具有促进iNOS的分解的NO产生活性的正义寡核苷酸以及iNOS产生量的抑制方法

摘要

本发明提供具有促进iNOS的分解的NO产生活性的正义寡核苷酸以及iNOS产生量的抑制方法，所述正义寡核苷酸为：5’-GCCTCATACTTCCTCAGAGC-3’、5’-TAGCTGCATTGTGTACAGAT-3’、5’-GTGTATAATTCCTTGATGAA-3’、5’-GAAGCACTTTGGGTGACCAC-3’、5’-TAGCTGCACTATGTACAGAT-3’、5’-CAGATATTTATACTTCATAT-3’。使用本发明的正义寡核苷酸，可以控制iNOS的表达，对生物体防御或NO的过剩产生所相关的疾病、例如致癌和炎症性疾病、细菌感染等所引起的内毒素休克等的治疗和预防是有用的。

说明书

本申请是申请日为2007年06月07日、优先权日为2006年06月08日、中国专利申请号为200780021101.5、发明名称为“具有iNOS的表达控制作用的正义寡核苷酸以及含有其的组合物”的分案申请。 

技术领域

本发明涉及用于控制iNOS（诱导型一氧化氮合酶，inducible nitric oxide synthase）的表达且具有与下述单链RNA（反义转录物）互补的序列的正义寡核苷酸（sense oligonucleotide），所述单链RNA具有与iNOS基因的mRNA互补的碱基序列。 

背景技术

生物体内的一氧化氮（NO）从巨噬细胞、血管内皮细胞、神经区域等各处产生，作为其作用，有杀菌作用、血管松驰作用，或者也作为神经信号传达物质而发挥作用。 

已知介由一氧化氮产生的是一氧化氮合成酶（NOS，nitric oxide synthase），根据在体内的作用场所的不同，NOS分为诱导型NOS（iNOS，inducible NOS）、神经型NOS（nNOS，neuronal NOS）和血管内皮型NOS（eNOS，endothelial NOS）3类，特别是，介由iNOS的NO产生与其它的NO合成系统即神经型NOS和血管内皮型NOS相比较，能长时间地持续其活性，并能产生更多量的NO（1μM以上）。 

iNOS主要是在巨噬细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、消化道上皮细胞、支气管上皮细胞、肝细胞、小胶质细胞等受到细胞毒素、感染或炎症性病灶中产生的IL-1β（白细胞介素-1β，Interleukin-1β）、TNF-α（肿瘤坏死因子-α，Tumor Necrosis Factor-α）、IFN-γ（干扰素-γ，Interferon-γ）等炎症性细胞因子的攻击时表达，从而产生NO。过剩生成的NO作为生物体 的感染防御反应中的主要炎症性介质而发挥作用。 

iNOS的表达也伴随炎症反应或细菌、真菌、病毒、原生动物等多种病原体的感染而产生。例如已知通过作为革兰氏阴性菌的普遍构成成分的脂多糖（LPS）和作为革兰氏阳性菌的细胞壁成分的脂磷壁酸（LTA）的刺激、或介由炎症性细胞因子的间接的产生诱导，会引起iNOS的诱导。另外，最近发现，各种病毒的生物体内增殖也会引起NO合成的亢进，这种情况下的iNOS的诱导主要是介由IL-1β、IFN-γ等炎症性细胞因子的产生。 

来源于iNOS的NO显示出杀菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤作用，在生物体系的生命维持中不可缺少地存在。然而，另一方面，一旦由于炎症反应等引起iNOS活化而产生过剩的NO，则与活性氧反应而生成的强过氧亚硝酸盐（过氧亚硝酸根、过氧化亚硝酸）会损伤DNA，从而产生引起突变和致癌等负面作用。 

目前已知，通过多种因素引起iNOS过剩地表达，产生过剩的NO，由此会引起毒性休克或利用某种细胞因子的治疗等引起的全身性血压降低、血压响应降低、自身免疫疾病、炎症、关节炎、风湿性关节炎、糖尿病、炎症性肠病、血管功能不全、病原性血管扩张、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏症、脑缺血、恶液质、癌症等各种疾病。 

因此，控制iNOS的表达在生物体防御或NO过剩产生相关的疾病、例如致癌和炎症性疾病、细菌感染等引起的内毒素休克等的治疗和预防方面是非常重要的。 

以往已知被称为RNAi（RNA干扰：RNA interference）的方法，即用双链RNA切断目标mRNA来抑制转录的方法，但通常的RNAi都是20个碱基对左右的碱基长（专利文献1：特开2005-13224号公报），并公开了其双链寡核苷酸和其反义RNA的筛选方法。另外，还公开了下述化合物，该化合物可用于通过使用小核酸分子、例如短干扰核酸（siNA）、短干扰RNA（siRNA）、双链RNA（dsRNA）、微小RNA（miRNA）和短发夹RNA（shRNA）分子的RNA干扰（RNAi）来调节白细胞介素基因、白细胞介素超家族基因或与基因表达和/或活性的白细胞介素路径相关的基因的表达和活性（专利文献2：特开2005-524393号公报）。 

当细胞内存在反义RNA时，其和与之互补的mRNA杂交，从mRNA向蛋白质的翻译受到阻碍，因此可以阻碍基因的表达。如果人为地将反义RNA导入细胞内，就可以阻碍靶基因的表达，因而目前作为阐明基因功能的技术来使用，也在研究其向医药品的应用。至今为止，对于iNOS基因，反义RNA的存在并未得到确认。另外，至今为止，虽然暗示了存在着从mRNA转录时有助于mRNA的稳定化的蛋白质（非专利文献1：Eur.J.Pharmacol.500:255-266(2004)），但其详细情况并不明了，关于iNOS的表达控制还有很多不明确的问题。 

