鸡IBV S1蛋白的CD8+T细胞抗原表位多肽

摘要

本发明提供了鸡IB病毒S1蛋白的通用性CD8+T细胞抗原表位多肽，属于基因和蛋白质工程领域。本发明根据单倍型鸡MHC I类分子的结合基序，在IBV病毒的S1基因氨基酸序列中筛选符合结合基序列的表位多肽21条；然后用构建的3种含有不同亚型IBV的S1基因的DNA重组质粒免疫SPF鸡，取其淋巴细胞，采用ELIspot法测定上述21条多肽诱导鸡脾淋巴细胞分泌IFN-γ的能力，最终筛选得到四条IBV通用功能性T细胞抗原表位多肽，其序列分别如SEQ ID NO.1-4所示。本发明提供的四条表位多肽联合使用可用于制备IBV通用疫苗。本发明还提供了用于筛选IBV S1蛋白功能性T细胞抗原表位的方法。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及鸡IBV S1蛋白的CD8+T细胞抗原表位多肽。 

背景技术

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是国际兽疫局（OIE）及我国规定的家禽B/二类传染病之一。该病是由传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus,IBV）引起的一种急性、高度传染性并具有重大经济意义的病毒病。发生于所有养禽国家，且病原存在多个临床表型，包括肾型、呼吸型和腺胃型等，并且常与新城疫（AIV）、禽流感（AIV）等病毒造成混合感染，给该病的防控带来较大困难。目前我国养鸡场这3种亚型IBV均有发现。 

市场上使用的IBV疫苗主要是活病毒疫苗和灭活病毒油佐剂疫苗，活病毒疫苗主要用于雏鸡的早期的保护或者是初次免疫使用，灭活疫苗一般用于加强免疫使用。由于IBV病毒十分容易失活，经常导致田间实验因疫苗的效力不足而失败。且常规疫苗仅能保护单一亚型IBV，无法产生交叉免疫保护作用。因此，研制能够保护多亚型IBV通用疫苗十分迫切且必要。通用疫苗构建策略主要是以功能性细胞表位为基础，将串联的功能性表位选择性偶联抗原嵌入适合载体，如核酸疫苗载体，病毒载体，重组酿酒酵母等进行免疫以获得交叉保护效力。其中T细胞表位主要能够激活CD8+T淋巴细胞产生保护性CTL免疫应答，可以对病毒多亚型产生交叉免疫保护作用，因此筛选功能性T细胞表位对于研究通用疫苗的意义就更为重要了。 

IBV属于冠状病毒科，是冠状病毒的代表株。S蛋白是构成冠状病毒最表层纤突的主要成分，由S1和S2两部分构成，IBV主要的细胞表位存在S1蛋白中，S1蛋白是决定IBV血清特异性抗原决定簇的主要蛋白。由于IBV血清型众多，S1是IBV变异程度最大的基因，不同毒株S1基因核苷酸变化 幅度可高达50%以上，在同一血清毒株的S1基因中有25%-50%的氨基酸差异。这些差异导致各毒株之间交叉免疫保护性弱，因此局限于某一特定亚型的IBV疫苗可能无法提供完全保护，而使用多种IBV亚型制备二联苗或多联苗因多种抗原出现自身抗原交叉反应干扰效果并不理想。随着对病原体抗原表位的深入研究，基于表位为基础的疫苗开始显示出良好的应用前景。根据抗原受体结合的细胞不同，分为T细胞表位和B细胞表位，T细胞表位主要通过在抗原提呈细胞（APC）中与MHC分子结合后提呈于细胞表面与TCR结合后激活T细胞免疫应答。MHC I类分子主要结合8-10个氨基酸的多肽，而MHC II类分子主要结合12-25个氨基酸多肽，B细胞表位在结构上与T细胞明显不同，主要以非连续的构像表位为主（90%以上），空间构像邻近但氨基酸并不连续且无MHC限制性，B细胞表位结合BCR激活B淋巴细胞分泌抗体发挥抗病毒作用。通过对潜在抗原表位进行筛选，选择具有保护性抗原表位，以此为基础构建的单价或多价疫苗，是提高疫苗免疫保护效果的一种确实方法。筛选出的功能表位疫苗不但能够避免抑制性表位诱导的免疫抑制作用，还可以使保护性表位诱导的免疫反应处于主导地位。 

