小麦TaCPK2蛋白在植物抗病育种中的应用

摘要

本发明公开了小麦TaCPK2蛋白在植物抗病育种过程中的应用。本发明的优点在于，本发明的小麦TaCPK2基因，其属于CDPK基因家族参与植物对病原防卫的基因，在小麦中抑制TaCPK2基因的表达能够明显影响小麦对白粉病抗性，而在水稻中过表达TaCPK2基因可明显增加转基因水稻对白叶枯病抗性。可用于解决植株在由于白粉病、白叶枯病等真菌或细菌性病害导致的产量减少等问题。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一个钙依赖性蛋白激酶基 因在抗病工程中的应用。

背景技术

近年来，由于杀菌剂的大量使用，尽管没有出现作物病害大面积 爆发的局面，然而过多依赖于农药，不仅增加了生产成本，而且还造 成了大面积环境污染，严重威胁农业生态安全。采用生物技术手段， 克隆作物抗病基因并将其应用于作物抗病遗传育种是控制作物病害 流行最经济、安全、有效的方法。然而，由于抗病基因和无毒基因的 互作表现为品种对小种的专化抗性，植物抗病性常因病原菌群体生理 小种的变化而被克服，有些抗病基因还没有克隆到，其抗病性就由于 病菌群体毒性的变化而丧失。由此可见，利用抗病基因培育抗病品种 也在不断面临新的挑战。人们转而开始筛选广谱、持久的抗病重要相 关基因并培育具有持久抗病性的作物品种。

钙依赖性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase，CDPK)是 植物和原生动物所特有的钙离子(Ca²⁺)感受器。非生物胁迫、病原、 激素以及光等刺激均可导致植物内源Ca²⁺浓度发生变化(Knight and  Knight，2001；Sanders，2002)，CDPK能够识别Ca²⁺浓度变化，改变下 游蛋白质(如转录因子)磷酸化状态，影响基因表达模式(Sanders et al.， 1999)。CDPK蛋白包含4个结构域，即N-末端可变区(N)，蛋白激 酶结构域(kinase，K)，自抑区(autoinhibitory region，A)以及类钙调 蛋白结构域(CaM-like)(Cheng et al.，2002；Hrabak et al.，2003)。 CaM-like结构域包含可以结合Ca²⁺的EF hands功能域。当Ca²⁺结合到 CDPK的CaM-like结构域，自抑区对激酶域的抑制被解除，CDPK即被 激活。CDPK在植物多条信号传递路径中扮演着关键调节子的角色。

作为早期信号因子，CDPK处于信号传递路径上游位置，在植物 病原防卫中发挥着重要作用(Cheng et al.，2002)。烟草NtCPK2被发 现是R基因介导的信号传递路径的组分(Romeis et al.，2001)。大麦中， 瞬时表达HvCDPK4，诱导同过敏反应类似的烟草叶肉细胞死亡的蔓 延，不利于真菌的侵入；而瞬时表达HvCDPK3则有利于真菌的侵入 (Freymark et al.，2007)。大麦中的HvCDPK3和HvCDPK4这对基因 在控制白粉发病早期阶段进入宿主细胞的过程中，起拮抗作用。水稻 中的OsCPK13(OsCDPK7)在盐，干旱和低温等逆境环境中起着重要作 用(Saijo et al.，2000；Komatsu et al.，2007)，将其在高梁中过表达，却 表现出抗病相关性状(Mall et al.，2011)。在马铃薯中StCDPK5诱导St RBOHB的磷酸化并调节氧化爆发(Kobayashi et al.，2007)，可能参与 了植物对病原的防卫反应。

尽管目前小麦CDPK家族已有研究报道(Li et al.，2008)，然而 有关TaCPK2的生物学功能并没有明确阐释。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种小麦TaCPK2蛋 白在植物抗病育种中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供一种小麦TaCPK2蛋白，其氨基 酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了小麦TaCPK2蛋白在植物抗病育种过程中的应用。

