一种异源精子诱导泥鳅雌核发育四倍体鱼苗的方法

摘要

本发明公开了一种异源精子诱导泥鳅雌核发育四倍体鱼苗的方法，通过亲本的选取、精子的遗传灭活、雌核发育四倍体鱼苗的诱导，冷休克处理的方法获得了雌核发育四倍体鱼苗。本方法获得雌核发育四倍体泥鳅的受精率、孵化率和成活率最高可达：76.99±2.51%、54.54±1.87%、17.9±0.65%；本发明具有先进、高效、实用、可靠的特点，在泥鳅育种上具有重大的应用价值和广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于异源精子诱导泥鳅雌核发育领域，具体涉及一种异源精子诱导泥鳅雌核发育 四倍体鱼苗的方法。

背景技术

雌核发育是鱼类单性生殖中的一种重要的生殖方式，即用遗传失活的精子去激活成熟的 卵子发育，精子进入卵后不进行雄核与卵核融合，只起到激活卵子开始发育的作用，然后诱 导雌核二倍化得到基因纯合型鱼。人工雌核发育在鱼类纯系的快速建立、性别决定和性别的 人为控制以及基因图谱的建立等方面都有十分重要的意义。一次人工诱导雌核发育的纯度约 相当于14个世代全同胞交配选育的结果，任何鱼类经过连续两次雌核发育就可以作为纯系 亲本用于育种生产（Chen等，2009）。因此，人工雌核发育成为鱼类遗传育种工程中的一个 热点。

泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）是我国常见的小型淡水鱼类，其肉质细嫩、味美， 营养丰富，且具有较高的药用价值，被誉为“水中人参”。近年来，泥鳅的市场需求量日益增 加，然而，由于多年的过度捕捞，加上天然水域生态环境日益恶化，我国野生泥鳅的资源量 正面临枯竭的危险。自上世纪90年代开始，泥鳅的繁育和养殖业在我国逐步得到发展，目 前，已成为我国重要的水产经济鱼类。泥鳅作为我国新兴起的一种小型经济鱼类，具有广阔 的发展前景。因此，泥鳅的遗传育种研究具有重要的经济意义。

已有的研究结果表明，泥鳅的染色体存在广泛的核型多态性，我国的野生泥鳅群体中不 仅存在二倍体；在长江流域，研究人员还发现有大量四倍体的存在。四倍体泥鳅的体型明显 大于二倍体，具有显著性的生长优势。四倍体泥鳅是我国特有的种质资源，为泥鳅的育种及 相关领域的研究提供了理想的原材料。然而，目前利用天然四倍体泥鳅进行的雌核发育研究 主要集中在日本，并且这些研究几乎都是采用紫外线灭活同源精子，然后激活卵子的方法来 展开的。尽管研究人员对雌核发育关键技术（精子染色体的遗传灭活以及卵子染色体的二倍 化）条件的摸索和方法的优化做了大量的工作，但是雌核发育技术还存在雌核发育鱼存活率 低的问题，并且对雌核发育鱼的鉴定比较复杂。

已有实验证明远缘激活源不仅能提高雌核发育鱼的成活率，还能极大简化雌核发育鱼的 鉴定问题。因为即使精子遗传物质不能被全部灭活，杂交的后代也不会成活，能存活的个体 也很容易与母本区别开。团头鲂（Megalobrama amblycephala）精子就是一种诱导鱼类雌核 发育较好的远缘激活源。利用团头鲂精子诱导天然四倍体泥鳅的卵子雌核发育，并进行染色 体操作的研究，目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种异源精子诱导泥鳅雌核发育四倍体鱼苗的诱导方法，方法 简单，易行，利用本发明的方法，其受精率，孵化率和存活率均有很大的提高。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种异源精子诱导泥鳅雌核发育四倍体鱼苗的诱导方法，其步骤如下：

