一种优化重组人睫状神经营养因子的核苷酸序列及在大肠杆菌中高效可溶性表达方法

摘要

本发明公开了一种优化重组人睫状神经营养因子的核苷酸序列及在大肠杆菌中高效可溶性表达方法，更具体的，通过优化重组人睫状神经营养因子核苷酸序列，构建pCold/hCNTF表达载体，在大肠杆菌中用IPTG低温诱导外源蛋白表达，外源蛋白表达量达到菌体总蛋白的50%以上，可溶性表达量达到总表达量的90%以上。本发明可用于重组人睫状神经营养因子的制备。

说明书

技术领域

本发明涉及一种优化重组人睫状神经营养因子的核苷酸序列及在大肠杆菌中的高效可用性表达方法，属于基因工程技术领域。 

背景技术

睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)是1976年Helfand发现，1984年由Barbin从小鸡眼的抽取物中分离出一种相对分子质量约为22kD左右的酸性蛋白质，它能促进鸡胚睫状神经节神经元存活并因此而得名，是神经肽类物质，属于非靶源性的神经营养因子。人CNTF基因位于人第11对染色体11q12上,属于包括白血病抑制因子、白细胞介素-l5、白细胞介素-11和制瘤素M在内的细胞因子家族，都是由4个α-螺旋组成的束状空间结构。CNTF作为神经营养因子中的重要成员，广泛分布于中枢神经系统。 

CNTF的生物学功能主要是特异性促进中枢和外周神经细胞分化、生长和存活，在神经系统发育、正常生理功能维持及神经损伤恢复中起重要的作用。目前已有研究表明CNTF具有多种功能，在神经系统、肌肉系统、肥胖症及其相关疾病的治疗中具有重要作用，有广阔的临床开发前景。但是由于CNTF天然来源少，不易大量获得，因此用重组基因技术获得高产量高纯度高活性的CNTF具有巨大的市场前景。 

大肠杆菌系统被广泛应用于重组外源蛋白的制备，其具有生长速度快、发酵条件容易控制、外源蛋白表达量较高等优点，但在大肠杆菌中所表达的外源蛋白容易形成包涵体，纯化需要复性容易使外源蛋白降低甚至丧失生物活性。目前，重组人睫状神经营养因子在大肠杆菌中的表达及制备国内外均有相关报道，但大多为包涵体表达，其缺点为（1）表达量低，重组外源蛋白占菌体总蛋白的50%以下，可溶性表达量占总表达量的60%以下；（2）纯化困难，包涵体需要变性复性，纯化步骤多且复杂；（3）活性低，由于大多为包涵体表达，其蛋白未正确折叠，活性较低。外源蛋白是否能在大肠杆菌中高效可溶性表达与其本身结构特征、表达载体及宿主菌有关，同时与诱导表达的条件也相关。 

因此本领域迫切需要提供一种能够在大肠杆菌系统高效可溶性表达重组人睫状神经营养因子的方法。 

发明内容

本发明提供一种优化重组人睫状神经营养因子的核苷酸序列及在大肠杆菌中的高效可用性表达方法，核苷酸序列克服现有技术中存在的重组人睫状神经营养因子表达量低及以包涵体形式表达的缺陷；在大肠杆菌中高效可溶性表达，克服现有技术中存在的重组人睫状神经营养因子表达量低及以包涵体形式表达的缺陷。 

本发明是通过以下的技术方案实现的： 

在不改变氨基酸编码序列的情况下按照大肠杆菌偏好密码子进行核苷酸序列优化同时突变ACA密码子，其次，通过选择低温表达系 统，利用在低温条件下，外源蛋白缓慢表达可增进蛋白的正确折叠，提高可溶性与稳定性的优点，使重组人睫状神经营养因子在大肠杆菌中总表达量及可溶性表达量同时增加。 

首先，提供一种编码重组人睫状神经营养因子的核苷酸序列SEQ ID NO:2，所述核苷酸序列为在不改变氨基酸编码序列的情况下按照大肠杆菌偏好密码子进行核苷酸序列优化同时突变ACA密码子，与天然人睫状神经营养因子的核苷酸序列SEQ ID NO:1，具有90%以上同一性的核苷酸序列。 

第二，提供了一种重组表达载体pCold/hCNTF的构建方法，将基因合成的hCNTF DNA与pCold载体（购自Takara公司）分别用Nde I和Xba I酶切后，使用T4连接酶进行连接得到一种重组表达载体即pCold/hCNTF。 

第三，提供了一种高效表达可溶性重组人睫状神经营养因子工程菌的构建方法，将重组表达载体pCold/hCNTF转化宿主菌感受态细胞，通过筛选获得高表达工程菌。 

优选的，该表达菌株为大肠杆菌。 

更优选的，为大肠杆菌BL21（DE3）。 

在另一优选例中，所述的表达载体是pCold/hCNTF。 

第四，提供了一种高效表达可溶性重组人睫状神经营养因子的表达方法，该方法通过培养上述表达菌株实现，诱导剂为1.0mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导温度为15℃，诱导时间为6小时。 

在另一优选例中，所述的工程菌为大肠杆菌BL21（DE3）。 

采用本发明提供的优化的人睫状神经营养因子的核苷酸序列及表达方法，外源蛋白的表达量占菌体蛋白表达量的50%以上，在总表达量提高的同时，可溶性表达量占总表达量的65％以上，优选70%以上，还优选75%以上，又优选80%以上，更优选85%以上，最优选90%以上。 