所述的病害优选为白粉病或白叶枯病；所述植物优选为小麦或水 稻。

本发明提供的小麦TaCPK2蛋白在调节植物抗病中的应用。所述 应用是指通过过表达小麦TaCPK2基因，调节SA，JA路径相关基因 的表达变化，从而使植株产生抗病性。

上述技术方案具有如下优点：

本发明的小麦TaCPK2基因，其属于CDPK基因家族参与植物对 病原防卫的基因，在小麦中抑制TaCPK2基因的表达能够明显影响小 麦对白粉病抗性，而在水稻中过表达TaCPK2基因可明显增加转基因 水稻对白叶枯病抗性。可用于解决植株在由于白粉病、白叶枯病等真 菌或细菌性病害导致的产量减少等问题。

附图说明

图1为本发明实施例1和实施例3小麦TaCPK2基因的克隆中间载 体pEASY-T1 Simple；

图2为本发明实施例4的小麦钙依赖性蛋白激酶TaCPK2基因 VIGS后的抗病性降低的表型观察；

图3为本发明实施例5的植物表达载体pCUbi1390；

图4为本发明实施例6的小麦钙依赖性蛋白激酶基因TaCPK2增 加水稻(苗期)对白叶枯的抗性；

图5为本发明实施例7的小麦钙依赖性蛋白激酶基因TaCPK2增 加水稻(成株期)对白叶枯的抗性；

图6为本发明实施例8的量化统计结果显示小麦钙依赖性蛋白激 酶基因TaCPK2增加苗期水稻对白叶枯的抗性；

图7为本发明实施例9过表达水稻植株的RT-PCR阳性鉴定及其 内源基因表达不变；

图8为本发明实施例10的小麦钙依赖性蛋白激酶TaCPK2基因 过表达水稻不接菌条件下的考种结果。

其中，空载体(empty vector简称pC)为对照，1，2，3为3个 水稻过表达株系。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不 背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的 修改或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明中涉及到的生物材料中国春小麦、硬粒小麦DR147、小麦 Am6、北京837均为公知公用品种。若未特别指明，实施例中所用的 技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1小麦钙依赖性蛋白激酶TaCPK2基因全长的克隆

使用带有限制性酶切位点的引物，正向引物 GCATATGGGCAACGCATGCGGCGGT(如SEQ ID No.4所 示)和反向引物GCATCTAGATTGCACCAGGTGCGTC(如 SEQ ID No.5所示)从中国春小麦(Triticum aestivum L.)叶的cDNA 中克隆TaCPK2基因的编码区序列；

PCR程序：94℃，5分钟；94℃，30秒；55℃，30秒；72℃， 90秒；重复35次；72℃，10分钟。

PCR体系：2×EasyTaq PCR SuperMix(全式金公司)25μl；

正向引物(10μM)    2μl；

反向引物(10μM)    2μl；

DNA模板            5μl；

双蒸水        补足50μl。

PCR产物切胶回收纯化后按照北京全式金生物技术有限公司提 供的pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆方法克隆连接到pEASY-T1 Simple载体上(图1)，连接产物转化大肠杆菌DH5α，并在其中扩繁， 阳性克隆经过测序筛选获得TaCPK2，其cDNA序列如SEQ ID NO.1 所示；由其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：小麦钙依赖性蛋白激酶基因TaCPK2编码蛋白的结构分析

小麦钙依赖性蛋白激酶基因TaCPK2编码蛋白的结构分析显示， 由该基因所编码的蛋白同其它植物中的CDPK蛋白结构域一样具有 保守的酶活位点和结构域。系统进化分析显示，由小麦TaCPK2基因 所编码的蛋白同大麦中的HvCDPK4蛋白相似性最高，为95.9％。而 HvCDPK4诱导叶肉细胞死亡的蔓延，不利于真菌的侵入，对白粉菌 的侵入起到抵抗作用。因此，小麦TaCPK2基因与大麦中的HvCDPK4 基因具有类似抵御白粉菌入侵的功能。