A、亲本的选取与人工催产

选择体形正常、外表无伤、体质健壮、腹部膨大有弹性、卵巢轮廓明显的四倍体雌性泥 鳅。雄性团头鲂要求胸鳍珠星明显、有粗糙感、轻压腹部有白色精液从生殖孔流出。

B、精子的遗传灭活

采集团头鲂精子，镜检选取活力在90%以上的用于紫外线灭活，团头鲂精液1ml，用H ank’s溶液按照1:4体积比稀释，置于经预冷的干燥培养皿（直径75mm）中，精液厚度约为 0.1-0.2mm，然后置于2支15W紫外灯下处理。灯管与静液面距离10-12mm，灭活时间20- 25min，精子的活力水平下降到30%时，停止光照。处理过的精液置于4℃冰箱中，避光保 存备用。

C、团头鲂精子诱导泥鳅雌核发育

将稀释的精液200-600μL加入到含5-30ml四倍体泥鳅未受精卵的瓷盆中，混合均匀， 随后加入5-10ml7%（w/v）生理盐水，继续混匀后，加入50-200ml曝气水。

D、冷休克处理：

采用0-4℃冰水混合物在授精后2-10min进行冷休克处理，处理持续时间20-55min。

最佳的冷处理条件为：0-4℃冰水混合物在授精后7-8min进行冷休克处理，处理持续时 间30min。

F.孵化

受精卵经冷休克处理后，转移至23℃的水浴中复温。最后在曝气水中孵化。

所述的曝气水为水温23-25℃，溶氧6.0-7.0mg/L，pH值在7.8-8.2的自来水。

采用以下两种方法进行泥鳅雌核发育四倍体鱼苗的鉴定：

A、流失分析和染色体分析鉴定雌核发育四倍体鱼苗

选取15日龄鱼苗，经MS-222麻醉后，剪断分成两部分，一部分用95%乙醇保存，另 一部分在装300μl PBS的组织匀浆器中碾碎后，经200目尼龙网过滤，收集细胞悬液800r/ min离心6min，弃去上清液，用DAPI染液染色5min后上流式细胞仪检测，用已知二倍体 泥鳅作为参照，雌核发育子代DNA含量约为二倍体泥鳅的2倍。用常规染色体制片的方法， 对雌核发育四倍体子代进行染色体分析，发现雌核发育仔鱼染色体数目为100条，与普通四 倍体泥鳅的染色体数目相同，由此充分证明这些鱼苗为四倍体个体。

B、微卫星分析鉴定雌核发育四倍体鱼苗

粗盐法提取亲本和已检测倍性雌核发育鱼苗的总DNA，微量紫外分光光度计（NanoDr  op2000）检测DNA浓度和纯度，1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量。用已检测出 的多态性好、“父本”和母本特异性高的引物，来检测雌核发育鱼苗的遗传组成。通过聚合酶 链反应（PCR），所得产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后凝胶成像系统照相。结果显示， 雌核发育鱼苗中没有出现“父本”的基因型，子代的遗传物质来均自于母本。

与现有技术相比，本发明的优点为：

本发明建立的人工催产和雌核发育四倍体鱼苗的诱导技术，技术先进，操作方便，方法 高效、实用、可靠，利用本发明所述方法，最后四倍体雌核的受精率70-80%，孵化率30-6 0%，成活率7-12%。而且还极大简化雌核发育鱼的鉴定问题。采用远源激活源，即使精子 遗传物质不能全部被灭活，杂交的后代也不会成活，能存活也会很容易与母本相区别出来。 为泥鳅苗种生产和全雌四倍体苗种的研制提供了技术手段，在泥鳅规模化育苗、性别控制和 全雌四倍体鱼苗培育上具有重要的应用价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1为一种普通四倍体、杂交个体和未加倍处理的雌核发育个体形态特征示意图。

a.普通个体：四倍体泥鳅的精子稀释液与四倍体泥鳅的卵子进行授精;

b.杂交个体：未灭活的团头鲂精子稀释液与四倍体泥鳅的卵直接授精；

c.未加倍处理的雌核发育个体：灭活的团头鲂精子稀释液与四倍体泥鳅的卵授精，不进行冷 休克处理。

图2为一种不同冷休克处理持续时间处理后的受精率示意图。

采用0-4℃冰水混合物进行冷休克处理，起始时间为受精后7min,8个冷休克处理的持 续时间：20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min，处理结束后迅速 置于23±1℃的曝气水中复温，并继续孵化。