目前IBV的表位研究中，主要报道了其B细胞抗原表位。有研究表明，大多数IBV的B细胞抗原表位位于S1蛋白的N端，不同毒株S蛋白的氨基酸差异也都集中在S1的3个区域上，分别是：N端第37-83氨基酸处，内含有两个亲水区；第117-160氨基酸处，为疏水区；第269-298氨基酸处，为强亲水区。推断这些区域都可能是S1蛋白上抗原表位，其次氨基酸第294-316位，第532-537位以及第566-548位对保护也可能有作用。与B细胞表位不同，鸡的T细胞表位受到严格的种属MHC限制，主要与鸡的B-F2单倍型结合基序关系紧密。目前对于IBV的T细胞表位研究还很少，对于开展IBV通用表位疫苗研究造成了很大影响，因此本发明重点对IBV S1蛋白的CD8+T细胞表位进行筛选。 

目前，已经报道了多种病毒抗原T细胞表位，比如流感病毒，乙肝病毒，登革热病毒，西尼罗河热病毒等。已经鉴定出了大量的T细胞表位，但是这些病毒抗原表位主要是针对人类的MHC分子。MHC基因在一条染色体上的组合称单倍型(haplotype)。鸡的MHC位于16号染色体上，由B和Y位点两个 基因区域组成，B区域包括3个基因群：B-F，B-L和B-G，其中B-F和B-L所编码的抗原在结构和功能上分别等同于哺乳动物MHC的Ⅰ类和Ⅱ类分子。B-F基因又分为B-F1和B-F2两类，鸡的B-F2基因主要负责提呈内源性抗原肽，提供给CD8+T细胞识别，诱导细胞免疫应答。MHC I分子单倍型相当于一个特定的型具有一个特定多肽氨基酸锚定位点，只有对应的型才能识别特定的多肽氨基酸序列。而这个多肽序列与特定的MHC I类分子单倍型结合后形成多肽-MHC I分子复合体提呈到细胞表面供T细胞受体（TCR）识别，识别后才能激活杀伤性T淋巴细胞，产生细胞杀伤作用，具备细胞免疫答应。 

发明内容

本发明的目的在于提供鸡IBV S1蛋白的CD8+T细胞抗原表位。 

本发明的另一目的在于提供筛选鸡IBV S1蛋白的CD8+T细胞抗原表位的方法。 

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

根据鸡B-F2*04（简写为BF04），B-F2*12（简写为BF12），B-F2*15（简写为BF15）和B-F2*19（简写为BF19）单倍型的MHC I类分子的结合基序对IBV M41株、Australia T株以及QX样ck/CH/TS/201012株的S1基因氨基酸进行比对，筛选出符合结合基序列的表位多肽。鸡MHC I类分子单倍型结合基序是根据Kaufman J【Kaufman J,Volk H,Wallny H J.A"minimal essential Mhc"and an"unrecognized Mhc":two extremes in selection for polymorphism.Immunological reviews.1995,143(63-88).】发表的已知文献进行预测的，是筛选表位多肽的基础。 

其中B-F2*04型主要包括x-(D或E)-x-x-(D或E)-x-x-E，主要锚定残基在第2、5、8位，且第2位和第5位为谷氨酸或者天冬氨酸，第8位为天冬氨酸，均为负电荷的酸性氨基酸；B-F2*12单倍型包括：x-x-x-x-(V或I)-x-x-V和x-x-x-x-(V或I)-x-x-x(V)，第5位锚定残基为丙氨酸或者异亮氨酸，第8位或9位为丙氨酸或者异亮氨酸，均为脂肪族类氨基酸；B-F2*15单倍型包括：(K或R)-R-x-x-x-x-x-Y和(K或R)-R-x-x-x-x-x-x-Y，主要锚定残基第1位为精氨酸和赖氨酸正电荷的碱性氨基酸，第2位为精氨酸，第8位或者第 9位为酪氨酸；B-F2*19型包括：x-R-x-x-x-x-x-(Y、P、L、F)和x-R-x-x-x-x-x-x-(Y、P、L、F)，主要锚定残基在第2位为带正电荷精氨酸，第8位或者第9位为疏水氨基酸（酪氨酸，脯氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸）。 