专利文献1：特开2005-13224号公报 

专利文献2：特开2005-524393号公报 

非专利文献1：Eur.J.Pharmacol.500:255-266(2004) 

发明内容

本发明提供用于iNOS的表达控制且具有与下述单链RNA（反义转录物）互补的序列的正义寡核苷酸，所述单链RNA具有与iNOS基因的mRNA互补的碱基序列。 

本发明人等发现在细胞内存在具有与mRNA互补的序列的单链RNA（反义转录物）、其与以往的反义RNA不同、且会有助于mRNA的稳定化的情况，并在同一天申请了专利。 

进而，本发明人等对iNOS的表达控制进行了深入研究，结果发现了下述方法，从而完成了本发明，该方法使用具有与上述单链RNA（反义转录物）互补的序列的正义寡核苷酸来与反义转录物杂交以抑制其功能，从而干扰mRNA的稳定性，结果抑制iNOS的表达，从而抑制NO的过剩产生。 

即，本发明涉及具有与以下的iNOSmRNA反义RNA（iNOSmRNA反义转录物）互补的序列的正义寡核苷酸、具有NO产生抑制活性的组合物、以及iNOS产生量的抑制方法。 

1.一种正义寡核苷酸，其具有与下述iNOSmRNA反义RNA（iNOSmRNA反义转录物）互补的序列，所述iNOSmRNA反义RNA具有与iNOS（诱导型一氧化氮合酶）mRNA互补的序列。 

2.根据上述1记载的正义寡核苷酸，其具有与含有序列号1所示的核酸序列的上述iNOSmRNA反义RNA（iNOSmRNA反义转录物）互补的序列。 

3.根据上述1或2记载的正义寡核苷酸，其在与上述iNOSmRNA反义RNA（iNOSmRNA反义转录物）中热力学不稳定的环结构对应的区域具有互补的序列。 

4.根据上述1～3的任意一项记载的正义寡核苷酸，其具有16个碱基～335个碱基的碱基长。 

5.根据上述1～4的任意一项记载的正义寡核苷酸及其衍生物，其经过对核酸分解酶引起的分解的稳定化。 

6.根据上述5中记载的正义寡核苷酸，其中，稳定化是利用LNA、PNA、ENA、吗啉和其它修饰方法进行的。 

7.一种组合物，其含有上述1～6的任意一项记载的正义寡核苷酸，且具有促进iNOSmRNA的分解的NO产生抑制活性。 

8.一种iNOS产生量的抑制方法，其特征在于，在细胞内导入下述正义寡核苷酸，该正义寡核苷酸具有与iNOSmRNA反义RNA（iNOSmRNA反义转录物）互补的序列。 

本发明的具有和具有与iNOSmRNA互补的序列的反义转录物互补的序列的正义寡核苷酸、以及其硫代磷酸酯型、即S代正义寡核苷酸可以作为对与NO的过剩产生相关的疾病即炎症性疾病、细菌感染造成的内毒素休克、致癌等有效的医药品组合物、即作为医药品来使用，或作为对这些疾病有效的保健食品组合物、即作为保健食品来使用。 

附图说明

图1为表示利用RT-PCR法的大鼠肝细胞中的mRNA量的测定结果的电泳图。 

图2为表示利用实时PCR法的大鼠肝细胞中的mRNA量的测定结果的图。 

图3为表示iNOSmRNA通过小鼠iNOS反义转录物而被分解的电泳图。 

图4为表示显示投予肝脏保护剂（IGF-I）的大鼠的iNOSmRNA增加被抑制的利用链特异性RT-PCR的iNOSmRNA的检测结果的电泳图。 

图5为显示投予肝脏保护剂（IGF-I）的大鼠的iNOS反义转录物增加被抑制的利用链特异性RT-PCR的iNOS反义转录物的检测结果（电泳图）。 

图6为表示将投予肝脏保护剂（IGF-I）的大鼠的iNOS反义转录物的增加用实时PCR来定量的结果的图。图中，“*”表示相对于GalN/LPS大鼠（n＝3～6只大鼠/组），p<0.05。 

图7为表示显示投予肝脏保护剂（FR183998）的大鼠的iNOSmRNA增加被抑制的利用链特异性RT-PCR的iNOSmRNA的检测结果的电泳图。 

图8为表示显示投予肝脏保护剂（FR183998）的大鼠的iNOS反义转录物增加被抑制的利用链特异性RT-PCR的iNOS反义转录物的检测结果的电泳图。 

图9为表示将投予肝脏保护剂（FR183998）的大鼠的iNOS反义转录物的增加用实时PCR来定量的结果的图。图中，“*”表示相对于GalN/LPS大鼠（n＝3～6只大鼠/组），p<0.05。 

图10为表示实施例10中iNOS蛋白质和培养基中的一氧化氮（NO）量的测定结果的电泳图和图。 

图11为表示实施例11中4种RNA的利用Northern法得到的分析结果的X射线放射自显影图。从左开始表示“无刺激大鼠肝细胞的全RNA”、“IL-1β刺激大鼠肝细胞的全RNA”、“IL-1β刺激大鼠肝细胞的Poly（A）+RNA”和“IL-1β刺激大鼠肝细胞的的Poly（A）－RNA”的结果。 