图3为一种利用流失细胞术检测雌核发育四倍体鱼苗的DNA相对含量示意图。

图4-1为一种泥鳅雌核发育鱼苗的形态学特征示意图。

图4-2为一种染色体计数法分析鉴定雌核发育四倍体鱼苗的染色体数目示意图。

图5为一种微卫星在雌核发育子代及其亲本中的扩增电泳结果示意图。

图5-1为微卫星引物EST110在雌核发育子代的扩增电泳结果；

图5-2为Mac589微卫星引物在雌核发育子代的扩增电泳结果；

图5-3为EST851微卫星引物在雌核发育子代的扩增电泳结果；

1为父本；2为母本；M.标准分子量，PUC18；3-18.为泥鳅雌核发育子代。

具体实施方式

实施例1：

一种异源精子诱导泥鳅雌核发育四倍体鱼苗的诱导方法，其步骤如下：

A、亲本的选取与人工催产

选择体形正常、外表无伤、体质健壮、腹部膨大有弹性、卵巢轮廓明显的四倍体雌性泥 鳅。雄性团头鲂要求胸鳍珠星明显、有粗糙感、轻压腹部有白色精液从生殖孔流出。

B、精子的遗传灭活

采集团头鲂精子，镜检选取活力在90%以上的用于紫外线灭活，取团头鲂精液1ml，用 Hank’s溶液按照1:4体积比稀释，置于经预冷的干燥培养皿（直径75mm）中，精液厚度约 为0.1或0.15或0.2mm，然后置于2支15W紫外灯下处理。灯管与静液面距离10或11或 12mm，灭活时间20-25min，灭活过程中持续轻摇培养皿使精液能够被均匀照射，每隔30s 取少量精液，用纯水激活，在显微镜下观察精子的活力，精子的活力水平下降到30%时,即 可停止照射。处理过的精液置于4℃冰箱中，避光保存备用。

所述的Hank’s溶液的配方为：KCl0.40g,NaCl8.00g,NaHCO₃0.35g,KH₂PO₄0.06g, Na₂HPO₄·7H₂O0.09g,Na₂HPO₄·12H₂O0.10g,MgSO₄·7H₂O0.10g,MgCl₂·6H₂O0.10g, CaCl₂0.14g和葡糖糖(Glucose)1.00g,ddH₂O至l000ml。

C、团头鲂精子诱导泥鳅雌核发育

将稀释的精液200或400或600μL加入到5或17或30ml四倍体泥鳅未受精卵的瓷盆 中，然后轻摇瓷盆使精卵混合均匀，随后加入5或7.5或10ml7%生理盐水，继续混匀后， 加入50或100或200ml曝气水。

D、冷休克处理：

采用0-4℃冰水混合物在授精后2或4或6或8或10min进行冷休克处理，处理持续时 间20或30或40或55min。

F.孵化

受精卵经冷休克处理后，转移至23℃的水浴中复温。最后在曝气水中孵化。

所述的曝气水为水温23-25℃，溶氧6.0-7.0mg/L，pH值在8.0左右的自来水。

获得的存活鱼苗，经鉴定后全为四倍体鱼苗，受精率70-80%，孵化率30-60%，成活率 7-12%。

最佳冷处理条件为：0-4℃冰水混合物在授精后7-8min进行冷休克处理，处理持续时间 30min。

实施例2：

一种异源精子诱导泥鳅雌核发育四倍体鱼苗的诱导方法，其步骤如下：

A、亲本的选取与人工催产

选择体形正常、外表无伤、体质健壮、腹部膨大有弹性、卵巢轮廓明显的四倍体雌性泥 鳅。雄性团头鲂要求胸鳍珠星明显、有粗糙感、轻压腹部有白色精液从生殖孔流出。

B、精子的遗传灭活

采集团头鲂精子，镜检选取活力在90%以上的用于紫外线灭活，取上述处理过的团头 鲂精液1ml，用Hank’s溶液按照1:4体积比稀释，置于经预冷的干燥培养皿（直径75mm） 中，精液厚度约为0.15mm，然后置于2支15W紫外灯下处理。灯管与静液面距离12mm， 灭活时间25min，灭活过程中持续轻摇培养皿使精液能够被均匀照射，每隔30s取少量精液， 用纯水激活，在显微镜下观察精子的活力，精子的活力水平下降到30%时，即可停止光照。 处理过的精液置于4℃冰箱中，避光保存备用。

