用于在存在以闪光形式不连续地提供光的情况下培养兼养单细胞藻类的方法

摘要

本发明涉及用于培养兼养单细胞藻类的新方法，其使得能够富集这些藻类的脂质内容物，所述富集通过可变地或不连续地（尤其是以闪光形式）提供光来诱导。

说明书

本发明涉及用于在兼养条件下培养单细胞藻类（微观藻类）的新 方法，其使得能够尤其是富集这些藻类的脂质内容物。

该方法基于随时间在培养基中可变地或不连续地提供光，所述提 供引起所述藻类的培养产率和脂质含量的增高。

序言

鉴于其作为食品补充剂的直接用途或者作为用于绿色化学的原材 料的间接用途，单细胞藻类目前是许多工业计划的目标。

特别地研究了来源于这些微观藻类的脂质，因为它们具有极好的 营养品质。特别地，它们含有必需的长链多不饱和脂肪酸（PUFA）， 例如EPA和DHA，其尤其被用于母乳代用品的配制中。在水产养殖业 中，微观藻类充当鱼油和鱼粉的代用品。

由于在有利的条件下，微观藻类能够积累高达其干重的80%的脂 肪酸，因而它们为栽培陆生油料植物以生产生物燃料提供了可靠的备 选方案[Li,Y等人,2008Biotechnol.Prog.,24:815-820]。

单细胞藻类表现为具有自养特征的光合微生物，即它们具有通过 光合作用自主地生长的能力。

大多数在淡水或海洋中遇到的单细胞藻类物种是严格自养的，即 它们只能通过光合作用生长。对于它们，在其环境中含碳底物或有机 物质的存在对其并不是有利的，甚至倾向于抑制其生长。

然而，一些非常不同的科和起源的单细胞藻类物种经证实不是严 格自养的。它们中的称为异养生物的一些物种能够在完全不存在光的 情况下通过发酵（即通过利用有机物质）进行成长。

其他藻类物种（对于它们来说，光合作用对其成长仍是必不可少 的）能够同时利用光合作用和在其环境中存在的有机物质。这些称为 兼养生物的中间物种可以同时在光和有机物质存在下进行培养。

称为“兼养生物”的藻类的该特性看起来与其代谢有关，所述代 谢允许它们能同时进行光合作用和发酵。这两种代谢类型共存，其中 对于藻类的生长具有正的总体效应[Yang C.等人,(2000) Biochemical Engineering Journal6:87-102]。

目前，藻类的分类仍广泛地基于形态学标准和它们所包含的光合 色素的性质。该分类很少提供关于自养、异养或兼养特征的情况，而 后者涵盖非常多种多样的物种和形态[Dubinsky等人,2010, Hydrobiologia,639:153-171]。

因此，如果通过实验可以证明一个藻株具有在其中添加了含碳底 物（例如葡萄糖、乙酸盐或甘油）的无机环境之中通过光合作用进行 生长的能力，那么它就被认为是兼养的。如果含碳底物的该补充在光 照期期间不导致生长抑制，那么可以认为该藻株是兼养的。

如果对于一些藻类物种，能够在兼养条件下生长的事实使得能够 在理论上在培养物中达到在细胞生物量和脂质生产方面更好的产率 [Ceron Garcia M.C.等人,2000,Journal of Applied Phycology,13: 239-248]，那么这样的产率水平仅是很少达到的。

这是因为，用于获得最佳产率的“光的量/待引入培养基中的含碳 底物的量”比例的管理仍是难以确定的[Lee Y.K.等人,2001,Journal  of Applied Phycology,13:307-315]，尤其是关于产生可利用的量 的脂质。

因此，继续存在需要来改善目前的用于培养兼养微观藻类的方法 以获得确保大生物量和高脂质浓度的生产条件。

从在不同的微观藻类物种上所进行的工作之中，已确定，光强度 对于在兼养方式下实施的培养物的数量和质量产率具有直接影响。

因此，与在自养方式下所施行的那种相等的光强度对于实施在兼 养方式下的藻类培养来说通常是过强的。由于该光抑制现象，减少光 强度以获得更好的产率常常是恰当的[Liang Y.等人,2009, Biotechnol.Lett.,31:1043-1049；Chojnacka,K.等人,2004, Enzyme and Microbial Technology,34:461-465；Bouarab L.等人, 2004,Water Research,38:2706-2712；Jeon Y.C.等人,2006,Enzyme and Microbial Technology,39:490-495]。