图12为表示显示实施例11中RACE的结果和核糖核酸酶保护分析的结果的图。 

图13为实施例12中构建的载体的示意图。 

图14为表示在实施例12中iNOS反义转录物表达载体加入时（AS（+））和未加入时（AS（－））的Luc/βGal值的随时间变化的图。 

图15为表示在实施例12中使用连结有SVpA的报告基因（reporter）作为对照时的Luc/βGal值的随时间变化的图。 

具体实施方式

本发明是在细胞内使用具有与下述单链RNA（反义转录物）互补的序列的正义寡核苷酸来与反义转录物杂交以抑制其功能，从而干涉mRNA的稳定性，结果抑制iNOS的表达，从而抑制NO的过量产生，所述单链RNA（反义转录物）具有与有助于诱导型一氧化氮合酶iNOS mRNA的稳定化的iNOSmRNA互补的序列。 

具有与iNOSmRNA互补的序列的单链RNA是含有和序列号1表示的碱基序列相同或实质上相同的碱基序列的核苷酸。实质上相同的核苷酸是指含有序列号1或与之具有75%以上、优选90%以上、更优选95%以上的同源性的碱基序列、且使诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的合成量增加的物质，可以用化学合成、公知的表达方法以及精制法或者实施例中记载的方法来制备。 

本发明的具有与iNOSmRNA的上述反义转录物互补的序列的正义寡核苷酸（以下将之称为“本发明的正义寡核苷酸”）是可以和反义转录物发生杂交的寡核苷酸或其衍生物，按照不会被核内的核酸分解酶分解的方式进行修饰的物质即可。 

正义寡核苷酸设计可以使用Nucleic Acids Res.31,3406-3415(2003)和J.Mol.Biol.288,911-940(1999)中公开的程序“mfold”（参照http://www.bioinfo.rpi-edu/～zukerm/rna/）预测RNA的二级结构来进行。正义寡核苷酸的候补序列设计为与热力学不稳定的部分（例如茎环（stem-loop）结构中茎部分之外的区域）、优选与含有茎环结构的环（loop）结构的部分相对的正义寡核苷酸。 

关于上述的正义寡核苷酸的候补序列，可以选择不含有会在细胞中引起序列非特异性反应的5’-CG-3’、5’-GGGG-3’以及5’-GGGGG-3’等序列的序列，在大鼠基因组中进行同源性检索，确认不存在类似的序列后，选择优选的序列（参照J.Neurochem.86,374382(2003)）。 

作为正义寡核苷酸，可以列举出序列号2～4所示的寡核苷酸等（下述序列都省略了修饰来表示）。 

5’-GCCTCATACTTCCTCAGAGC-3’（序列号36） 

5’-TAGCTGCATTGTGTACAGAT-3’（序列号37） 

5’-GTGTATAATTCCTTGATGAA-3’（序列号38） 

它们可以用化学合成、公知的表达方法以及精制法或者实施例中记载的方法来制备。 

本发明的正义寡核苷酸修饰成不会被核内的核酸分解酶分解即可，该修饰没有特别的限制。由于正义寡核苷酸在细胞内会被从5’或3’末端依次除去核苷酸的酶即核酸外切酶（exonuclease）从两端消化，因此优选修饰为例如从两端开始将1个以上的磷酸键P＝O置换为P＝S、且对分解酶稳定的硫代磷酸酯型（以下将之称为“S代正义寡核苷酸”）（参照J.Neurochem.86,374-382(2003)）。但是，一旦全部的磷酸键都发生硫代，则会产生光学异构性，从杂交方面来说变得不利。 

作为S代正义寡核苷酸的具体例子，可以列举出下述等（序列中，*表示S代的部分）。 

5’-G*C*C*TCATACTTCCTCAG*A*G*C-3’, 

5’-T*A*G*CTGCATTGTGTACA*G*A*T-3’ 

5’-G*T*G*TATAATTCCTTGAT*G*A*A-3’ 

作为其它的修饰方法，可以列举出PNA（肽核酸，peptide nucleic acids）、LNA（锁核酸，Locked Nucleic Acids）、ENA（2’-O,4’-C-亚乙基-桥核酸，2’-O,4’-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids;Sigma-Aldrich公司）、吗啉（Morpholino）寡核苷酸（Gene Tools公司，OR，USA）等。 

本发明的正义寡核苷酸通过导入到已确认存在iNOSmRNA的反义转录物的细胞内，从而与反义转录物反应（杂交），降低细胞内的反义转录物的有效量，因而，通过正义寡核苷酸的投予，可以使原来的基因产物（iNOS）的表达量减少，从而抑制NO的过剩产生。 

实施例 

以下示出实施例来具体地说明本发明，但本发明并不受它们的限定。 

（1）与iNOSmRNA互补的序列、即反义转录物的序列和区域（碱基长）的确定方法 

实施例1：大鼠iNOS反义转录物 

用以下的方法对大鼠iNOS的mRNA研究是否存在从基因的反义链转录而成的“反义转录物”，并研究该“反义转录物”与正义基因产物的产生的控制是怎样相关的。另外，大鼠iNOS的mRNA的碱基序列通过DDBJ/EMBL/GenBank国际碱基序列数据库（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank）可知。 

在细胞因子和急性期蛋白等引起诱导表达的基因的mRNA的3’非翻译区域（3’UTR）中存在被称为AU-rich element（AU富含元素，ARE）的序列，即5’-AUUUA-3’或5’-AUUUUA-3’的序列（参照Proc Natl Acad Sci USA83：1670-1674（1986））。由于ARE也存在于人、大鼠和小鼠的iNOSmRNA的3’UTR中，因而通过链特异性RT-PCR法研究了与含有该ARE的3’UTR相对应（序列互补的）反义转录物是否存在。该方法是下述的方法：使用寡聚dT引物之类的仅与mRNA杂交（链特异性）的引物来进行逆转录，合成互补的DNA（cDNA）后，进行PCR法以扩增cDNA，从而测定mRNA的量。 