C、团头鲂精子诱导泥鳅雌核发育

将稀释的精液400μL加入到含20ml四倍体泥鳅未受精卵的瓷盆中，然后轻摇瓷盆使 精卵混合均匀，随后加入20ml7%（w/v）生理盐水，继续混匀后，加入200ml曝气水。

D、冷休克处理：

采用0-4℃冰水混合物在授精后7min进行冷休克处理，处理持续时间20-55min。

F.孵化

受精卵经冷休克处理后，转移至23℃的水浴中复温。最后在曝气水中孵化。

所述的曝气水水温23-25℃，溶氧6.0-7.0mg/L，pH值在7.8-8.2的自来水。

表1为在起始处理时间为7min，不同冷休克时间下的处理效果。

第一行为对照组：直接将四倍体泥鳅的精子稀释液与四倍体泥鳅的卵子进行授精。

表1不同冷休克时间下的处理效果

起始时间/min 冷休克时间/min 受精率 孵化率 成活率

    82.95±1.5 79.8±1.6 76.4±1.76 7 20 75.58±1.07 53.07±0.86 9.58±0.5 7 25 75.77±1.85 57.06±1.48 13.08±0.2 7 30 76.99±2.51 54.54±1.87 17.9±0.65 7 35 79.21±0.62 48.61±0.6 11.01±1.37 7 40 77.13±0.14 48.8±0.46 11.8±0.75 7 45 76.65±0.79 48.5±4.28 9.6±0.26 7 50 73.49±0.5 34.6±0.33 8.7±0.07 7 55 74.13±1.8 30.94±0.61 7.39±0.19

实施例2：

对照组实验，其步骤如下：

将收集的四倍体泥鳅的卵均匀混合，平均分成三组，

第一组将四倍体泥鳅的精子稀释液与四倍体泥鳅的卵子进行授精。

第一组未灭活的团头鲂精子稀释液与四倍体泥鳅的卵直接授精；

第二组灭活的团头鲂精子稀释液与四倍体泥鳅的卵授精，不进行冷休克处理；

具体授精过程如下：将用Hank’s溶液按照1:4体积比稀释的精液400μL加入到含20ml 四倍体泥鳅未受精卵的瓷盆中，然后轻摇瓷盆使精卵混合均匀，随后加入20ml7%生理盐 水，继续混匀后，加入200ml曝气水，完成授精过程。受精卵置于曝气水中进行孵化。