由于工业规模的藻类培养常常在露天下（即用天然光照）来进行， 因此为了决定在兼养方式下的培养的最佳条件而进行的实验通常以连 续光照期来进行。在一些情况下，每天光照期与黑暗期交替（光周期）， 从而重现白天和夜晚。然而，在现有技术中并没有考虑到提供给培养 物的光强度随时间的重复交替或显著变化。

关于使自养（光照的）方式和异养（黑暗的）方式的培养期（各 数小时）交替的培养的先前实验，由于藻类必需适应培养条件的变换， 因而在培养的优化方面显得令人失望。已观察到与所谓的光活化现象 有关的在每个周期开始时的潜伏期，其参与培养产率的下降[Ogbonna  J.C.等人,1997,Journal of Applied Phycology9:359-366]。

毫无疑问，这正是为什么关于优化在兼养方式下的藻类培养的不 同工作的作者没有认为光照期和黑暗期的交替可以对于培养产率具有 有利效应的原因。

令人惊奇地，相反地，发明人发现，不连续地提供光无损于在兼 养方式下进行的培养的产率。尤其是观察到，通过使光强度发生变化 （要么经由黑暗期和光照期（闪光）的间隔很近的交替，要么经由使 光强度随时间波动），可以对于在生物量方面的培养产率，和更特别 地对于细胞的脂质含量起正面的作用。

在这些观察结果的基础上，发明人制定了用于培养兼养藻类的方 法，其使得能够一方面达到更高的生物量，和另一方面富集藻类的脂 质内容物。该方法建立在随时间可变地或不连续地提供光的基础上。

作为本申请目标的该方法看起来能够推广至非常众多的兼养单细 胞藻类物种。

下面详细说明本发明的不同的方面和优点。

图1：该图比较了分别在兼养形式下在根据本发明提供闪光形式 的光的条件下（△）和在自养方式下（即以连续的光）（◆）实现的 四爿藻属（Tetraselmis）培养物的生物量。

图2：该图比较了分别在兼养形式下在根据本发明提供闪光形式 的光的条件下（×）和在自养方式下（□）培养的四爿藻属细胞的脂 质含量。

详细描述

因此，本发明的目标在于用于培养单细胞藻类的方法，其使得能 够增加其生物量和富集其脂质内容物。

该方法还使得能够选择出特别适合于在兼养方式下生产脂质的微 观藻类的藻株。

该方法的特征在于提供给培养中的藻类的光流是随时间可变的或 不连续的。

与所接受的看法相反，看来培养物（尤其是在兼养方式下）的可 变的或不连续的光照对于藻类的成长具有有利的影响，并且使得能够 通过这些藻类而增加脂质生产。

并不束缚于该理论，发明人估计，不连续地或可变地提供光的效 应在于在藻类中引起对于脂质合成有利的应激。这是因为，在自然界 中，藻类积累脂质储备物以抵抗其环境的限制是常见的。

“不连续的光照”应当理解为由黑暗期隔断的光照。黑暗期可以 占超过四分之一的在其期间对藻类进行培养的时间，优选地一半的时 间或更多。

根据本发明的一个优选的方面，以闪光的形式，即在短的持续时 间时间段内提供不连续的光照。因而，相继的光照期通常在5秒和10 分钟之间，优选地在10秒和2分钟之间，更优选地在20秒和1分钟 之间。

“可变的光照”应当理解为提供其强度随时间周期性或非周期性 地故意变化的光。

根据本发明，光照可以连续地变化，即光强度不是恒定的并且随 时间持久地变化（(dμmol(光子)/dt≠0)。

根据本发明，还可以进行将连续光照期和不连续光照期相联合的 光提供。

特别地，本发明旨在用于培养单细胞藻类的方法，其特征在于， 所述藻类在存在随时间不连续地或可变地提供光的黑暗中进行培养， 所述光的以光子的微摩尔数表示的强度按照数次/小时，以高于或等于 10μmol.m^-2.s^-1的幅度变化。