实施例3：小麦钙依赖性蛋白激酶基因TaCPK2的VIGS载体及VIGS 植株

使用带有限制性酶切位点的引物，正向引物 TGTCCTTTGATGGGCAACGCA(如SEQ ID No.6所示)和 反向引物CCGCGTGGCCGTCCGTCTT(如SEQ ID No.7所 示)从中国春小麦(Triticum aestivum L.)叶的cDNA中进行PCR扩 增，PCR程序：94℃，5分钟；94℃，30秒；56℃，30秒；72℃， 30秒；重复35次；72℃，10分钟。

PCR体系：2×EasyTaq PCR SuperMix(全式金公司)25μl；

正向引物(10μM)    2μl；

反向引物(10μM)    2μl；

DNA模板            5μl；

双蒸水        补足50μl。

PCR产物切胶回收纯化后按照北京全式金生物技术有限公司提供的 pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆方法克隆连接到pEASY-T1 Simple 载体上(图1)，连接产物转化大肠杆菌DH5α，并在其中扩繁，阳性 克隆经过测序筛选获得TaCPK2的cDNA片段，其cDNA序列如SEQ ID NO.3所示。大麦条纹花叶病毒(BSMV)载体由BSMV-α，BSMV- β，BSMV-γ三个组分构成(Holzberg et al.，2002；赵丹等，2011)。 将上述测序正确的pEASY-T1Simple载体和BSMV-γ载体用NEB的 NheI酶切，回收酶切的TaCPK2(190bp)基因片段和BSMV-γ载体 片段，用T4DNA连接酶(NEB)连接，将TaCPK2的基因片段反向 连接到BSMV-γ载体多克隆位点。将连接产物转化到大肠杆菌DH5 α感受态中，菌液PCR筛选阳性克隆并测序验证，获得序列正确的载 体质粒即为重组载体BSMV-γ:TaCPK2。

绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)来源于海洋生 物水母，其基因可在异源组织中表达并产生荧光，GFP cDNA开放阅 读框架长度约714bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第 65-67位丝氨酸-脱氢酪氨酸-甘氨酸通过自身环化和氧化形成一 个发色基因，在长紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。绿色荧光蛋 白是常用的报告基因之一。本研究中之所以选用绿色荧光蛋白作为对 照，是因为该基因在植物体内没有任何同源基因，因此携带GFP的 BSMV载体不会沉默植物中的任何基因，可以作为基因下调表达的对 照。

在VIGS实验中，BSMV:GFP常常用来作为阴性对照(Li et al.， 2011；Cao et al.，2011)。该载体构建过程与BSMV-γ:TaCPK2载体 相同，即将克隆到的GFP基因片段与BSMV-γ载体片段用T4DNA 连接酶(NEB)连接，并通过转化到大肠杆菌感受态细胞，测序筛选 得到正确的载体质粒即为BSMV-γ:GFP重组载体。

VIGS植株获得的方法步骤：

1)提取BSMV-α，BSMV-β，BSMV-γ：TaCPK2和BSMV- γ:GFP的质粒，BSMV-α，BSMV-γ:TaCPK2和BSMV-γ:GFP用 Mlu1酶切，BSMV-β用Spe1酶切，37℃，8h。线性化处理，50μl NEB 酶切体系如下：