即，使用以下所示的iNOS基因的正义链的引物：5’-TGCCCCTCCCCCACATTCTCT-3’（序列号2），对向培养基中添加IL-1β而诱导了iNOSmRNA的大鼠原代培养肝细胞的全RNA进行RT-PCT，从而合成cDNA。 

将从大鼠原代培养肝细胞制备的RNA（1μg）和2pmol的引物混合后，在70℃加热10分钟，然后迅速冷却至0℃。向其中加入ReverTra Ace反应缓冲液（东洋纺）、dNTP（N＝A、C、G、T）（最终浓度为1mM）、20units RNase抑制剂（东洋纺）和200units ReverTra Ace逆转录酶（东洋纺），使总量为25μl。在47℃下保温60分钟以进行逆转录，然后在70℃加热15分钟使逆转录酶失活。之后，加入5units的Tth RNase H（东洋纺），在37℃加热20分钟以分解模板RNA。合成的cDNA进行乙醇沉淀来回收，并用20μl的TE缓冲液溶解。 

向如此获得的cDNA2μl中加入PCR反应缓冲液（Nippon Gene公司）、dNTP（N＝A、C、G、T；Nippon Gene公司）（最终浓度为125μM）、下述2种引物、正向（Forward）引物40pmol、反向（Reverse）引物40pmol、1 unit Gene Taq DNA聚合酶（Nippon Gene公司）以及anti-Taq high（＝抗Taq聚合酶抗体，东洋纺）#，使总量为40μl，进一步进行PCR。 

正向： 

5’-ACCAGGAGGCGCCATCCCGCTGC-3’（序列号3） 

反向： 

5’-CTTGATCAAACACTCATTTTATTAAA-3’（序列号4） 

PCR的温度方案可以依照公知的方法、即步减（step-down）法（参照Nishizawa M,Nakajima T,Yasuda K,Kanzaki H,Sasaguri Y,Watanabe K,and Ito S.Close kinship of human20a-hydroxysteroid dehydrogenase gene with three aldo-keto reductase genes.Genes Cells(2000)5,111-125）来进行。进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，结果可见186个碱基对（bp）的条带的扩增。 

将该条带从凝胶中切下并精制，确定碱基序列，结果确认了其为夹在上述的引物序列间、与大鼠iNOSmRNA的3’UTR的序列互补的序列。即，通过使用iNOS基因的正义引物的链特异性RT-PCR法，证明了反义转录物的存在。 

为了进一步研究iNOS基因的反义转录物的全部结构，尝试了用RACE法（参照Frohman MA.Rapid amplification of complementary DNA ends for generation of full-length complementary DNAs:thermal RACE.Methods Enzymol.(1993)218:340-356）来解析。RACE法是由已知的cDNA序列制作链特异性引物来进行逆转录、从而确定5’侧和3’侧的cDNA的序列的方法。 

[5’侧的cDNA的序列的确定] 

向大鼠原代培养肝细胞中添加IL-1β以诱导iNOS mRNA，并用Trizol试剂（Invitrogen）制备RNA。以该RNA为模板，使用序列号2的引物（iNOS的正义（正向）引物；5’-TGCCCCTCCCCCACATTCTCT-3’）合成双链cDNA。在该cDNA上连接CA cassette adapter（接头）（cDNA PCR文库试剂盒（Takara Bio株式会社）附带）之后，使用序列号3的引物（针对iNOS mRNA的3’UTR的正义（正向）引物）和CA引物（cDNA PCR文库试剂盒（Takara Bio株式会社）附带）进行PCR。将反应液进行琼脂糖凝胶电泳，结果发现 约250bp大小的条带发生了扩增。切下该条带，克隆至pGEM-T Easy载体（Promega），从而确定碱基序列。 

[3’侧的cDNA的序列的确定] 

与上述同样地由用IL-1β诱导的大鼠原代培养肝细胞制备RNA。使用PolyATract mRNA Isolation System（PolyATract mRNA分离体系）（Promega）来精制PolyA—级分的RNA，以该RNA为模板，使用带有锚定（anchor）序列（下划线部分）的随机引物（锚定随机引物：5’-TTCCCTCCCGTTTTCTCTGCCACTAGAATTCTCGAGCGGCCGCNNNNNNN-3’（序列号5））来合成双链cDNA。在该双链cDNA上连接CA cassette adapter之后，使用序列号4的引物（针对iNOS mRNA的3’UTR的反义（反向）引物）和CA引物进行PCR。精制该反应液并将之作为模板，使用针对iNOS mRNA的3’UTR的反义（反向）引物（5’-ATATTAGAGCAGCGGGATGGCGCCTC-3’（序列号6））和锚定引物（针对上述“锚定随机引物”的锚定序列的引物；5’-ACTAGAATTCTCGAGCGGCCGC-3’（序列号7））进行2次PCR。将反应液进行琼脂糖凝胶电泳，结果发现200～500bp大小的条带发生了扩增。切下该条带，克隆至pGEM-T Easy载体，从而确定碱基序列。 

根据其结果推测反义转录物的全长大致为600个碱基以上。以下表示了其序列（序列号1，显示的是cDNA序列）。即，反义转录物对应于iNOSmRNA的3’UTR，转录起始点（5’侧）位于iNOS mRNA的polyA附加部位的互补链。 

