一种幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法

摘要

本发明公开了一种幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法，其包括：1、以4周龄雌性C57BL/6小鼠为试验动物，用混合抗生素灌胃3～7天；所述的混合抗生素为庆大霉素、万古霉素和制霉菌素；2、将步骤1灌胃后的C57BL/6小鼠饲养6～8天；3、接种幽门螺杆菌：将步骤2得到的C57BL/6小鼠禁食，用幽门螺杆菌菌液灌胃，8～12小时后进食；所述的步骤3的接种频率为：隔日1次，共2～4次；4、将经步骤3，2～4次接种后的小鼠进行饲养。本发明的建模方法实验时间短、操作次数少、感染幽门螺杆菌数量级高、感染时间长久，模型能广泛应用于相关研究的幽门螺杆菌感染动物的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学和实验动物学领域，特别涉及一种幽门螺杆菌感染 动物模型的建立方法。

背景技术

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）被公认为是胃炎、消化性溃疡和 胃癌的主要致病因子，人是幽门螺杆菌感染的唯一易感宿主。在发达国家， 幽门螺杆菌感染率约为50%左右，而在发展中国家则达到60%以上。为此， 国内外研究者正在通过建立幽门螺杆菌感染的动物模型，研究幽门螺杆菌致 病机理、特异性防治以及一些药物或微生态制剂的疗效。

国内外关于幽门螺杆菌感染动物模型的报道中，以豚鼠、裸鼠作为实验 动物的，由于易死亡、自身的免疫缺陷等问题，使得建模成功率低于80%， 且模型应用受到一定局限；以小鼠CD1、Ba1b/c A以及Ba1b/c等品种作为 实验动物的，则感染率不高，且模型不稳定。其他以猴子、沙鼠、小猪等动 物为模型的，存在价格昂贵、数量少、饲养条件高、感染困难等限制因素。 同时，所有报道中的建模实验时间较长，连续灌胃且次数较多，大大增加了 建模时动物的死亡率和并发症的产生。因此，对于幽门螺杆菌机理、药物应 用等研究，一个稳定的、重现性好的动物模型进行临床前的动物实验是必要 的，找到一种普通的、易于饲养的动物，建立一个建模时间短、操作次数少、 感染幽门螺杆菌数量级高、建模致死率低的动物模型建立方法，为幽门螺杆 菌感染的彻底攻克奠定了基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，为了克服现有技术中建立幽门螺杆菌 感染的动物模型可控性差、不稳定，成功率不高，建模时间较长，操作复杂， 成本较高，一般实验室中难于建立等缺陷，而提供了一种幽门螺杆菌感染动 物模型的建立方法。本发明的建模方法实验时间短、操作次数少、感染幽门 螺杆菌数量级高、感染时间长久，模型能广泛应用于相关研究的幽门螺杆菌 感染动物的方法。

本发明通过下述技术方案解决上述技术问题：

本发明提供了一种幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法，其包括以下步 骤：

步骤1、以4周龄雌性C57BL/6小鼠为试验动物，用混合抗生素灌胃 3～7天；所述的混合抗生素为庆大霉素、万古霉素和制霉菌素；

步骤2、将步骤1灌胃后的C57BL/6小鼠饲养6～8天；

步骤3、接种幽门螺杆菌：将步骤2得到的C57BL/6小鼠禁食，用幽门 螺杆菌菌液灌胃，8～12小时后进食；

所述的步骤3的接种频率为：隔日1次，共2～4次；

步骤4、将经步骤3，2～4次接种后的小鼠进行饲养。

步骤1中，用混合抗生素灌胃可以有效降低小鼠胃部原有菌群对幽门螺 杆菌感染建立的影响。所述的灌胃的方法可参考本领域中常规的灌胃方法进 行。所述的用混合抗生素灌胃的天数优选7天。

步骤1中，所述的4周龄雌性C57BL/6小鼠可为本领域常规的4周龄雌 性C57BL/6小鼠，一般体重都在11g±1～2g。

步骤1中，所述的混合抗生素中，较佳地，庆大霉素0.058～0.062万单 位/只/天，万古霉素1.2～1.7mg/只/天，制霉菌素0.72～0.77万单位/只/天；更 佳地，庆大霉素0.062万单位/只/天，万古霉素1.7mg/只/天，制霉菌素0.77 万单位/只/天。

步骤2中，所述的饲养可为本领域中常规的饲养方法，一般在SPF级环 境中饲养。所述的SPF（specific-pathogen-free）级环境为：温度22±2℃，， 湿度56±5%，1周换2-3次垫料，控制12h光照，12h黑暗；饲料：常规饲 料；自由进食、进水。

