一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法

摘要

本发明涉及一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒（SrMV）的方法。通过提取甘蔗植株叶片总RNA、进行反转录反应（RT）获得模板、利用高粱花叶病毒不同株系外壳蛋白基因保守序列简并引物进行聚合酶链式反应（PCR)、利用限制性内切酶NsiI和BsmI对PCR产物进行双酶切反应，用4%的低熔点琼脂糖凝胶电泳检测限制性内切酶条带长度多态性（RFLP）来鉴定是否感染SrMV及其株系类型。该方法将快速与简便的检测甘蔗高粱花叶病毒分离物不同株系。本发明的分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，克服了生物学鉴定和常规RT-PCR等方法的缺点，提供了一种快速、特异、准确的SrMV不同病毒株系的检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物病毒的检测方法，具体涉及一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，属分子生物学领域。

背景技术

自1892年Musschenbroek在爪洼首次记述了甘蔗花叶病以来，目前在全世界种植甘蔗的国家普遍发生，并成为甘蔗重要病害之一。感病植株一般出现黄绿相间不规则的花纹、条斑或斑驳，长短、大小不一，布满整个叶片，尤以新叶基部症状最为明显。感病植株叶片黄化，植株矮化，分蘖减少，节间缩短，造成甘蔗产量及蔗茎含糖量降低。引起甘蔗花叶病的病原有3种，即马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属的甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus， SCMV）、高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）和马铃薯Y病毒科Poacevirus属的甘蔗条纹花叶病毒（Sugarcane stripe mosaic virus，SCSMV）。根据我们前期研究表明，SrMV是引起我国糖料甘蔗花叶病的主要病原。

甘蔗花叶病的诊断可以通过叶片的病害症状特征来识别，但症状表现与甘蔗品系、生长条件，温度和病毒株系有关，而且有些感病植株没有表现出花叶的症状。寄主范围和外壳蛋白的生化特性能很好的区别马铃薯Y病毒属甘蔗花叶病毒亚组不同株系，但是，各种生化和血清学技术很难区分SCMV和SrMV株系。宿主反应是可以用来区分不同病毒株系，但这种方法很耗费时间和劳力。最近，分子鉴定技术常用于研究侵染甘蔗的马铃薯Y病毒科的病毒分类。病毒外壳蛋白（CP）基因序列差异是马铃薯Y病毒科中病毒种的分类标准之一。根据SrMV的CP序列来鉴定侵染甘蔗的SrMV不同分离物国内外已有报道，但是，这种常规分子检测方法需要将PCR产物回收、转化到大肠杆菌DH5α，然后通过测序和序列分析，实验步骤较为繁琐、耗费时间较长。

发明内容

本发明的目的是提供一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，以克服常规分子检测中的不足之处。

本发明的目的是通过以下方法实现的。

本发明的一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，包括甘蔗叶片总RNA提取、简并引物设计、RT-PCR扩增、限制性内切酶反应、电泳检测；其特征在于：

（1）简并引物设计：扩增SrMV不同株系外壳蛋白基因保守序列的简并引物序列SrMV-CPF和SrMV-CPR如下：

SrMV-CPF：5'-ACADCAGADGCAACRGCACAAGC-3'

SrMV-CPR：5'-CTCRCCGACATTCCCATCYAAGCC-3'；

（2）RT-PCR扩增

应用宝生物工程（大连）有限公司反转录试剂盒进行RT反应，反转录反应体系总体积为10 μL，内含：2 μL 5×PrimeScript缓冲液，0.5 μL PrimeScript反转录酶混合液，0.5 μL Oligo dT 引物，2 μL Random 6 mers引物，2 μL 甘蔗叶片总RNA模板，无RNase水补足到10 μL；反转录反应条件为37℃ 15 min，85℃ 5 s灭活反转录酶；

随后，应用宝生物工程（大连）有限公司PCR试剂盒进行PCR扩增；PCR反应体系总体积为50 μL，内含5.0 μL 10×PCR 缓冲液，4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，10 μmol/L简并引物SrMV-CPF和SrMV-CPR各2.0 μL，0.25 U Taq DNA Polymerase，1.0 μL cDNA，灭菌超纯水补足到50 μL；所述10×PCR缓冲液组成成分为500 mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl  pH 8.3，15 mmol/L MgCl₂；PCR扩增程序如下：94 ℃预变性2 min、94 ℃变性1 min、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃再延伸10 min；

（3）限制性内切酶反应

应用Fermentas公司NsiI和BsmI限制性内切酶进行双酶切反应，酶切反应体系总体积为20 μL，内含2.0 μL 10×酶切缓冲液，4.0 μL 纯化后PCR产物，NsiI和BsmI限制性内切酶各1.5 μL， 灭菌超纯水补足到20 μL；酶切反应条件：37 ℃酶切12 小时；65 ℃处理20 min，终止酶切反应，降至常温；