因而，本发明提供的优化的人睫状神经营养因子的核苷酸序列及表达方法，有效的解决了现有技术中存在的重组人睫状神经营养因子表达量低及以包涵体形式表达的技术缺陷，有利于重组人睫状神经营养因子的纯化。另外，本发明的方法也可用于其他神经营养因子的高效可溶性表达。 

本发明的优点在于： 

1．核苷酸序列优化后的hCNTF非常适合在大肠杆菌中表达，具有高表达、高可溶性、高稳定的特点。 

2．采用低温表达系统诱导表达的CNTF具有天然的折叠结构，可溶性高，活性强，成本低廉。 

附图说明

图1：重组表达质粒（pCold/hCNTF）的酶切鉴定图。M：DNA分子量标准（DL2000），1：pCold空载体，2：pCold/hCNTF重组载体双酶切。 

图2：大肠杆菌E.coli(pCold/hCNTF)总蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图。M：低分子量蛋白标准，1：E.coli(pCold/hCNTF)(未诱导)，2：E.coli(pCold/hCNTF)(IPTG诱导，未突变的核酸序列），3：E.coli(pCold/hCNTF)(IPTG诱导，突变的核酸序列）。 

图3：大肠杆菌E.coli(pCold/hCNTF)破菌蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图。M：低分子量蛋白标准，1.E.coli(pCold/hCNTF)总蛋白(IPTG诱导)，2.E.coli(pCold/hCNTF)上清(IPTG诱导)。 

图4：可溶性hCNTF回收纯化的SDS-PAGE凝胶电泳图。M：低分子量蛋白标准，1.E.coli(pCold/hCNTF)总蛋白（IPTG诱导），2：Ni²⁺亲和层析柱纯化，3：Q Sepharose FF离子交换层析纯化。 

具体实施方式

根据天然hCNTF的氨基酸序列，按照大肠杆菌偏好密码子原则，优化hCNTF的核苷酸序列，同时对优化的核苷酸序列进行ACA密码子突变，将人工合成的基因克隆入pCold质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3），经过表达筛选获得重组hCNTF高效可溶性表达工程菌。 

本发明表达载体选用了大肠杆菌表达载体pCold，受体菌为大肠杆菌BL21（DE3），pCold带有氨苄青霉素的抗性基因，因此通过抗生素筛选得到重组转化菌，经IPTG诱导后可在宿主菌中高效表达外源基因。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，列入分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件。 

实施例1：重组hCNTF核苷酸序列的优化 

本发明的重组hCNTF全基因合成由金斯瑞生物科技有限公司完 成，在进行基因合成时，要求在目的基因的上下端分别设计的Nde I和Xba I两个酶切位点，分别为CGCCATATG和ACGCTCTAGA。所合成的目的基因全长603bp，装入克隆载体pUC57质粒中测序验证。与天然hCNTF基因相比，本发明所合成的cDNA将原始hCNTF中的部分密码子改为大肠杆菌偏好密码子，同时对ACA密码子进行了突变，但是没有涉及到氨基酸的改变，属同义突变。 

实施例2：重组表达载体pCold/hCNTF的构建 

将带有全长hCNTF的pUC57及pCold质粒分别进行Nde I，Xba I双酶切，将两个片段用T4连接酶进行连接，得到pCold/hCNTF质粒。将连接产物用热激发转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑选克隆，小量制备质粒，通过双酶切及测序鉴定筛选阳性克隆。 

实施例3：高效可溶性表达工程菌的获得、筛选及鉴定 

（1）实施例2中获得的重组质粒转化进入宿主菌BL21（DE3），即本发明的工程菌。 

（2）在固体M9琼脂培养基平板挑选单克隆，于含氨苄青霉素100ug/ml的4mLM9液体培养基中37℃，200转/分，摇菌过夜。 

（3）接种1%的菌液至含氨苄青霉素100ug/ml的M9培养液里，37℃摇菌至OD=0.5，加入1mM终浓度的IPTG诱导，15℃摇菌6h，回收菌体。 

（4）经超声破菌后，分别对全菌、上清和沉淀（包涵体）蛋白进行SDS-PAGE分析外源蛋白表达量。对照诱导前后菌体及上清外源蛋白的变化，筛选外源蛋白高效表达的工程菌。 

实施例4：表达产生的重组hCNTF的含量和可溶性比例 

优化的核苷酸序列所对应的目的蛋白可在大肠杆菌中高效可溶性表达。发明人使用ImageTool3.0灰度扫描软件对SDS-PAGE图进行灰度扫描。其中，天然核苷酸序列表达蛋白占菌体总蛋白23.4%以下，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的55.7%以上（如图2所示）。 

可溶性目的蛋白表达量占目的蛋白总表达量的92.2%以上(如图3所示)。 

实施例5：可溶性重组人睫状神经营养因子的纯化 

（1）将含有表达产物的菌体1g用细菌裂解液（20%蔗糖，20mMTris-Cl，pH8.0）10mL进行重悬，超声裂解菌体，4℃高速离心（10000rpm）15min,收集裂解上清液。 

（2）将裂解上清液用0.22μm的滤膜除杂，上Ni²⁺亲和层析柱（Histrap HP，GE），用不同浓度Imidazole Wash Buffer200mM进行洗脱，收集洗脱液，考马斯亮蓝染液鉴定。 

（3）将Ni²⁺亲和层析柱洗脱产物过PD10脱盐柱进行脱盐，用20mMTris-Cl（pH8.0）进行洗脱，收集洗脱液，考马斯亮蓝染液鉴定。 

（4）将脱盐产物（pH8.0）进行离子柱（HiTrap Q，GE）纯化，观测紫外检测峰，收集出峰样品，即为纯化重组人睫状神经营养因子。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。