因此本发明提供的鸡IBV S1蛋白的CD8+T细胞抗原表位多肽，其氨基酸序列与鸡B-F2单倍型MHC I类分子的结合基序相符合。 

进一步，本发明的鸡IBV S1蛋白的CD8+T细胞抗原表位多肽，其氨基酸序列符合鸡B-F2*12单倍型MHC I类分子结合基序，其氨基酸序列为GAYAVVNV，或者， 

氨基酸序列符合鸡B-F2*19单倍型MHC I类分子结合基序，其氨基酸序列分别为SRIQTATQP、SRIQTATDP、SRNATGSQP。 

本发明还提供了编码上述4条多肽的基因序列。其中编码GAYAVVNV的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；编码SRIQTATQP的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；编码SRIQTATDP的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；编码SRNATGSQP的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。 

进一步地，含有上述基因的载体也属于本发明的保护范围。 

更近一步地，含有上述载体的宿主细胞属于本发明的保护范围。 

本发明提供了上述CD8+T细胞抗原表位多肽在制备IBV通用疫苗中的应用。本发明所述的IBV通用疫苗是针对多亚型IBV的疫苗，如M41、T以及QX亚型等。本领域技术人员根据本发明提供的上述4条抗原表位多肽，可将功能性的CD8+T细胞抗原表位进行串联并添加linker及蛋白酶切位点，形成表达盒，并对氨基酸序列还原成核甘酸序列，根据密码子偏嗜性在保证原有氨基酸相同的基础上进行还原核甘酸。表达盒通过分子克隆或者人工合成方法制备，插入合适载体构建成表位疫苗。本发明的上述四条CD8+T细胞表位仅包含了BF2*12和BF2*19两个单倍型，是由于不同病毒抗原所具有的氨基酸序列的差异导致的，这也是MHC单倍型具有多种单倍型的原因，不是局限在某个单倍型才能具有“通用”功能，而是每个单倍型都可以具有“通用”功能，只是针对不同的病毒抗原氨基酸序列不同。 

本发明提供一种表达盒，含有四条多肽，其氨基酸序列分别为GAYAVVNV、SRIQTATQP、SRIQTATDP、SRNATGSQP。 

在本发明的一个实施例中，提供一种表达盒，其采用柔性氨基酸linker将上述四条多肽串联，并添加酶切位点和增强子，具体序列为：酶切位点(AflII)+KOZAK序列+SRIQTATQP+AAA+SRNATGSQP+AAY+GAYAVVNV+GAAA+SRIQTATDP+KAAA+SRIQTATQP+AAA+SRNATGSQP+AAY+GAYAVVNV+GAAA+SRIQTATDP+酶切位点（Xho I） 

本发明提供了上述CD8+T细胞抗原表位多肽在制备IBV诊断试剂盒中的应用。 

本发明提供一种用于制备IBV通用疫苗的CD8+T细胞抗原表位多肽组合，共四条多肽，其氨基酸序列分别为GAYAVVNV、SRIQTATQP、SRIQTATDP、SRNATGSQP。 

进一步地，本发明提供了上述抗原表位多肽组合在制备IBV通用疫苗中的应用。 

本发明提供一种IBV通用疫苗，其含有氨基酸序列为GAYAVVNV、SRIQTATQP、SRIQTATDP和SRNATGSQP的多肽。 

本发明还提供一种筛选鸡IBV S1蛋白的CD8+T细胞抗原表位的方法，包括以下步骤： 

（1）根据鸡B-F2单倍型MHC I类分子的结合基序，在鸡IBV S1蛋白的氨基酸序列中筛选与鸡B-F2单倍型结合基序相符合的表位多肽； 

（2）构建多亚型的IBV S1蛋白真核表达质粒，并将该质粒免疫SPF鸡； 

（3）分别取不同真核质粒免疫后SPF鸡的脾淋巴细胞，采用ELIspot法测定步骤（1）中筛选的多肽诱导鸡脾淋巴细胞分泌IFN-γ的能力，利用ELIspot读板机获取斑点数据，能显著诱导鸡脾淋巴细胞分泌IFN-γ的多肽即为鸡IBV S1蛋白功能性CD8+T细胞抗原表位。 

