGG TTAGACTAGC TACTTCTGGT GCAACCCACT CCCATGGTGT

  61 GACGGGCGGT GTGTACAAGG CCCGGGAACG TATTCACCGC GACATTCTGA TTCGCGATTA

 121 CTAGCGATTC CGACTTCACG CAGTCGAGTT GCAGACTGCG ATCCGGACTA CGATCGGTTT

 181 TGTGAGATTA GCTCCACCTC GCGGCTTGGC AACCCTCTGT ACCGACCATT GTAGCACGTG

 241 TGTAGCCCAG GCCGTAAGGG CCATGATGAC TTGACGTCAT CCCCACCTTC CTCCGGTTTG

 301 TCACCGGCAG TCTCCTTAGA GTGCCCACCA TAACGTGCTG GTAACTAAGG ACAAGGGTTG

 361 CGCTCGTTAC GGGACTTAAC CCAACATCTC ACGACACGAG CTGACGACAG CCATGCAGCA

 421 CCTGTGTCAG AGTTCCCGAA GGCACCAATC CATCTCTGGA AAGTTCTCTG CATGTCAAGG

 481 CCTGGTAAGG TTCTTCGCGT TGCTTCGAAT TAAACCACAT GCTCCACCGC TTGTGCGGGC

 541 CCCCGTCAAT TCATTTGAGT TTTAACCTTG CGGCCGTACT CCCCAGGCGG TCAACTTAAT

 601 GCGTTAGCTG CGCCACTAAA ATCTCAAGGA TTCCAACGGC TAGTTGACAT CGTTTACGGC

 661 GTGGACTACC AGGGTATCTA ATCCTGTTTG CTCCCCACGC TTTCGCACCT CAGTGTCAGT

 721 ATCAGTCCAG GTGGTCGCCT TCGCCACTGG TGTTCCTTCC TATATCTACG CATTTCACCG

 781 CTACACAGGA AATTCCACCA CCCTCTACCG TACTCTAGCT TGCCAGTTTT GGATGCAGTT

 841 CCCAGGTTGA GCCCGGGGCT TTCACATCCA ACTTAACAAA CCACCTACGC GCGCTTTACG

 901 CCCAGTAATT CCGATTAACG CTTGCACCCT CTGTATTACC GCGGCTGCTG GCACAGAGTT

 961 AGCCGGTGCT TATTCTGTCG GTAACGTCAA AACAGCAAGG TATTAACTTA CTGCCCTTCC

1021 TCCCAACTTA AAGTGCTTTA CAATCCGAAG ACCTTCTTCA CACACGCGGC ATGGCTGGAT

1081 CAGGCTTTCG CCCATTGTCC AATATTCCCC ACTGCTGCCT CCCGTAGGAG TCTGGACCGT

1141 GTCTCAGTTC CAGTGTGACT GATCATCCTC TCAGACCAGT TACGGATCGT CGCCTTGGTG

1201 AGCCATTACC CCACCAACTA GCTAATCCGA CCTAGGCTCA TCTGATAGCG CAAGGCCCGA

1261 AGGTCCCCTG CTTTCTCCCG TAGGACGTAT GCGGTATTAG CGTTCCTTTC GAAACGTTGT

1321 CCCCCACTAC CAGGCAGATT CCTAGGCATT ACTCACCCGT CCGCCGCTGA ATCAAGGAGC

1381 AAGCTCCCGT CATCCGCTCG ACTTGCATGT GT