实施例2：人iNOS反义转录物 

用以下的方法对人iNOS的mRNA研究是否存在由基因的反义链转录而成的“反义转录物”。另外，人iNOS的mRNA的碱基序列通过DDBJ/EMBL/GenBank国际碱基序列数据库（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank）可知。 

依照通常的方法，使用Trizol试剂（Invitrogen公司），从人的组织（胎盘、肝脏、胃粘膜）或细胞（未刺激的淋巴细胞）中提取全RNA。将获得的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free试剂盒（Applied Biosystems 公司）进行处理，除去混入的基因组DNA。以该全RNA为模板，使用如下所示的人iNOS基因的正义链的引物：5’-CTGAGTGCACCACTTCAAGTGAC-3’（序列号8），进行逆转录，从而合成cDNA。具体来说，除了不使用实施例1中的由大鼠原代培养肝细胞制备的RNA1μg和用序列号2表示的引物2pmol，而是使用从人的组织或细胞制备的全RNA（1μg）和上述序列号8表示的引物（2pmol）以外，用和实施例1相同的方法合成cDNA。 

向如此获得的cDNA2μl中加入PCR反应缓冲液（Nippon Gene公司）、dNTP（N＝A、C、G、T；Nippon Gene公司）（最终浓度为125μM）、下述2种引物、正向引物40pmol、反向引物40pmol、1unit Gene Taq DNA聚合酶（Nippon Gene公司）以及anti-Taq high（＝抗Taq聚合酶抗体，东洋纺）#，使总量为40μl，进一步进行PCR。 

正向： 

5’-CAGGAGGTGCTATCGCACCACT-3’（序列号9） 

反向： 

5’-GCAATTCATGTAAATATCTCCATC-3’（序列号10） 

用和实施例1相同的方法进行PCR。进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，结果发现在使用人胎盘来源的cDNA时可见151个碱基对（bp）的条带的扩增。而在其它的cDNA（肝脏、胃粘膜或未刺激的淋巴细胞）中未见扩增。 

将扩增的条带从凝胶中切下并精制，确定碱基序列，结果确认了其为夹在上述的引物序列间、与人iNOSmRNA的3’UTR的序列互补的序列。即，通过使用iNOS基因的正义引物的链特异性RT-PCR法，证明了人iNOS反义转录物的存在。iNOS反义转录物的序列如序列号11所示。是以cDNA序列的形式表示的。 

实施例3：小鼠iNOS反义转录物 

用以下的方法对小鼠iNOS的mRNA研究是否存在由基因的反义链转录而成的“反义转录物”。另外，小鼠iNOS的mRNA碱基序列通过DDBJ/EMBL/GenBank国际碱基序列数据库（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank）可知。 

依照通常的方法，使用Trizol试剂（Invitrogen公司），从RAW264细胞中提取全RNA。将获得的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free试剂盒（Applied Biosystems公司）进行处理，除去混入的基因组DNA。以该全RNA为模板，使用如下所示的小鼠iNOS基因的正义链的引物：5’-CCTTCTTCTCCACTCCCCAGCT-3’（序列号12）进行逆转录，从而合成cDNA。具体来说，除了不使用实施例1中的由大鼠原代培养肝细胞制备的RNA1μg和用序列号2表示的引物2pmol，而是使用从RAW264细胞制备的全RNA（1μg）和序列号12表示的引物（2pmol）以外，用和实施例1相同的方法合成cDNA。 

向如此获得的cDNA2μl中加入PCR反应缓冲液（Nippon Gene公司）、dNTP（N＝A、C、G、T；Nippon Gene公司）（最终浓度为125μM）、下述2种引物、正向引物40pmol、反向引物40pmol、1unit Gene Taq DNA聚合酶（Nippon Gene公司）以及anti-Taq high（＝抗Taq聚合酶抗体，东洋纺）#，使总量为40μl，进一步进行PCR。 

正向： 

5’-GACCACCAGGAGGCACCATGCCG-3’（序列号13） 

反向： 

5’-ATACAGGAAAGGCCCAAGCCATC-3’（序列号14） 

用和实施例1相同的方法进行PCR。进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，结果可见127个碱基对（bp）的条带的扩增。 

将扩增的条带从凝胶中切下并精制，确定碱基序列，结果确认了其为夹在上述的引物序列间、与小鼠iNOS mRNA的3’UTR互补的序列。即，通过使用iNOS基因的正义引物的链特异性RT-PCR法，证明了小鼠iNOS反义转录物的存在。小鼠iNOS反义转录物的序列如序列号15所示。是以cDNA序列的形式表示的。 

（2）利用与iNOSmRNA互补的反义转录物（以下仅简称为“反义”）使iNOSmRNA稳定化 

实施例4：利用与大鼠iNOS反义转录物使iNOSmRNA稳定化 

为了明确大鼠反义是否能使iNOSmRNA稳定化，将具有与大鼠反义互补的序列、并具有与大鼠反义杂交的性质的iNOS的正义寡核苷酸导入大鼠原代培养肝细胞中并研究iNOSmRNA的量。 

正义寡核苷酸通过将寡核苷酸中的一个磷酸二酯键的磷酸的氧原子置换为硫原子（S代），从而防止了细胞内核酸分解酶导致的寡核苷酸的分解。通过IBA公司（Gottingen，Germany）的利用Magnet assisted transfection法的基因导入试剂盒（MATra-A试剂），将S代正义寡核苷酸导入至大鼠原代培养肝细胞中。 