本发明筛选方法中，步骤（2）所述的多亚型IBV S1蛋白真核表达质粒分别为pVAX-S1-M41、pVAX-S1-T、pVAX-S1-QX。 

其中pVAX-S1-M41的制备方法是，提取IBV M41株的基因组DNA,利用SEQ ID NO.5-6所示的引物进行PCR反应扩增S1基因，将扩增产物回收、纯化后连接pGEM-T easy载体，转化DH5α，提取质粒双酶切鉴定后测序，测序正确的质粒酶切回收后与相应酶切回收的载体pVAX-1连接，转化DH5α感受态细胞， 阳性重组质粒命名为pVAX-S1-M41。 

重组质粒pVAX-S1-T和pVAX-S1-QX的制备方法同pVAX-S1-M41的制备方法，不同的是其基因组DNA分别来自Australia T株和QX样IBV株ck/CH/TS/201012，且用于扩增S1基因的引物分别如SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10所示。 

本发明方法中，步骤（3）的ELIspot法是将鸡IFN-γ包被ELISPOT板，加入分离的脾淋巴细胞及步骤（1）的多肽培养24h后，顺次加入生物素标记的鸡IFN-γ检测抗体，链霉亲和素碱性磷酸酶（streptavidin alkaline phosphatase），然后加入BCIP/NBT显色液，显色后进行读数。 

具体地，本发明步骤（3）的ELIspot法是将包有PVDF膜的ELIspot板加入包被液稀释的包被抗体（Anti-Chicken IFN-γ，5μg/mL），100μL/孔，4℃包被过夜。洗液洗涤3次，每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h。将制备好的细胞按加入96孔板，100μL/孔。按照预先设计，将预测的多个单肽刺激物以5μg/mL加入各孔，并设立复孔及阴阳性对照：加入阳性刺激物PMA（5μg/mL）、ConA(10μg/mL)，阴性对照孔加入NC肽（5μg/mL）、未加肽的淋巴细胞，同时设立背景负对照（不含细胞的培养基）。将96孔板放置在CO₂培养箱，37℃培养36h后倾倒孔内细胞及培养基，每孔加入200μL洗液，加入检测抗体（Anti-Chicken IFN-γ生物素）和链霉亲和素碱性磷酸酶（2μg/mL），最后显色：每孔加入50μL BCIP/NBT显色液，室温避光作用15-30min，可出现特异性斑点，自来水终止显色，利用ELIspot读板机获取斑点数据并用生物统计分析各肽段刺激脾淋巴细胞产生IFN-γ斑点的差异。 

本发明通过上述方法筛选得到的四条鸡IBV S1蛋白的CD8+T细胞抗原表位多肽能够刺激淋巴细胞产生高水平IFN-γ的分泌，说明这些多肽具有激活鸡特异性CD8+T细胞的能力，能够产生细胞免疫应答，实验重复3次均获得相似结果，进一步确定其为潜在的鸡MHC I类分子限制性表位。本研究筛选针对多种IBV亚型通用的功能性T细胞表位有助于开展IBV通用疫苗的研究。通过对潜在抗原表位进行筛选，选择具有保护性抗原表位，以此为基础构建的单价或多价疫苗，是提高疫苗免疫保护效果的一种确实方法。筛选出的功能表位疫苗不但能够避免抑制性表位诱导的免疫抑制作用，还可以使保护性表位诱导的免疫 反应处于主导地位。 

附图说明

图1pVAX-S1体外表达的Western-bolt检测结果，第1泳道为pVAX空载体；第2泳道M41株pVAX-S1；第3泳道T株pVAX-S1；第4泳道QX株pVAX-S1以及第5泳道：S1蛋白阳性对照均出现75KDa特异性目的条带，说明构建的重组IBV S1蛋白在真核质粒中成功表达，免疫原性良好。 

图2重组质粒pVAX-S1的间接免疫荧光检测结果；A：pVAX-S1-M41株，B：pVAX-S1-T株和C：pVAX-S1-QX株均显示特异性绿色荧光，说明3种IBVS1基因重组DNA质粒均能在Hela细胞中表达重组蛋白，而未转染质粒Hela细胞未特异性绿色荧光（图2-D）。 

