基于SNP基因分型技术的金银花药材真伪鉴别方法

摘要

本发明是利用SNP分型技术鉴别中药材金银花真伪的办法。通过利用单核苷酸位点变异设计的鉴别引物，通过聚合酶链式反应(PCR)技术鉴别金银花及其常见伪品红腺忍冬、灰毡毛忍冬、华南忍冬、黄褐毛忍冬、水忍冬等。通过DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测三步即可完成对金银花的真伪鉴别。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用SNP基因分型技术鉴别中药材金银花(Lonicera japonicaThunb.) 真伪的技术。

背景技术

经过市场调研及有关专家确认可作为中药材金银花的伪品有灰毡毛忍冬(Lonicera  macranthoides Hand.-Mazz.)、水忍冬(Lonicera dasystyla Rehd.)、红腺忍冬(Lonicera  hypoglauca Miq.)、华南忍冬(Lonicera Confusa DC.)或黄褐毛忍冬(Lonicera  fulvotomentosa HsuetS.C.Cheng)等(郝近大《实用中药材经验鉴别》，中华人民共和国药 典(1977版-2000版))，目前现有的技术中，中华人民共和国药典(2010版)主要采用以下 几种鉴别方法。1.性状鉴别：本品呈棒状，上粗下细，略弯曲，长2～3cm，上部直径约3mm， 下部直径约1.5mm。表面黄白色或绿白色(贮久色渐深)，密被短柔毛。偶见叶状苞片。花萼 绿色，先端5裂，裂片有毛，长约2mm。开放者花冠筒状，先端二唇形；雄蕊5，附于筒壁， 黄色；雌蕊1，子房无毛。气清香，味淡、微苦。2.薄层鉴别：取本品粉末0.2g，加甲醇5 ml，放置12小时，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml 含1mg的溶液，作为对照品溶液。照《薄层色谱法检验标准操作程序》(附录VIB)试验，吸 取供试品溶液10～20μl、对照品溶液10μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸丁酯 一甲酸一水(7∶2.5∶2.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下 检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。然而金银花 和灰毡毛忍冬、华南忍冬、红腺忍冬、黄褐毛忍冬外形特征非常相似，性状鉴别具有一定的 主观性，要求鉴别者具有丰富的鉴别经验，如果外形不完整或者破碎后就很难鉴别。对于薄 层鉴别，灰毡毛忍冬、华南忍冬、红腺忍冬、黄褐毛忍冬均含有绿原酸，薄层鉴别无法把金 银花和灰毡毛忍冬、华南忍冬、红腺忍冬、黄褐毛忍冬区分开来。

发明内容

本发明的任务是设计了一对用于鉴别中药材金银花的高度特异性引物Lj-F和Lj-R，建立 了简单准确易于操作的鉴别中药材金银花真伪的SNP基因分型方法。

本发明首先通过序列比对，发现金银花和灰毡毛忍冬、华南忍冬、红腺忍冬、黄褐毛忍 冬、水忍冬之间具有单核苷酸位点的差异性，利用单核苷酸序列设计了能鉴别金银花正品的 高度特异性鉴别引物Lj-F即5’-GTTGACTGTCCTGTGTTGGT-3’和Lj-R即5’- GGATGAGAAATATAACGAATTTAG-3’。其方法是：模板DNA的提取：选取无霉变的干燥药材标本 0.1g，置于粉碎机中研磨粉碎，过40目筛。将粉末转移到2.0mL的微量离心管中，加入 900μL已灭菌的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液)2％CTAB，100mmol/L Tris-Hcl pH ＝8.0，20mmol/L EDTA，1.4mol/L Nacl)、0.02g PVP 40000、10μL β-巯基乙醇充分振 荡混匀，65℃水浴1.5h-2h，期间轻摇2-3次。结束后取出冷却至室温，加入900μL氯仿 -异戊醇(24∶1)，充分振荡混匀，12000×g离心10min。取上清，加入等体积氯仿-异戊 醇(24∶1)，充分振荡混匀，12000×g离心10min。取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇 溶液，-20℃放置0.5h以上。取出，12000×g离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗 涤两次，37℃挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，-20℃保存。PCR扩增：PCR反应体系25μL含 2.5μL 10×Ex taq缓冲液、2μL 0.25mmol/L dNTPs，两种高度特异性鉴别引物Lj-F即5’ -GTTGACTGTCCTGTGTTGGT-3’和l Lj-R即5’-GGATGAGAAATATAACGAATTTAG-3’，各0.25 pmol，0.8U Ex taq DNA聚合酶，约30ng DNA模板。反应在ABI公司的9700型基因扩增 仪上进行扩增，循环参数为94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸 45s，32个循环；72℃延伸7min；反应结束后4℃保存。电泳检测：PCR反应设置无模板 DNA的阴性对照，反应结束后取4μL反应液，与2μL 6×上样缓冲液充分混匀，于1.5％ 的EB染色的琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像观察，在480-490bp范围内扩出明亮唯一条带 的为正品金银花，混淆品均无任何条带扩出。