步骤2中，所述的饲养的时间优选为7天。

步骤3中，所述的禁食的时间优选12～24h，更优选24h。

步骤3中，所述的幽门螺杆菌菌液为将幽门螺杆菌菌体悬于其液体培养 基中形成的菌液；所述的幽门螺杆菌菌液中，所述的液体培养基可为BHI （brain heart infusion）。

步骤3中，所述的幽门螺杆菌优选为幽门螺杆菌悉尼菌株SS1（H.pylori  Sydney strain SS1，Hp SS1）。

步骤3中，所述的幽门螺杆菌菌液中，其细菌密度优选大于1×10⁸cfu/ mL，更优选为1×10⁹cfu/mL。

步骤3中，所述的灌胃的方法可为本领域常规的灌胃方法。所述的灌胃 的次数优选3次。

步骤3中，所述的幽门螺杆菌菌液灌胃量优选0.18～0.22mL/只/次，更优 选0.2mL/只/次。

步骤3中，所述的接种频率优选为：隔日1次，共3次。

步骤4中，所述的饲养的方法可为本领域常规的饲养方法，一般在SPF 级环境中饲养。所述的SPF（specific-pathogen-free）级环境为：温度22±2℃，， 湿度56±5%，1周换2-3次垫料，控制12h光照，12h黑暗；饲料：常规饲 料；自由进食、进水。所述的饲养的时间优选为两周。

所述的幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法后，还可通过抽检确定步骤 来确定是否将幽门螺杆菌定殖于胃部。

所述的抽检确定步骤优选包括：将经过上述步骤1～步骤4处理的 C57BL/6小鼠禁食24h后处死，取幽门端，通过尿素酶实验、细菌培养和病 理切片验证幽门螺杆菌是否定殖于胃部。所述的抽检确定步骤可参考文献： “建立幽门螺杆菌感染BALB/c小鼠动物模型”，《使用临床医药杂志》，2013 年第17卷第1期，P27-P33。

本发明中，小鼠进食的饲料可为本领域中常规的饲养饲料。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本 发明各较佳实例。

本发明中除所述的幽门螺杆菌菌株外，所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明的建模方法实验时间短、操作次数 少、感染幽门螺杆菌数量级高、感染时间长久，模型能广泛应用于各项幽门 螺杆菌相关研究。

附图说明

图1为阴性对照小鼠胃组织切片。

图2为阳性对照小鼠胃组织切片。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中涉及的饲养均是在SPF级环境下进行饲养，具体条件为： 温度22±2℃，，湿度56±5%，1周换2-3次垫料，控制12h光照，12h黑暗； 饲料：常规饲料；自由进食、进水。

庆大霉素、万古霉素、制霉菌素：上海闪晶生物公司。

幽门螺杆菌悉尼菌株SS1（H.pylori Sydney strain SS1，Hp SS1）：仁济医 院惠赠。所述的幽门螺杆菌悉尼菌株SS1在以下文献中被报道：“幽门螺杆 菌（SS1）感染及其胃炎的小鼠模型”，《中国微生态杂志》，2003年6月第 15卷第3期。

BHI培养基：Oxoid公司。

实施例1:

4周龄雌性C57BL/6小鼠，48只，体重11g±1～2g，混合抗生素灌胃7 天（方案：庆大霉素0.062万单位/只/天，万古霉素1.7mg/只/天，制霉菌素 0.77万单位/只/天）→正常饲养一周→接种幽门螺杆菌：小鼠禁食24h后， 0.18mL/只/次的幽门螺杆菌菌液灌胃，细菌密度1×10⁹cfu/mL，8小时后进 食。隔日1次，共3次→饲养两周→抽检确定。建模抽检的接种成功率100%， 建模成活率96%。

实施例2：

4周龄雌性C57BL/6小鼠，48只，体重11g±1～2g，混合抗生素灌胃7 天（方案：庆大霉素0.058万单位/只/天，万古霉素1.2mg/只/天，制霉菌素 0.72万单位/只/天）→正常饲养6天→接种幽门螺杆菌：小鼠禁食24h后， 0.2mL/只/次的幽门螺杆菌菌液灌胃，细菌密度1×10⁹cfu/mL，8小时后进 食。隔日1次，共3次→饲养两周→抽检确定。建模抽检的接种成功率100%， 建模成活率100%。

实施例3：

4周龄雌性C57BL/6小鼠，48只，体重11g±1～2g，混合抗生素灌胃3 天（方案：庆大霉素0.062万单位/只/天，万古霉素1.5mg/只/天，制霉菌素 0.77万单位/只/天）→正常饲养6天→接种幽门螺杆菌：小鼠禁食24h后， 0.22mL/只/次的幽门螺杆菌菌液灌胃，细菌密度1×10⁹cfu/mL，12小时后 进食。隔日1次，共2次→饲养两周→抽检确定。建模抽检的接种成功率 100%，建模成活率100%。