图3ELIspot检测预测表位多肽刺激免疫鸡淋巴细胞产生IFN-γ斑点生物统计结果；其中A图为针对pVAX-S1-T株免疫的鸡淋巴细胞实验，B图为针对pVAX-S1-M41株免疫的鸡淋巴细胞实验，C图为针对pVAX-S1-QX株免疫的鸡淋巴细胞实验；柱状图中的显示的多肽与表1中筛选的多肽顺序一致。***代表差异极显著。 

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所用鸡传染性支气管炎病毒均包括M41株，Australia T株，购自中国兽医药品监查所，QX样IBV株ck/CH/TS/201012为中国农业科学院上海兽医研究所禽传染病研究室保存。 

实施例1符合鸡B-F2单倍型MHC I类分子结合基序的表位多肽的筛选 

运用生物信息学软件DNAstar，下载并分析Genbank上已经发表的传染性支气管炎病毒全基因组序列，选择其主要的抗原保护蛋白S1进行分析，根据目前已知的鸡B-F2*04（简写为BF04），B-F2*12（简写为BF12），B-F2*15（简写为BF15）和B-F2*19（简写为BF19）单倍型的MHC I类分子的结合基序（为Kaufman J等发表的已知文献）对IBV M41株、Australia T株以及QX样 ck/CH/TS/201012株的S1基因氨基酸进行比对，筛选出符合结合基序列的表位多肽。但是此符合此基序的多肽实际中并不一定具有功能。 

已知的B-F2*04型主要包括x-(D或E)-x-x-(D或E)-x-x-E，主要锚定残基在第2、5、8位，且第2位和第5位为谷氨酸或者天冬氨酸，第8位为天冬氨酸，均为负电荷的酸性氨基酸；B-F2*12单倍型包括：x-x-x-x-(V或I)-x-x-V和x-x-x-x-(V或I)-x-x-x(V)，第5位锚定残基为丙氨酸或者异亮氨酸，第8位或9位为丙氨酸或者异亮氨酸，均为脂肪族类氨基酸；B-F2*15单倍型包括：(K或R)-R-x-x-x-x-x-Y和(K或R)-R-x-x-x-x-x-x-Y，主要锚定残基第1位为精氨酸和赖氨酸正电荷的碱性氨基酸，第2位为精氨酸，第8位或者第9位为酪氨酸；B-F2*19型包括：x-R-x-x-x-x-x-(Y、P、L、F)和x-R-x-x-x-x-x-x-(Y、P、L、F)，主要锚定残基在第2位为带正电荷精氨酸，第8位或者第9位为疏水氨基酸（酪氨酸，脯氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸）。鸡MHC I类分子单倍型结合基序是根据Kaufman J等发表的已知文献进行预测的，是筛选表位多肽的基础。筛选好的表位多肽见表1。对筛选好的IBV S1蛋白适合序列进行人工合成。 

表1筛选的符合鸡B-F2单倍型MHC I类分子结合基序的表位多肽 

实施例2鸡传染性支气管炎病毒S1基因的克隆、核酸疫苗的构建 

按下列步骤构建IBV S1蛋白真核表达质粒并验证其免疫原性： 

（1）多种亚型IBV S1基因的扩增 

根据GenBank发表的IBV M41株(DQ834384.1)、T株(AY775779.1)、QX样株（JQ088078.1）S1基因核苷酸序列分别设计合成引物如下表2。 

表2用于扩增S1基因的引物 

上述三对引物，分别进行PCR扩增。模板分别为鸡传染性支气管炎病毒M41株，Australia T株，QX样IBV株ck/CH/TS/201012的基因组DNA。 

PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸，30个循环后，72℃延伸2min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，将片段连入pGEM-T easy载体，4℃连接过夜，转化DH5α，挑取单个菌落进行质粒提取，双酶切鉴定正确后进行测序。测序正确的质粒酶切回收后与相应酶切回收的载体pVAX-1（购自Life Technologies公司）连接，转化DH5α感受态细胞，阳性重组质粒命名为pVAX-S1-M41、pVAX-S1-T、pVAX-S1-QX。 

（2）IBV S1真核重组质粒的体外瞬时表达及免疫原性鉴定 

将阳性质粒重新转化DH5α感受态细胞，用QIAGEN plasmid Maxi kits进行质粒大提，质粒纯度均在1.7-1.9（OD260/OD280）之间，浓度>1μg/μL。按 Lipofectin Reagents操作说明转染Hela细胞，转染48h后，收取细胞样品。实验设立对照组。 