这些不连续的或可变的不同光照模式的共同点在于这样的事实： 根据本发明，提供给培养中的藻类的光强度（其表示为光子的微摩尔 数/秒/平方米（μmol.m^-2.s^-1））在同一个小时内变化数次，遵循通 常高于8μmol.m^-2.s^-1，优选地高于或等于10μmol.m^-2.s^-1，更优 选地高于或等于15μmol.m^-2.s^-1的幅度。换言之，每个小时，优选 地在该小时内数次地，光强度达到高值和低值，所述高值和低值之差 等于或大于上面所指出的。优选地，所述光强度在该小时内相继地达 到2μmol.m^-2.s^-1和10μmol.m^-2.s^-1这些值（即经过这些值），更 优选地0μmol.m^-2.s^-1和50μmol.m^-2.s^-1这些值，更加优选地0 和20μmol.m^-2.s^-1这些值。

应当提醒的是，1μmol.m^-2.s^-1相应于1μE m^-2.s^-1（爱因斯坦）， 其是在本申请的实施例中所使用的单位。

根据本发明的一个优选的方面，所述光强度在值0和20μmol.m^-2. s^-1之间，优选地在0和50μmol.m^-2.s^-1之间变化。

在培养物中的光提供可以通过分布在发酵罐外壁周围的灯来获 得。一个时钟以确定的光照时间开启这些灯。发酵罐优选地位于可以 控制其环境温度的避开日光的围壳中。

更特别地，根据本发明的方法适用于能够在兼养条件下生长的单 细胞藻类。

如在本申请的序言中所指出的，在兼养方式下的藻类培养被定义 为在富含含碳底物的培养基中以自养方式进行的培养。

优选地，所述含碳底物包括下列或由下列组成：乙酸盐、葡萄糖、 纤维素、淀粉、乳糖、蔗糖或甘油。

在本发明的范围内，如果一种藻类物种出现下述情形，那么它就 被认为是兼养的：该藻类物种可以在其中按照例如等于或高于5mM 的碳（甘油或乙酸盐）浓度添加了含碳底物的基本培养基（例如MM 或f/2）之中在光下进行培养，而没有观察到生长抑制，即没有看到 相比于在没有含碳底物的相同基本培养基中（即在自养方式下）进行 的培养而言的以干重计的生物量的损失。

为了本发明，将优选地使用这样的兼养微观藻类，其中至少25%， 优选地至少50%的由它们所产生的能量来自藻类对于所述含碳底物的 利用。

所述培养基应当包含足够用于发酵的量的含碳底物，但不要过高， 以避免抑制藻类的生长。优选地，根据本发明的培养基包含低于10 g/L，优选地4至6g/L的可用葡萄糖的浓度。

根据本发明的一个优选的方面，所述含碳底物包括乙酸盐，优选 地乙酸钠，其在培养基中的浓度通常为5mM至50mM，优选地15至 25mM。

有利地，将选择取自下列类别中的兼养藻类物种：裸藻纲 （Euglenophyceae）、真绿藻纲（Prasinophyceae）、真眼点藻纲 （Eustigmatophyceae）、硅藻纲（Bacillariophyceae）、普林藻纲 （Prymnesiophyceae）、普林藻纲、脂藻纲（Pinguiophyceae）、真 眼点藻纲、硅藻纲、甲藻纲（Dinophyceae）、共球藻纲 （Trebouxiophyceae）、囊壳藻纲（Bicosoecophyceae）、曳鞭藻纲 （Katablephariophyceae）、甲藻纲、绿藻纲（Chlorophyceae）、 定鞭藻纲（Haptophyceae）、针胞藻纲（Raphidophyceae）、金藻纲 （Chrysophyceae）、圆筛藻纲（Coscinodiscophyceae）、囊泡虫类 （Alveolata）、红毛菜纲（Bangiophyceae）、红藻纲（Rhodophyceae）， 特别是产脂质的藻株，和优选地，在自养方式下产生至少5%的脂质的 藻株。

属于真绿藻纲的微观藻类优选地为四爿藻属物种（Tetraselmis  sp.）。

根据本发明的培养方法例如在兼养形式下在存在以闪光形式（优 选地20至30次闪光/小时）提供光的情况下来进行，所述光的强度通 常为5至50μmol.m^-2.s^-1，优选地5至15μmol.m^-2.s^-1。