所述的曝气水为水温23-25℃，溶氧6.0-7.0mg/L，pH值在7.8-8.2的自来水。

结果如图1所示，第一组的胚胎正常发育（图1中a），第二，三组的胚胎发育畸形（图 1中b，c）

所述的曝气水水温23-25℃，溶氧6.0-7.0mg/L，pH值在7.8-8.2的自来水。

实施例3：

一种泥鳅雌核发育四倍体鱼苗的鉴定方法，步骤如下：

采用以下两种方法之一来鉴定四倍体鱼苗。

A、流式细胞术和染色体计数法分析鉴定雌核发育四倍体鱼苗；

受精卵均经过卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、卵黄栓胚期、克氏囊胚期、尾牙 胚期和心跳期等阶段后孵化出膜，取15日龄鱼苗，经MS-222麻醉，每个个体取部分组织 切块，剩余部分保存于95%无水乙醇中，备用。将这些部分组织切块分别在装有300μlPBS 的组织匀浆器中碾碎后，经200目尼龙网过滤，收集细胞悬液，800r/min离心6min，弃上 清液，用DAPI染液染色5min后上机检测，流式细胞仪分析结果显示雌核发育鱼苗的DNA 含量为普通二倍体的2倍。采用常规染色体标本的制备方法，对雌核发育四倍体子代进行染 色体分析。染色体标本制备的步骤为：将鱼苗置于0.02%的秋水仙素中，在室温下处理2h， 然后把鱼苗用组织匀浆器碾磨，加入300μl淡水鱼用生理盐水（PSF：NaCl7.5g,KCl0. 2g,CaCl₂0.2g,NaCO₃0.02g）,将悬浊液用200目尼龙网过滤，收集细胞悬液，1000r/mi n离心8min，弃去上清液。然后把细胞悬液在0.075mol/L的KCl中低渗处理30min。用新 配制的卡诺氏液（甲醇：冰醋酸=3:1）连续固定3次，每次固定20min，1000r/min离心8 min，弃去上清液；采用热滴片法滴片，10%吉姆萨染液染色15min，然后在显微镜油镜下 进行镜检。结果发现雌核发育仔鱼染色体数目为100条，与普通四倍体泥鳅的染色体数目相 同（图3和图4）。

B、微卫星分析鉴定雌核发育四倍体鱼苗

因为微卫星标记具有较高的多态性以及共显性遗传的特性，能够快速准确检测出种群及 个体间的异质性，可以用于检测雌核发育后代与母本的遗传同质性及其与“父本”的遗传特性。 因此，我们利用微卫星标记来鉴定雌核发育鱼苗。

a.高盐法提取基因组DNA

采取高盐法提取已检测倍性水平的雌核发育四倍体鱼苗和亲本的基因组DNA。具体步 骤如下：在2mL离心管中加入600μL的细胞裂解液，然后将已固定的雌核发育鱼苗或亲本 鳍条分别用滤纸上吸干后放入其中，然后剪碎；每一管中加入8μL20mg/mL的蛋白酶K， 摇匀后，65℃水浴1.5h；冰上冷却10min，然后每一管加入200μL的7.5M的醋酸铵，摇 匀后冰上静置10min；4℃，12000rpm离心10min，并取上清液到另一干净1.5mL离心 管中，加等体积异丙醇，轻摇，冰上放置2mi；4℃，12000rpm离心10min，弃上清液，再 加入1mL70%乙醇，充分洗涤DNA；4℃，12000rpm离心5min，弃上清，再加入1mL100% 乙醇，充分洗涤DNA；4℃，12000rpm离心5min，弃乙醇，在室温下晾干后加入20μL灭 菌的ddH₂O；用微量紫外分光光度计（NanoDrop2000）检测DNA浓度和纯度，根据得到的 浓度将DNA稀释为100μM的工作液，1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA的质量。

b.聚合酶链反应（PCR）及凝胶成像

用已检测出的多态性好、“父本”和母本特异性高的引物（EST110:F-GCCTGACAGTCT  TCTGC,R-GCTATCCGATTATCATTTAC;Mac589:F-TCTACTTTCATCAGCGTTGT,R- GAATTGCAAGAAGCACAGTC;EST851:F-ATTGGTCCAGTCTGTTGT,R-TGTATCTT  GCACGCTCTA），来检测雌核发育鱼苗的遗传组成。PCR反应体系为：1×Taq buffer2.0μl， 模板DNA1.0μl，25mmol/LMgCl21.6μL，10mmol/L dNTPs0.14μL，10mmol/L正反向 引物各0.2μL，5U/μL Taq酶0.1Μl，ddH₂O14.76μL。PCR反应程序为：94℃5min； 94℃30s,50-60℃30s,72℃45s,30个循环；72℃5min，4℃保存。所得PCR产物经 8%聚丙烯酰胺凝胶(29%Acrylamide+1%Methylenebisacrylamide7mL，5×TBE7mL，10% NH₄S₂325μL，TEMED32.5μL和ddH₂020.5mL)电泳，银染后凝胶成像系统照相。结果如 图5所示，从图5-1中可清晰看出团头鲂特异性条带没有在子代中出现，说明改位点父本 的基因并没有进入了子代，从5-2中看出雌核发育鱼苗遗传物质来自于母本，而5-3中可以 看出雌核发育鱼苗与母本的同质性，从而判断该子代为雌核发育个体。