Western blot检测：去除培养基，收集细胞沉淀，用细胞裂解液裂解细胞，加入1×上样缓冲液，沸水中煮沸10min，室温12000r/min离心5min，进行SDS-PAGE电泳，电泳后将凝胶取出，250mA恒流湿转90min。转印后将PVDF膜置于含5%脱脂乳的PBST中4℃封闭过夜，PBST漂洗3次，每次3-5min。加入兔抗阳性血清，4℃孵育过夜，PBST漂洗3次。加入辣根过氧化物酶标羊抗兔二抗（1：10000稀释），作用1h，以PBST漂洗3次，以ECL显色试剂盒显色，在X感光片下曝光，结果见图1。 

间接免疫荧光检测：取60mm Dish，将飞片放入其中。接种Hela细胞，生长至50％-70％时，取10μg重组质粒进行转染，48h后以丙酮固定细胞，加入兔抗阳性血清，37℃湿盒中作用1h，PBST洗涤3次，每次10min；加入FITC标记的羊抗兔二抗(含0.01%Evensblue)，37℃作用1h，PBST洗涤3次，每次10min；用甘油封片剂封片，于荧光显微镜下观察。结果见图2。 

结果说明重组质粒pVAX-S1-M41、pVAX-S1-T、pVAX-S1-QX具有良好免疫原性。将3个重组真核质粒用QIAGEN plasmid Maxi kits进行大量提取，免疫14日龄SPF鸡（购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司），35日龄加强免疫一次，二免后2周无菌分离脾淋巴细胞进行表位筛选。 

实施例3ELIspot法检测预测多肽刺激鸡脾淋巴细胞IFN-γ分泌情况 

免疫真核表达质粒相当于免疫DNA疫苗，DNA疫苗最主要的特点是能够产生较为强大的细胞免疫应答，也就是T淋巴细胞免疫应答，两次免疫后T细胞会有一部分分化为针对特定免疫抗原的记忆性T淋巴细胞产生，这部分细胞的特点是当受到相同抗原刺激时会大量分泌细胞因子（如IFN-γ）来激活幼稚型(naive)T淋巴细胞转化为杀伤性T淋巴细胞，有利用杀伤病毒抗原感染的细胞。因此，本发明分离免疫后的鸡脾淋巴细胞，用实施例1筛选的多肽分别作为病毒抗原肽刺激，如果脾淋巴细胞分泌了大量的细胞因子（如IFN-γ），说明该多肽为CD8+T细胞功能性表位。IFN-γ与CD8+T细胞具有最直接的正相关联系，通过IFN-γ分泌的多少可以直接判定CD8+T细胞 增殖情况。利用ELIspot方法检测IFN-γ分泌更经济，一次可以检测多个样本，读数更直观。本发明筛选方法选择通过IFN-γ分泌情况评价功能性CD8+T细胞抗原表位。 

将加强免疫两周后的SPF鸡安乐死，无菌取出脾脏，研磨至匀浆，经200目滤膜过滤，取过滤后的组织匀浆1mL，加于2mL细胞分离液（购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司）之液面上，1500r/min离心15分钟，吸取环状乳白色淋巴细胞置于离心管，洗涤2次，加入含有青霉素，链霉素和胎牛血清的1640培养基。 

用血球计数板进行细胞计数，细胞计数板-计数公式 

16格×25格的细胞计数板计算公式： 

细胞数/ml=100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数。计数后细胞数为2×108/ml，用1640完全培养基稀释到107/ml。 

将稀释到107/ml的脾淋巴细胞重悬备用。 

⑴包被：96孔板中加入包被液稀释的包被抗体（抗鸡IFN-γ，购自Life Technologies公司IFN-gamma Chicken Antibody Pair货号为CAC1233，5μg/mL），100μL/孔，4℃包被过夜。 

⑵封闭：Washing Buffer洗涤3次，在灭菌的吸水纸上沥干，每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h。 