实施例4：

4周龄雌性C57BL/6小鼠，48只，体重11g±1～2g，混合抗生素灌胃7 天（方案：庆大霉素0.062万单位/只/天，万古霉素1.7g/只/天，制霉菌素0.77 万单位/只/天）→正常饲养8天→接种幽门螺杆菌：小鼠禁食12h后，0.22mL/ 只/次的幽门螺杆菌菌液灌胃，细菌密度1×10⁸cfu/mL，12小时后进食。隔 日1次，共4次→饲养两周→抽检确定。建模抽检的接种成功率100%，建 模成活率94%。

效果实施例1

1、建模评估

1）尿素酶实验：取小鼠近幽门端1/3的胃，立即置于尿素酶快速检测卡 （珠海丽珠试剂有限公司）中，24h后观察。

结论：抽检小鼠尿素酶反应均为阳性。

2）细菌培养：将实施例1的小鼠胃组织幽门端的1/3与400μL BHI置 于无菌的玻璃匀浆器内匀浆数次，分别取匀浆液的10倍和100倍的无菌生 理盐水（浓度0.75%，氯化钠相对于溶液的质量百分数，经灭菌处理的生理 盐水）稀释液各100μL（样本I、样本II、样本III）涂板，培养后镜检菌落 并进行菌落计数，结果如表1所示。

表1建模抽检幽门螺杆菌菌落计数结果

3）病理学检查：甲醛固定的胃组织，石蜡包埋，切成6μm厚的组织切 片，做苏木素-伊红（HE）染色和Giemsa染色，出据病理检查报告。

通过HE和Giemsa染色观察可知，幽门螺杆菌主要定殖于胃小凹。图1 为阴性对照（HE染色，放大倍数，×400），未见炎症细胞浸润，胃小凹中 未见幽门螺杆菌；图2为阳性结果（Giemsa染色，放大倍数，×400），箭 头指向为胃小凹中的幽门螺杆菌，胃窦黏膜固有层见炎症细胞浸润。

报告显示，出现炎症的小鼠胃黏膜病理变化：胃黏膜炎症主要发生在胃 窦部。胃窦黏膜固有层（黏膜深层较明显）见少量单核细胞浸润，个别小鼠 胃黏膜见少量中性粒细胞浸润，部分表浅层少量淋巴细胞浸润。未见萎缩和 肠化。Giemsa染色可明显看到幽门螺杆菌菌体。

根据尿素酶试验、胃组织活菌计数的结果以及病理切片观察，抽检的 C57BL/6小鼠均成功地被幽门螺杆菌感染，幽门螺杆菌在被感染小鼠胃内的 定殖量为4～20×10⁴cfu/g胃组织，表明所采用的建模方法建立幽门螺杆菌动 物感染模型成功。

2、感染稳定性评估

上述实验确定建模成功后，每隔2周、4周、6周、8周……分别随机抽 取小鼠重复以上三步评估实验，结果显示，此感染模型可持续6～8个月，且 感染数量级不低于10⁴cfu/g胃组织。

对比例1：

4周龄雌性C57BL/6小鼠，48只，体重11g±1～2g，接种幽门螺杆菌： 小鼠禁食24h后，0.22mL/只/次的幽门螺杆菌菌液灌胃，细菌密度1×10⁹cfu /mL，24小时后进食。隔日1次，共3次→饲养两周→抽检确定。

建模评估：

1）尿素酶实验：抽检小鼠中尿素酶反应1只为弱阳性，其余均为阴性。

2）细菌培养：抽检10只小鼠，其中3只胃组织样本菌落数分别为60cfu/g 胃组织、35cfu/g胃组织、20cfu/g胃组织，其余均为0cfu/g胃组织。

结论：建模未成功。

对比例2：

4周龄雌性C57BL/6小鼠，48只，体重11g±1～2g，混合抗生素灌胃3 天（方案：庆大霉素0.062万单位/只/天，万古霉素1.5mg/只/天，制霉菌素 0.77万单位/只/天）→接种幽门螺杆菌：小鼠禁食24h后，0.22mL/只/次的幽 门螺杆菌菌液灌胃，细菌密度1×10⁹cfu/mL，12小时后进食。隔日1次， 共2次→饲养两周→抽检确定。

建模评估：

1）尿素酶实验：抽检小鼠尿素酶反应均为阴性。

2）细菌培养：抽检小鼠胃组织培养，均无幽门螺杆菌菌落生成。

结论：建模未成功。