大鼠原代培养肝细胞用公知的方法（J.Hepatol,40,616-623,2004）制备，并接种在6孔板中（每孔3×10⁵个细胞）。2小时后，更换为每孔1.5ml的新培养基（在Williams’E培养基（WE）中含有10%胎牛血清、10nM地塞米松和10nM胰岛素的培养基。简称为WES-DI）。然后4小时后，将寡核苷酸（2μg）和WE（200μl）混合，接着混合2μl的MATra-A试剂（IBA公司），在室温下静置20分钟后，将之全部滴加至加入有肝细胞的孔中。将6孔板置于磁盘（IBA公司）上，在室温下静置15分钟，从而将寡核苷酸导入细胞内。更换为含有10%胎牛血清的WE（每孔1.5ml），之后在37℃下放置一夜。第二天早晨，更换为含有1nM的IL-1β的WE培养基，在37℃下放置4小时后，制备了全RNA。 

用IL-1β刺激肝细胞时，iNOSmRNA的量显著增加，导入上述的S代正义寡核苷酸后用IL-1β刺激，用RT-PCR法和实时PCR法进行mRNA量的测定。结果如图1和2所示。 

此处使用的iNOS基因的正义链序列、即具有与iNOSmRNA相同的序列的S代寡核苷酸为如下所示的序列。在实验中相当于S2、S4和S5。 

S2:5’-G*C*C*TCATACTTCCTCAG*A*G*C-3’ 

S4:5’-T*A*G*CTGCATTGTGTACA*G*A*T-3’ 

S5:5’-G*T*G*TATAATTCCTTGAT*G*A*A-3’ 

（S代的部分用*表示。） 

另一方面，作为阴性对照，碱基组成相同但序列不同，因而导入具有确认不会与iNOSmRNA或其转录物、或其它的RNA发生杂交的序列的“随 机寡核苷酸（scramble oligo）”。随机寡核苷酸的序列如下所示。 

Scr2:5’-G*G*T*ATTGCCCACCCAAC*T*C*T-3’ 

Scr4:5’-G*G*C*TCCATATGATTAGA*T*G*T-3’ 

Scr5:5’-G*A*T*TGTTACTTAGAGAC*T*A*T-3’ 

为了防止细胞内的分解，这些随机寡核苷酸也和正义寡核苷酸同样，在硫代后使用。对于“随机寡核苷酸”，通过进行与大鼠基因组的同源性检索，确认了不存在类似的序列。 

进而，作为另一个阴性对照，导入相对于iNOSmRNA的茎环结构的茎部分的硫代正义寡核苷酸S1。S1的序列如下所示。 

S1:5‘-C*A*T*TCTCTTTCCTTTGC*C*T*C-3’ 

（*表示和上述相同的意义。） 

使用与正义链（具有与mRNA相同序列的链）相同序列的引物进行链特异性RT-PCR法时，由于仅有相对于“反义转录物”cDNA被逆转录，因而可以测定“反义转录物”的量。另外，设置在不进行逆转录的情况下进行PCR的对照，确认了肝细胞的全RNA中混入的基因组没有通过PCR而扩增。在图中用RT（－）表示。 

结果是，导入了S2、S4和S5的硫代正义寡核苷酸时，iNOSmRNA的量减少。这表示，硫代正义寡核苷酸和iNOS的反义转录物发生杂交，反义转录物被分解，因而iNOSmRNA也被分解。另一方面，在导入随机寡核苷酸时，iNOSmRNA的量没有大的变动。另外，在导入相对于茎部分的S1时，iNOSmRNA的量也没有大的变动。 

另外，在向肝细胞中导入正义寡核苷酸S5或随机寡核苷酸Scr5时，以经逆转录的cDNA为模板，使用实时PCR法来测定添加IL-1β后的iNOSmRNA的量。其结果是，导入随机寡核苷酸Scr5时，iNOSmRNA的量变为2倍所需要的时间为119分钟。与之相对，导入正义寡核苷酸S5时为461分钟（图2）。 

与iNOS同样，iNOS之外的早期应答基因Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractant（细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子）1、CINC-1也在肝细胞中在IL-1β刺激下引起显著的mRNA的诱导。而且，在CINC-1的mRNA 的3’非翻译区域（3’UTR）中也与iNOSmRNA同样地存在ARE序列。在将iNOS的正义寡核苷酸导入肝细胞时测定CINC-1的mRNA量，结果发现与未导入正义寡核苷酸时的mRNA量没有差别。即，显示了iNOS的正义寡核苷酸的作用仅限于iNOS（图1）。 

综合以上结果可见，iNOS的正义寡核苷酸与iNOS反义转录物特异性地杂交，从而促进iNOSmRNA的分解，结果使iNOSmRNA的量特异性地减少。 

实施例5：利用小鼠iNOS反义转录物使iNOSmRNA稳定化 

向来源于小鼠巨噬细胞的RAW264细胞中导入具有与小鼠反义杂交的性质的iNOS正义寡核苷酸的硫代正义寡核苷酸，研究小鼠反义转录物对iNOSmRNA的表达抑制。 

以下未记载的操作采用和实施例4相同的方法进行。将小鼠RAW264细胞按每孔5×10⁵细胞接种，更换为DMEM培养基，用CO₂恒温器培养。 

通过IBA公司（Gottingen，Germany）的Magnet assisted transfection法，在RAW264细胞内导入硫代正义寡核苷酸。更换为含有10%胎牛血清的DMEM培养基（每孔1.5ml），之后在37℃放置一夜。第二天早晨，更换为含有大肠杆菌LPS（1μg/ml）的DMEM培养基，在37℃放置4小时，之后提取全RNA以供于RT-PCR。另外，全RNA用含有DNase的TURBODNA-free试剂盒（Applied Biosystems公司）进行处理，除去混入的基因组DNA。 