根据本发明的一个优选的实例，向包含葡萄糖或者乙酸钠和乙酸 钙的培养基施加30次的强度为大约10μmol.m^-2.s^-1的30秒的闪光/ 小时。

所述培养基可以包含其他成分，例如钾、镁、微量元素和维生素。

一个优选的实施方案在于使用补料分批培养技术，其使得能够将 含碳底物维持在非抑制性的浓度，同时有利于生物量的增加。

优选地，在培养基中使用的葡萄糖为D-葡萄糖或右旋糖，特别是 来自淀粉的生物转化（例如从玉米、小麦或马铃薯开始）的右旋糖。 淀粉的水解产物由小尺寸的分子组成，这些小尺寸的分子也是可被藻 类容易地同化的，从而使得能够获得生物量的更好成长。

根据本发明的另一个方面，藻株的生长依赖于培养基中高浓度的 钙，即大于80mg/L的钙，和优选地120至190mg/L的钙的存在。

根据一个特别合适的实施方案，所述培养基包含3至10g/L的葡 萄糖和100至200g/L的钙。

有利地，这样的培养基使得能够获得大约18小时的潜伏时间，和 3至4小时的世代时间。

根据本发明的培养方法应当在允许良好的藻类生长的平均温度 （优选地4至32℃）下进行。

在这些条件下，观察到培养时间降至少于40小时，其中潜伏时间 和世代时间是非常短的。

如此，可以将根据本发明的方法获得的藻类用于膳食（尤其是动 物膳食）中，因为它们潜在地富含蛋白质和多不饱和脂肪酸（例如： EPA和DHA）。

根据本发明的一个优选的方面，前面所定义的培养方法还允许脂 质生产。

该用于生产脂质的方法的特征在于，所述方法包括一个或多个下 列步骤：

i)根据前面所描述的方法来培养单细胞藻类，和

ii)回收在步骤i)中培养的单细胞藻类，和

iii)提取在步骤ii)中回收的藻类的细胞内内容物的脂质。

脂质可以通过裂解细胞来进行提取，并根据本领域技术人员已知 的技术来进行分级分离。

如此获得的脂质可用于各种不同的应用之中，以多不饱和脂肪酸 的形式，尤其是作为食品补充剂例如鱼油的代用品，或者以甘油三酯 的形式，例如用于生物燃料的生产。

下述的实施例的目的在于举例说明本发明而不是对其进行限制。

实施例

I－兼养的四爿藻属物种藻株的靶定

1－藻株：

四爿藻属的藻株（n=78）订购自国际株系库CCAP（苏格兰）、SAG （德国）、CCMP（USA）和CSIRO（澳大利亚）。

2－培养基：

将淡水微观藻类在液体MM基本培养基[50mL/L Beijerink溶液 （8g/L NH₄Cl，1g/L CaCl₂，2g/L MgSO₄），1mL/L磷酸盐缓冲液 （106g/L K₂HPO₄，53g/L KH₂PO₄），1mL/L微量元素溶液（11.4g/L BO₃H₃，22g/L ZnSO₄7H₂O，5.06g/L MnCl₂4H₂O，4.99g/L FeSO₄7H₂O， 1.61g/L CoCl₂6H₂O，1.57g/L CuSO₄5H₂O，1.1g/L Mo₇O₂₄(NH₄)₆4H₂O， 50g/L EDTA），2.42g/L Trizma碱，用HCl调节至在7.2和7.4之 间的pH，1.2mg/L维生素B₁和0.01mg/L维生素B₁₂（即时添加）] 中和在固体MM培养基（+1.5%琼脂）中在自养形式下进行培养。