（4）电泳检测：酶切反应结束后取5 μL反应液进行质量体积比为4.0 %的低熔点琼脂糖凝胶电泳，在0.5×电泳缓冲液环境中，80 V稳压电泳2 h，然后用凝胶成像系统观察并拍照，于电泳检测图中出现PCR产物酶切条带，表示该样品含SrMV；不出现PCR产物酶切条带，表示该样品不含SrMV。

在电泳检测图中，PCR产物酶切条带的位置不同，表示样品中所含SrMV的株系不同。在608 bp和241 bp位置同时出现PCR产物酶切条带，表示该样品中含有SrMV-G1株系；在849 bp位置出现PCR产物酶切条带，表示该样品中含有SrMV-G2株系；在582 bp和267 bp位置同时出现PCR产物酶切条带，表示该样品中含有SrMV-G3株系；在414 bp、168 bp、141 bp、126 bp位置同时出现PCR产物酶切条带，或者在414 bp、267 bp、168 bp位置同时出现PCR产物酶切条带，或者在438 bp、267 bp、168 bp位置同时出现PCR产物酶切条带，或者在438 bp、168 bp、139 bp、128 bp位置同时出现PCR产物酶切条带，表示这些样品中含有SrMV-G4株系；在606 bp、139 bp、128 bp位置同时出现PCR产物酶切条带，表示该样品中含有SrMV-G5株系；在438 bp和435 bp位置同时出现PCR产物酶切条带，表示该样品中含有SrMV-G6株系。如果在电泳检测图中未出现PCR产物酶切条带，表示该样品不含SrMV。经反复试验，对于不含SrMV但是含有其他甘蔗病毒的样品，使用本发明的检测方法，电泳检测图中也不出现PCR产物酶切条带。

本发明的优点如下：1、以甘蔗叶片总RNA为模板，根据SrMV不同株系外壳蛋白基因保守序列设计的特异性简并引物SrMV-CPF和SrMV-CPR，采用RT-PCR和RFLP相结合的方法，可以方便、快速的检测出待测甘蔗是否感染了高粱花叶病毒；2、通过限制性内酶将RT-PCR产物酶切，然后电泳检测限制性内切酶片段长度多态性（RFLP），就可以快速鉴定出不同的SrMV株系，这种鉴定方法省略了常规分子检测方法中PCR产物回收直至测序和序列分析的步骤，可以方便、特异、快速的检测侵染甘蔗的不同SrMV株系，较常规方法，大大缩短了RT-PCR的检测时间，并且降低检测成本。

附图说明

图1是侵染甘蔗的高粱花叶病毒不同株系的电泳检测图，其中，1为DL 1000 bp DNA标准相对分子质量，2~10为经检测含SrMV的样品，11为经检测不含SrMV的样品，12为灭菌超纯水，13为20 bp DNA标准相对分子质量。

具体实施方式

为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

实施例1  一种分子检测侵染甘蔗的高粱花叶病毒的方法，包括以下步骤：

1、甘蔗叶片总RNA提取

1)        从我国各省（区）的蔗区收集了104份田间甘蔗叶片样品，-80 ℃保存备用。

2)        称取0.1 g甘蔗叶片，并用液氮研磨成粉末。

3)        向1.5 mL 离心管中加入粉末，在液氮刚挥发完时立即加入1 mL                                               试剂，盖上管盖，震荡混匀，于 4 ℃、12000 g离心10 min。

4)        吸取上清液至另一新的离心管中，加入0.2 mL氯仿，盖住管盖，振荡混匀，室温静置3 min后，于4 ℃、12000 g离心15 min。

5)        吸取上清液至另一新的离心管中，加入0.5 mL预冷的异丙醇（-20℃），颠倒混匀，室温静置10 min后，于4 ℃、12000 g离心15 min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。

6)        倒出离心管中上清液，加入1 mL 体积比为75%的预冷乙醇（-20℃）洗涤，颠倒离心管2～3次，7500 g离心5 min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。重复洗涤沉淀1次。

7)        倒出离心管中上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀的一面，室温干燥10～15 min。

8)        加入50 μL 无RNas水，混匀，溶解管壁上的RNA，2 000 g离心5 s，冰上保存备用。提取的RNA应在2 h内进行RT-PCR 扩增；若需长期保存，应放置-80 ℃冰箱。

9)        在核酸蛋白分析仪上测定RNA的光吸收值，计算提取的RNA浓度。

2、简并引物设计

根据高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus）不同株系外壳蛋白基因保守序列，设计简并引物序列SrMV-CPF和SrMV-CPR，扩增的目的核酸带大小接近900 bp，简并引物序列如下：

SrMV-CPF：5'-ACADCAGADGCAACRGCACAAGC-3'

SrMV-CPR：5'-CTCRCCGACATTCCCATCYAAGCC-3'。

3、RT-PCR扩增

应用宝生物工程（大连）有限公司反转录试剂盒进行RT反应，在PCR管中加入以下试剂：

混匀，8000 rpm离心5 S后37 ℃预变性15 min、85 ℃变性5 S。

随后，以cDNA为模板和SrMV-CPF和SrMV-CPR为引物进行PCR扩增。在PCR管中加入以下试剂：

混匀，8000 rpm离心5 S后94 ℃预变性2 min、94 ℃变性1 min、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃再延伸10 min。