Mlu1：

10×NEB缓冲液： 5μl

质粒：        ≤2μg

Mlu1：          1μl

灭菌双蒸水：to 50μl

Spe1：

10×NEB缓冲液： 5μl

质粒：        ≤2μg

100×BSA：    0.5μl

Mlu1：          1μl

灭菌双蒸水：to 50μl

2)乙醇沉淀

150μl线性化好的质粒，加350μl DEPC(Diethyl pyrocarbonate) H₂O，加500μl酚氯仿(苯酚和氯仿体积比为1∶1)，12000rpm离心 30min。取上清450μl，加45μl NaAc(PH 5.2，3M)，加1ml冷(4 ℃)无水乙醇，混匀。-20℃过夜。12000rpm离心30min，倒掉上清， 1ml 70％乙醇重复洗两次，晾干，加30μl DEPC H₂O溶解。浓度应≥ 400ng/μl。

3)体外转录试剂盒使用北京GBI公司提供的AmpliCap-Max^TM T7 and T3 High Yield Message Maker Kits(Epicentre，USA)

10μl反应体系：

模板：           3μl

10×转录缓冲液： 1μl

Cap/NTP预混液：  4μl

100mM二硫苏糖醇：1μl

T7酶：           1μl

42℃，3h。

4)病毒接种

BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ:TaCPK2(或BSMV-γ:GFP)转录 物各取10μl混合，共30μl，加3倍体积(90μl)的DEPC H₂O，总 体积达到120μl，再加一倍体积(120μl)的GKP buffer，制得240 μl TaCPK2和GFP的接种病毒混合液。

用于病毒侵染的小麦材料选用抗白粉病近等基因系PmAm6/北京 837*BC₅F₃(PmAm6/北京837*BC₅F₃制备方法：以四倍体硬粒小麦 (Triticum durum)DR147为母本，以二倍体粗山羊草(Aegilops  taushii)Ae39为父本，人工合成六倍体小麦Am6。以Am6为供体亲 本，以北京837为轮回亲本，从杂交F1中筛选抗白粉病单株，与北京 837回交，从每次回交后代中筛选抗病单株。从回交5代的F₃家系中 筛选纯合抗病单株，即为PmAm6/Beijing837*BC₅F₃)。待小麦幼苗第 二片叶展平时(14d)，开始接种。戴刚开封橡胶手套，用处理过的无 RNA酶的枪头取5-10μl接种液到食指肚上，一手固定住小麦幼苗基 部，另一手用大拇指和食指轻轻来回摩擦小麦第二片叶。

接种完后，向小麦幼苗喷施DEPC H₂O，保鲜膜覆盖，保湿24h (高湿有利于病毒侵入)，之后揭开。温度在20-32℃之间均可(温度 升高不利于病毒侵入，且叶片长的很快)。

6-8天后，第三片叶产生病毒斑，即为病毒接种成功，得到 BSMV:TaCPK2和BSMV:GFP的VIGS植株。

实施例4：VIGS实验证明TaCPK2基因参与白粉病抗性反应

实施例3中获得的BSMV:TaCPK2和BSMV:GFP植株在培养箱 一起培养至第四叶展平，将有病毒发病表型的植株叶片剪下，放在苯 并咪唑培养基上接种白粉菌E09培养一周，可明显看出 BSMV:TaCPK2植株中TaCPK2基因表达下调导致感染白粉病，叶片 表面有肉眼可见的白色孢子堆，而对照BSMV:GFP植株中由于 TaCPK2基因表达未发生变化，因此依然抗白粉病，叶片表面干净。 由此得出结论：TaCPK2基因参与白粉病抗性反应。如图2所示，Bj 为感病材料接种白粉菌后长出孢子堆，作为感病对照；MOCK为抗 白粉材料接种GKP buffer，没有感染白粉病；BSMV:GFP为接种病 毒BSMV:GFP植株，没有感染白粉病；BSMV:TaCPK2为接种病毒 BSMV:TaCPK2植株，局部感染了白粉病，证明TaCPK2基因参与白 粉病抗性反应。