正义寡核苷酸相对于对应于小鼠反义转录物的小鼠iNOSmRNA来制作。 

此处使用的小鼠iNOS基因的正义链的序列、即具有与iNOSmRNA相同的序列的硫代寡核苷酸以序列表示。在实验中相当于S1、S2和S3。 

S1:5’-G*A*A*GCACTTTGGGTGAC*C*A*C-3’ 

S2:5’-T*A*G*CTGCACTATGTACA*G*A*T-3’ 

S3:5’-C*A*G*ATATTTATACTTCA*T*A*T-3’ 

（硫代的部分用*表示。） 

依照在实施例4中进行的链特异性RT-PCR法，测定小鼠iNOSmRNA的量。 

结果是小鼠iNOSmRNA的量减少。这表明，硫代正义寡核苷酸和iNOS的反义转录物发生杂交，反义转录物被分解或被竞合，因而，iNOSmRNA也被分解（图3）。 

[实施例1～5总结] 

由实施例4和5的结果显示，不仅是大鼠，对于小鼠，iNOS的正义寡核苷酸也通过和iNOS反义转录物特异性地杂交而促进iNOSmRNA的分解，结果使iNOSmRNA的量特异性地减少。 

这样，在大鼠肝细胞和小鼠细胞中都可以使用正义寡核苷酸来抑制iNOSmRNA的表达。因此，使用正义寡核苷酸的iNOSmRNA的表达抑制会减轻肝脏等的炎症时的iNOS诱导和NO产生，可以说是肝功能障碍的有效治疗方法。 

（3）和iNOS基因之外的早期应答基因的mRNA互补的序列即反义转录物的序列和区域（碱基长）的确定方法 

在炎症时被诱导而表达的基因（所谓的“早期应答基因”）中，不仅有iNOS，还包含细胞因子和趋化因子等生理活性物质的基因。这些早期应答基因具有使炎症恶化、或使其改善等多种作用。调节早期应答基因的表达最终与调节炎症有关。因此，除了iNOS基因的反义转录物之外，也研究了其它早期应答基因是否也表达反义转录物。接着，推定对于在物种间高保守的、且含有多个ARE序列的3’UTR序列，反义转录物也被表达。而且，对该部分设计逆转录用的正义引物和PCR用的一对引物，与用大鼠的iNOS基因来检测反义转录物的实施例4同样地进行链特异性RT-PCR法，研究在大鼠肝细胞中是否有反义转录物的表达。 

在iNOS之外的早期应答基因中，以3’UTR中含有多个ARE序列、且物种间（人、小鼠、大鼠）3’UTR序列高度类似的3个典型的基因为例进行研究。即，使用以下的3个基因。 

（a）细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子1(CINC-1):也被称为趋化 因子(C-X-C motif)配体1（CXCL1），是被IL-1β刺激的大鼠肝细胞中诱导的趋化因子。 

（b）NF-κB p50：转录因子NF-κB的亚型之一，是与炎症密切相关的蛋白质。 

（c）IκB-α：抑制NF-κB的活性的蛋白质。 

另外，人、小鼠以及大鼠的这些mRNA的碱基序列通过DDBJ/EMBL/GenBank国际碱基序列数据库（http://www.ddbj.nig.ac.jp/、http://www.ebi.ac.uk/embl/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank）可知。 

实施例6：大鼠CINC-1反义转录物 

用以下方法对大鼠CINC-1的mRNA研究是否存在由基因的反义链转录而成的“反义转录物”。以下没有特别记载的操作用和实施例1相同的方法进行。 

用IL-1β刺激原代培养大鼠肝细胞，然后依照通常的方法，使用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取全RNA。将获得的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free试剂盒（Applied Biosystems公司）进行处理，除去混入的基因组DNA。以该全RNA为模板，使用如下所示的大鼠CINC-1基因的正义链的引物：5’-TGTCTGGTGAACGCTGGCTTCTGA-3’（序列号16）进行逆转录，从而合成cDNA。 

使用获得的cDNA和以下所示的大鼠CINC-1基因的正义链的2种引物：正向：5’-TGTGGATGCGTTTCATCGATGGT-3’（序列号17）；反向：5’-CTAGCACAGTGGTTGACACTTA-3’（序列号18），用和实施例1相同的步减法进行PCR。 

进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，结果可见122个碱基对（bp）的条带的扩增。将该扩增的条带从凝胶中切下并精制，确定碱基序列，结果确认了其为夹在上述的引物序列间的大鼠CINC-1mRNA的3’UTR的序列。即，通过使用iNOS基因的正义引物的链特异性RT-PCR法，证明了大鼠CINC-1基因的反义转录物的存在。大鼠CINC-1基因的反义转录物的序列如序列号19所示。是以cDNA序列的形式表示的。 

实施例7：大鼠NF-κB p50反义转录物 

用以下方法对大鼠NF-κB p50的mRNA研究是否存在由基因的反义链转录而成的“反义转录物”。以下没有特别记载的操作用和实施例6相同的方法进行。 

用IL-1β刺激原代培养大鼠肝细胞，然后依照通常的方法，使用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取全RNA。将获得的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free试剂盒（Applied Biosystems公司）进行处理，除去混入的基因组DNA。以该全RNA为模板，使用如下所示的大鼠NF-κB p50基因的正义链的引物：5’-CTGTCATTAAGGTATCGCAGTCC-3’（序列号20）进行逆转录，从而合成cDNA。 