⑶弃去封闭液，无需洗涤，把分离到的细胞按照5×10⁵/孔加入到96孔，100μL/孔。 

⑷按照预先设计，将21条单肽刺激物（见表1，委托上海吉尔生化公司人工合成）以5μg/mL加入各孔，设立阳性对照：加入阳性刺激物PMA（phorbol12-myristate13-acetate，巴豆醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯）（5μg/mL）、ConA(10μg/mL)，设立阴性对照：加入NC肽（阴性对照肽）（5μg/mL）、未加肽的淋巴细胞，同时设立背景负对照（不含细胞的培养基）。 

⑸培养：将96孔板放置在CO₂培养箱，37℃培养24h。培养过程中不要移动ELISPOT板，以免造成斑点模糊错乱。 

⑹裂解细胞：倾倒孔内细胞及培养基，200μL/孔冰冷去离子水，4℃ 冰浴10min。 

⑺洗涤：每孔加入200μL Washing Buffer，静置1分钟后，弃掉洗涤液，重复4次，最后一次在吸水纸上沥干。 

⑻加入检测抗体（抗IFN-γ偶联生物素标记）购自Life Technologies公司：每孔加入100μL检测抗体（1μg/mL），37℃孵育1h。 

⑼洗涤：重复步骤7。 

⑽加入链霉亲和素碱性磷酸酶（2μg/mL），每孔加入100μL，37℃孵育1h。 

⑾洗涤：重复步骤7。 

⑿显色：每孔加入50μL BCIP/NBT显色液（购自SIGMA公司），室温避光作用15-45min，待斑点生长到合适大小时，自来水冲洗PVDF膜正反两面，终止显色，室温晾干。 

⒀读数：将ELIspot板置于自动读板仪内，读取数据。 

利用ELIspot读板机获取斑点数据并用生物统计分析各肽段刺激脾淋巴细胞产生IFN-γ斑点的差异。图3的数据是将各肽刺激脾淋巴细胞后3次实验的斑点数进行生物统计分析后得到的，纵坐标代表了刺激后的斑点数，这个斑点数与多肽刺激淋巴细胞产生IFN-γ分泌具有直接对应关系，很清楚地将各条肽段对脾淋巴细胞刺激后产生IFN-γ斑点数呈现出来。结果显示表1中筛选的第9、10、16、17号多肽刺激淋巴细胞产生IFN-γ分泌显著增多。说明第9、10、16、17号多肽（氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-4所示，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11-14所示）为鸡IBV S1蛋白CD8+T细胞功能性抗原表位。 

实施例4鸡IBV S1蛋白CD8+T细胞功能性抗原表位在制备IBV通用疫苗中的应用 

利用实施例3获得的4条通用性鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白CD8+T细胞表位，不同表位多肽间加入“KAA”（核苷酸序列AAAGCTGCT），“AAY”（核苷酸序列GCCGCATAC），“GAAA”（核苷酸序列GGCGCAGCAGCC），“KAAA”(核苷酸序列AAAGCAGCCGCA)等linker以连接构建表达盒， 表达盒前后加入Afl II和Xho I酶切位点，表达盒前端酶切位点后加入KOZAK序列（核苷酸序列为GCCACCATG）以增强真核基因的翻译效率，通过密码子简并性将其还原成核苷酸序列，委托上海生工生物技术有限公司人工合成此表达盒序列，将其克隆至pVAX载体，构建IBV多表位通用的核酸疫苗。核酸疫苗中表达盒的具体序列设计如下： 

酶切位点(Afl II)+KOZAK序列+SRIQTATQP（10号多肽）+AAA+SRNATGSQP（17号多肽）+AAY+GAYAVVNV（9号多肽）+GAAA+SRIQTATDP（16号多肽）+KAAA+SRIQTATQP（10号多肽）+AAA+SRNATGSQP（17号多肽）+AAY+GAYAVVNV（9号多肽）+GAAA+SRIQTATDP（16号多肽）+酶切位点（Xho I） 

所得核酸疫苗对14日龄SPF鸡（购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司）首免，35日龄加强免疫一次，未出现明显不良反应或全身反应，产品具有较高的安全性，二免后分别用前文所述的M41株、Australia T株和QX样IBV株ck/CH/TS/201012分别对使用本发明通用疫苗二免后的SPF鸡进行攻毒试验，结果显示，本发明实施例4制备得到的IBV通用疫苗对三株病毒的免疫保护率均可达95%以上。 

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。