起初，将海洋微观藻类在重构的海水或液体f/2培养基[0.64g/L NaNO₃，0.74g/L KCl，26g/L NaCl或Tropic Marin盐，1g/L CaCl₂， 1.92g/L MgSO₄7H₂O，50mg/L NaH₂PO₄2H₂O，1mL/L微量元素溶液 （4.36g/L Na₂EDTA2H₂O，5.82g/L FeCl₃6H₂O，2.46g/L MnCl₂4H₂O， 34.5mg/L ZnSO₄7H₂O，12mg/L CoCl₂6H₂O，9.8mg/L CuSO₄5H₂O， 2.2mg/L Na₂MoO₄2H₂O），用HCl调节至在7.2和7.4之间的pH，0.1 mg/L维生素B₁，0.6mg/L维生素B₈和0.6mg/L维生素B₁₂（即时添加）] 中和在固体f/2培养基（+1.2%琼脂）中在自养形式下进行培养。

在兼养形式下和在异养形式下的微观藻类的培养在分别添加有下 列含碳底物的MM或f/2培养基中进行：5mM乙酸盐、5g/L葡萄糖、 10g/L乳糖、10g/L蔗糖和5g/L甘油。

3－在24-孔和96-孔微量培养板中在液体培养基中藻株生长的 高通量筛选：

通过在用透气的膜密封的24-孔（V=2mL）和96-孔（V=1mL） 微量培养板中在含碳底物存在下培养立即接收在MM培养基（淡水藻 株）或f/2培养基（海洋藻株）中的微观藻类藻株，评价了四爿藻属 藻株的异养和兼养特征。系统地实行了在自养形式下的生长的对照（MM 或f/2），以作为在兼养和异养形式下的培养的参照。

对于在自养和兼养形式下的培养，将微量培养板置于具有22℃、 60%的湿度和10μE的光强度的培养箱（SANYO MLR-351H）中；和对 于在异养形式下的培养，将微量培养板置于具有22℃、60%的湿度且 处于黑暗（0μE）的培养箱（BINDER KB53）中。

培养箱经过了改造，以便按照30次30秒的闪光/小时，以10μE 的闪光形式提供经调整的照明。

4－分别在兼养和异养形式下培养的微观藻类藻株的细胞内脂 质含量的通过分光荧光法的高通量筛选：

在对在24-孔或96-孔微量培养板中的生长进行监测3至4周后， 通过分光荧光法评价了兼养和异养微观藻类的细胞内脂质含量。用荧 光染料尼罗红（Nile Red）特异地对细胞内脂质进行标记。

响应于在488nm处的荧光激发，用尼罗红标记的中性脂质发射在 570nm处的荧光，而极性脂质发射在610-620nm处的荧光。

为此，将在兼养和异养条件下实现的微观藻类藻株的液体培养物 转移到96-孔PCR微量培养板中（V=100至200μl的培养物），并 且用1-2μl的尼罗红（0.1mg/mL）进行标记。在黑暗中温育20分 钟后，将该PCR微量培养板置于分光荧光计（Varian）中，并且进行 500至700nm的荧光发射的扫描。

通过在MM或f/2液体培养基上在96-孔微量培养板中的筛选评价 了闪光（自养和兼养的列）和含碳底物（例如葡萄糖（5g/L Glc）、 乙酸盐（1g/L Ac）、蔗糖（10g/L Sac）、乳糖（10g/L Lac）和 甘油（5g/L Gly））（兼养和异养的列）对于78个四爿藻属藻株的 生长的效应。在3至4周期间，每周两次通过培养物的肉眼观察和双 目显微镜（10×和32×物镜）观察来进行生长的监测。

5－结果：

在所测试的78个四爿藻属藻株中，22个具有异养特征，而仅7 个藻株经证实是严格自养的。这是因为，观察到所述22个异养藻株在 所测试的底物上在0μE下呈现出显著的生长，其相当于甚至高于在 自养形式下的生长。对于21个兼养藻株中的17个，四爿藻属藻株的 优选的含碳底物看起来是葡萄糖。当相比于在自养形式下的培养而言， 在光存在或不存在下含碳底物的添加并没有改善细胞生长时，这些藻 株被称为是严格自养的。在本情况下，光（10μE）和含碳底物的提 供允许71个四爿藻属藻株达到相当于或高于在自养形式下的对照的 那种的细胞浓度。因此，在兼养形式下的培养是用于培养最大数目的 四爿藻属藻株的最好条件。