附图说明

图1：为金银花和混淆品trnL-trnF片段扩增(阳性对照)

样品编号：M：DL2000DNA marker由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、 100bp

1金银花；2红腺忍冬；3灰毡毛忍冬；4；华南忍冬；5黄褐毛忍冬；6水忍冬；

7金银忍冬；8郁香忍冬；9红花鞑坦忍冬；10繁果忍冬；11繁果忍冬；12阴 性对照

图2：为金银花特异性PCR鉴别

样品编号：M：DL2000DNA marker由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、 100bp

1金银花；2红腺忍冬；3灰毡毛忍冬；4；华南忍冬；5黄褐毛忍冬；6水忍冬；

7金银忍冬；8郁香忍冬；9红花鞑坦忍冬；10繁果忍冬；11阴性对照

具体实施方案：

下面结合附图和具体实施方案对本发明做进一步的详细说明：

1.材料和方法

1.1材料

实验中所用材料如表1所示，包括：

表1  10个金银花类材料产地及个数

1.2实验仪器

台式高速离心机(Eppendorf公司)、9700基因扩增仪(ABI公司)、电泳仪、紫外凝胶成像 仪。

1.3方法

模板DNA的提取：选取无霉变的干燥药材标本0.1g，置于粉碎机中研磨粉碎，过40目筛。 将粉末转移到2.0mL的微量离心管中，加入900μL已灭菌的CTAB提取液(2％CTAB，100 mmol/L Tris-Hcl pH＝8.0，20mmol/L EDTA，1.4mol/L Nacl)、0.02g PVP 40000、10μL β- 巯基乙醇充分振荡混匀，65℃水浴1.5h-2h，期间轻摇2-3次。结束后取出冷却至室温，加 入900μL氯仿-异戊醇(24∶1)，充分振荡混匀，12000×g离心10min。取上清，加入等体 积氯仿-异戊醇(24∶1)，充分振荡混匀，12000×g离心10min。取上清，加入2/3体积预 冷的异丙醇溶液，-20℃放置0.5h以上。取出，12000×g离心10min，弃上清，沉淀用70％ 乙醇洗涤两次，37℃挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，-20℃保存。

PCR扩增：PCR反应体系25μL含2.5μL 10×Ex taq缓冲液、2μL 0.25mmol/L dNTPs，两 种高度特异性鉴别引物(Lj-F和Lj-R)各0.25pmol，0.8U Ex taq DNA聚合酶，约30ng DNA 模板。反应在ABI公司的9700型基因扩增仪上进行扩增，循环参数为94℃预变性5min；94℃ 变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，32个循环；72℃延伸7min；反应结束后4℃保存。 PCR反应设置无模板DNA的阴性对照，反映结束后取4μL反应液，与2μL 6×上样缓冲液 充分混匀，于1.5％的EB染色的琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像观察。

2.结果

在约490bp处扩增出唯一明亮条带的样品即正品金银花。混淆品均应无任何条带出现。 用trnL-trnF通用引物进行扩增的阳性对照，均应在约1050bp出出现唯一明亮条带。