实施例5：小麦钙依赖性蛋白激酶基因TaCPK2植物表达载体

从实施例1获得的测序正确的TaCPK2，利用KpnI和SpeI两个 酶切位点，得到构建在pEASY-T1 Simple(北京全式金生物技术有限 公司)载体上的全长序列TaCPK2，将植物表达载体pCUbi1390(Peng  et al.，2009)(图3)进行同样的酶切后，按照NEB公司的T4 DNA 连接酶的使用方法将酶切得到的两个片段连接，并按照实施例3中的 方法将连接产物转化大肠杆菌DH5α，在其中扩繁，阳性克隆经过测 序获得TaCPK2的过表达载体。采用农杆菌介导法将得到的TaCPK2 的过表达载体转化到水稻中，得到转化植株。植物中的筛选标记为潮 霉素。

应用实施例6：小麦钙依赖性蛋白激酶基因TaCPK2增加水稻对白叶 枯的抗性---苗期

从实施例5获得的水稻转化植株与其空载体(野生型空育131) 在大田中同时一起培育，直至成株期。图4显示小麦钙依赖性蛋白激 酶基因TaCPK2转化水稻，导致苗期水稻对白叶枯的抗性增加。如图 4所示，空载体(empty vector简称pC)为对照，1，2，3为3个水 稻过表达株系。接种白叶枯2周以后的叶片表型，说明小麦TaCPK2 基因参与水稻抗病反应。

实施例7：小麦钙依赖性蛋白激酶基因TaCPK2增加水稻对白叶枯的 抗性---成株期

从实施例5获得的水稻转化植株与其空载体(野生型为空育131) 在大田中同时一起培育，直至成株期。图5显示小麦钙依赖性蛋白激 酶基因TaCPK2转化水稻，导致成株期水稻对白叶枯的抗性增加。如 图5所示，空载体(empty vector简称pC)为对照，1，2，3为3个 水稻过表达株系。接种白叶枯2周以后的叶片表型，说明小麦TaCPK2 基因参与水稻抗病反应。

实施例8：统计结果显示：小麦钙依赖性蛋白激酶基因TaCPK2增加 水稻苗期对白叶枯的抗性

从实施例6获得水稻转化植株接种白叶枯后的叶片枯斑长度与 叶片总长度的比值进行统计，结果显示小麦钙依赖性蛋白激酶基因 TaCPK2的确增加水稻对白叶枯的抗性。如图6所示，空载体(pC) 为对照，1，2，3为3个株系(每个株系9个叶片)的统计值。白叶 枯侵染比例分别为：pC，52％；1，24％；2，29％；3，11％。数据显 示，转基因植株比对照病斑比例明显减小，对白叶枯抗性增加。

实施例9：测定TaCPK2过表达植株(水稻)中TaCPK2和OsCPK13 的表达量

利用RT-PCR测定TaCPK2过表达植株(水稻)中TaCPK2和 OsCPK13的表达量，结果如图7所示。水稻中的OsCPK13基因和 TaCPK2基因序列的相似性最高。从实施例6和实施例7获得的过表 达水稻进行RT-PCR鉴定，在水稻Tubulin检测cDNA的质量及浓度 基本一致的条件下，TaCPK2过表达植株(水稻)中检测到TaCPK2 的表达，空载体(pC)中无表达；且水稻中的内源基因OsCPK13表 达量基本不变，即TaCPK2基因的过表达没有影响水稻内源基因 OsCPK13的表达。所以，实施例6和实施例7过表达植株的抗病作 用是由于过表达的小麦TaCPK2基因产生的。

实施例10：小麦钙依赖性蛋白激酶基因TaCPK2水稻过表达植株在 不接菌条件下对水稻的产量基本没有影响。

从实施例7获得的水稻考种结果如图8所示：三个转基因株系(1， 2，3)与空载体(pC)相比较，分蘖数(A)和穗粒数(B)略微减少；株 高(C)和单粒重(D)基本不变，说明小麦钙依赖性蛋白激酶基因 TaCPK2水稻过表达植株在不接种白叶枯条件下对水稻的产量基本没 有影响。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。