4、PCR产物纯化

1)        用50 μL 灭菌超纯水定容至100 μL后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）混匀。

2)        室温，13,500 rpm 5 min离心，取上清。

3)        加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1）混匀。

4)        室温，13,500 rpm 5 min离心，取上清。

5)        加入10 μL 3 mol/L醋酸钠，250 μL冷乙醇，-20 ℃放置30 min。

6)        4 ℃，13,500 rpm 15 min离心，弃上清。

7)        加入500 μL 70 %冷乙醇洗净，4 ℃，13,500 rpm 5 min离心，弃上清。

8)        沉淀干燥。

9)        加入100 μL灭菌超纯水溶解。

5、酶切反应

应用Fermentas公司NsiI和BsmI限制性内切酶进行双酶切反应，在PCR管中加入以下试剂：

混匀，8000 rpm离心5 S后37 ℃酶切12 小时，65 ℃处理20 min，终止酶切反应，降至常温。

6、电泳检测

取5 μL 酶切产物经质量体积比为4 %的低熔点琼脂糖凝胶在0.5×TBE和80 V电压下电泳2 h后，在0.5 μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15 min，用凝胶成像系统观察并拍照，于电泳检测图中出现PCR产物酶切条带，表示该样品含SrMV；不出现PCR产物酶切条带，表示该样品不含SrMV。

本实施例检测了从我国各省（区）蔗区收集的104个样品，从中选取有代表意义的电泳检测结果如图1所示，图1中2-10表示样品1-9经检测含SrMV。其中，样品1在608 bp和241 bp位置同时出现条带，表示样品1中含有SrMV-G1株系，其序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；样品2在849 bp位置出现条带，表示样品2中含有SrMV-G2株系，其序列为序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；样品3在582 bp和267 bp位置同时出现条带，表示样品3中含有SrMV-G3株系，其序列为序列表中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；样品4在414 bp、168 bp、141 bp、126 bp位置同时出现条带，表示样品4中含有SrMV-G4株系，其序列为序列表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；样品5在414 bp、267 bp、168 bp位置同时出现条带，表示样品5中含有SrMV-G4株系，其序列为序列表中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；样品6在438 bp、267 bp、168 bp位置同时出现条带，表示样品6中含有SrMV-G4株系，其序列为序列表中SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；样品7在438 bp、168 bp、139 bp、128 bp位置同时出现条带，表示样品7中含有SrMV-G4株系，其序列为序列表中SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；样品8在606 bp、139 bp、128 bp位置同时出现条带，表示样品8中含有SrMV-G5株系，其序列为序列表中SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；样品9在438 bp和435 bp位置同时出现条带，表示样品9中含有SrMV-G6株系，其序列为序列表中SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；图1中的11未出现PCR产物酶切条带，表示该样品不含SrMV。

本发明对样品1-9感染的SrMV 株系PCR产物进行测序。样品1取样自广西(GX-LC1362)、样品2取样自福建(FJ-GT53)、样品3取样自广东(GD-YT861)、样品4取样自广西(GX-YZ194)、样品5取样自海南(HN-YZ49)、样品6取样自云南(YN-FN21)、样品7取样自福建(FJ-CI20031)、样品8取样自广西(GX-YG35)、样品9取样自云南(YN-ROC221)，其序列分别为序列表中SEQ ID NO：3-11所示的核苷酸序列。将SEQ ID NO：3-11所示的核苷酸序列分别与美国SrMV-H（GenBank登录号U57358）、SrMV-I（GenBank登录号U57358）和SrMV-M（GenBank登录号U57360）的核苷酸序列进行比对，一致性为80.7%~81.5%、82.2%~83.2%、90.3%~90.7%、93.7%~95.3%、92.0%~92.6%、86.7%~87.2%，进一步验证了本发明检测结果的可靠性。

本发明采用的主要试剂如下：（所有化学试剂均为分析纯）

1、试剂购自美国Invitrogen公司。

2、上样缓冲液：0.1 %溴酚蓝，40 %蔗糖；

3、0.5×TBE缓冲液：44.5 mmol/L Tris，50 mmol/L HBO₃，1 mmol/L EDTA；

4、cDNA逆转录和PCR扩增试剂购自大连宝生物公司。

本发明所使用的仪器主要如下：

1、PCR扩增仪：德国Eppendorf 5331 PCR扩增仪；

2、电泳仪：北京六一仪器厂DYCZ-20A DNA序列分析电泳仪；

3、离心机：德国Eppendorf 5810/5810R多功能台式离心机；

4、凝胶成像系统：美国BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统；

5、分光光度计：美国GE NanoVue Plus超微量分光光度计。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

<110>  福建农林大学

 

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<170>  PatentIn version 3.5

 

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<213>  高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus）

 

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