在96-孔微量培养板中，在稳定期培养的条件下，在四爿藻属的 21个能够在连续和不连续照明下在兼养条件下生长的兼养藻株中评 价了光对于细胞内脂质的积累的效应。在实践上，将所述21个异养的 四爿藻属藻株中每个藻株的培养物等分试样（200μl）转移到96-孔 微量培养板上，然后用尼罗红（1μg/mL）进行标记。借助于分光荧 光计来收集反映了细胞内脂质的积累的荧光发射信号（中性脂质在 570nm处，和极性脂质在620nm处）。

对于所测试的21个藻株，相比于在连续光照方式下培养的那些而 言，在闪光存在下培养的藻株存在有更强烈的尼罗红标记。

II－在闪光方式下的兼养的四爿藻属物种藻株的生长

1－在生物反应器中四爿藻属物种藻株的培养：

将从在上面的部分I中所描述的筛选过程中选择出的21个兼养藻 株之中随机选取出的两个四爿藻属藻株在发酵罐（补料分批）中根据 本发明以闪光方式进行培养。同时，将相同的藻株以连续光照在自养 形式下进行培养。

在具有专用的自动装置和经由信息处理站的监管的有用的2L发 酵罐（BioController ADI1030）中进行培养。通过添加碱（1N的氢 氧化钠溶液）和/或酸（1N的硫酸溶液）来调节该系统的pH。将培养 温度固定在23℃。借助于根据Rushton结构安置在枢轴上的3个搅拌 活动体（下行式泵送的三桨叶螺旋桨）来进行搅拌。将搅拌速度和通 气流量调节至最小100rpm和最大250rpm，分别具有Q_最小=0.5vvm /Q_最大=2vvm。该生物反应器装配有围绕透明槽的外部灯光系统。 由信息处理站来安排所发射的光的强度以及光周期。用在恒温的 （22℃）、以100μE连续进行光照的围壳中在摇动台（140rpm）上 实现的预培养物接种反应器。预培养和在生物反应器中的培养在补充 有10mM NaHCO₃的f/2培养基中进行。为了在生物反应器中在兼养形 式下的培养而使用的含碳底物为具有20mM的浓度的乙酸钠。从培养 的92小时开始，每24小时添加浓缩的f/2培养基，以达到0.5×的 终浓度。对于“闪光式”在兼养形式下的培养，除了浓缩的f/2培养 基外，还添加5mM的乙酸钠。

2－以闪光形式的光提供：

在生物反应器中以闪光形式的光提供借助于分布在所述发酵罐的 外壁周围的LED灯来实现。一个时钟以光照时间或者以8至50μE的 脉冲来开启这些LED灯。闪光系统的光强度等于在自养形式下的对照 培养物中以连续方式使用的光强度。

3－生物量的监测：

通过测量干质量（在滤器GFC,Whatman上进行过滤，然后在称重 之前，在真空、65℃和-0.8巴下，在烘箱中干燥最少24小时）来监 测总生物量浓度。

4－细胞内脂质的定量：

总脂质的定量通过抽取10⁷个细胞/mL的样品来进行。脂质的提取 方法是由Bligh,E.G.和Dyer,W.J.[A rapid method of total lipid  extraction and purification(1959)Can.J.Biochem.Physiol. 37:911-917]所描述的方法。

3－结果：

在图1和2的图中报道了对于不同的培养物所获得的结果。

第一张图表明了相比于在自养方式下进行的相同藻株的培养而 言，当在闪光方式下进行培养时生物量的强劲增长（所选择的不同兼 养藻株的平均值）。

第二张图表明了在闪光方式下培养的细胞中高达30%的脂质积 累，其高于在自养方式下培养的细胞的脂质积累。

4－结论：

上面的研究显示，除了含碳底物外，对于不同的四爿藻属微观藻 类的培养物以闪光形式（30次的大约10μE的30秒的闪光/小时）提 供光，在所有具有兼养特征的培养物中引起细胞内脂质的显著更大的 积累。

在生物量方面，产率在兼养方式下（以闪光形式提供光）比在自 养形式下明显地更大。所获得的微观藻类浓度在100和150g/L之间 （图1），这比用在连续的光下进行的培养所获得的浓度高得多。

此外，根据本发明的用于培养单细胞藻类的方法使得能够将相同 藻类的培养时间降至少于40小时，其中潜伏时间和世代时间是非常短 的。