使用获得的cDNA和以下所示的大鼠NF-κB p50基因的正义链的2种引物：正向：5’-CATCTACAGTACAGTCATGCACTC-3’（序列号21）；反向：5’-GGGAAAATACTATTTTCAGCACTGAT-3’（序列号22），用和实施例1相同的步减法进行PCR。 

进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，结果可见192个碱基对（bp）的条带的扩增。将该条带从凝胶中切下并精制，确定碱基序列，结果确认了其为夹在上述的引物序列间的大鼠NF-κB p50mRNA的3’UTR的序列。即，通过使用iNOS基因的正义引物的链特异性RT-PCR法，证明了大鼠NF-κBp50基因的反义转录物的存在。大鼠NF-κB p50基因的反义转录物的序列如序列号23所示。是以cDNA序列的形式表示的。 

实施例8：大鼠IκB-α反义转录物 

用以下方法对大鼠IκB-α的mRNA研究是否存在由基因的反义链转录而成的“反义转录物”。以下没有特别记载的操作用和实施例6相同的方法进行。 

用IL-1β刺激原代培养大鼠肝细胞，然后依照通常的方法，使用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取全RNA。将获得的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free试剂盒（Applied Biosystems公司）进行处理，除去混入 的基因组DNA。以该全RNA为模板，使用如下所示的大鼠IκB-α基因的正义链的引物：5’-TCCAGAATCTGATAAAAGGACCAC-3’（序列号24）进行逆转录，从而合成cDNA。 

使用获得的cDNA和以下所示的大鼠IκB-α基因的正义链的2种引物：正向：5’-TGAACCGCCATAGACTGTAGCTG-3’（序列号25）；反向：5’-GCACATACCACTGAACACCTGGT-3’（序列号26），用和实施例1相同的步减法进行PCR。 

进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，结果可见102个碱基对（bp）的条带的扩增。将该条带从凝胶中切下并精制，确定碱基序列，结果确认了其为夹在上述的引物序列间的大鼠IκB-αmRNA的3’UTR的序列。即，通过使用iNOS基因的正义引物的链特异性RT-PCR法，证明了大鼠IκB-α基因的反义转录物的存在。大鼠IκB-α基因的反义转录物的序列如序列号27所示。是以cDNA序列的形式表示的。 

[实施例6～8的总结] 

作为炎症时表达的早期应答基因，选择了iNOS之外的代表性的3个基因（CINC-1、NF-κB p50、IκB-α），每一个都在3’UTR中含有多个ARE序列，且物种（人、小鼠、大鼠）之间3’UTR的序列高度相似。和iNOS相同，这3种基因也确认了有反义转录物表达。 

由此推测，反义转录物是在含有ARE序列、且在物种间3’UTR序列高度相似的早期应答基因中均可见的分子。进而，强烈地暗示了反义转录物调节这些mRNA的稳定性的可能性。因此，期待可以通过抑制肝脏等的炎症中的早期应答基因的反义转录物的作用来抑制炎症。 

（4）使用大鼠急性肝功能衰竭模型的生物体内（in vivo）的iNOS和反义转录物的表达诱导和肝脏保护剂（IGF-I和FR183998）对iNOS和反义转录物的表达诱导的抑制效果 

由实施例1和实施例4的结果显示，在大鼠原代培养肝细胞（in vitro）体系中，iNOS诱导时，与iNOSmRNA的3’-非翻译区域（3’UTR）对应的反义转录物表达，从而促进iNOSmRNA的稳定化。如下示出在肝功能障碍 大鼠（in vivo）中，iNOS反义转录物也随着iNOS诱导而表达。另外，胰岛素样生长因子I（Insulin-like growth factor-I，IGF-I）和Na⁺/H⁺交换抑制剂（FR183998）等肝脏保护剂的投予所引起的存活率的变化和炎症性细胞因子、iNOSmRNA以及反义转录物的诱导之间的关系如下所示。 

实施例9 

（I）急性肝功能衰竭模型的制作和肝脏保护剂的投予 

对雄性Sprague-Dawley大鼠（250-300g）静脉注射D-半乳糖胺（400g/kg）和细菌内毒素LPS（16μg/kg）的混合液（D-GalN/LPS），制造急性肝功能衰竭的模型。在D-GalN/LPS处理的30分钟前投予胰岛素样生长因子I（IGF-I，3.2mg/kg）或Na⁺/H⁺交换抑制剂（FR183998，1mg/kg）。测定血中和肝脏的炎症性细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、干扰素γ、CINC-1）、MIP-2和一氧化氮（NO）。由肝脏制备全RNA，通过RT-PCR来研究iNOSmRNA和iNOS反义转录物。 

（II）RNA的分析 

静脉注射D-半乳糖胺和LPS的混合液3或6小时后，取出大鼠的肝脏，依照通常的方法，使用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取全RNA。以该全RNA为模板，使用寡聚dT引物进行逆转录，之后通过和实施例1等相同的方法进行PCR（RT-PCR法）。对于iNOSmRNA和内部标准延伸因子（elongation factor）-1α（EF1）mRNA的定量，逆转录时使用寡聚dT引物，PCR时使用：iNOSmRNA：CCAACCTGCAGGTCTTCGATG（序列号28）和GTCGATGCACAACTGGGTGAAC（序列号29）；EFmRNA：TCTGGTTGGAATGGTGACAACATGC（序列号30）和CCAGGAAGAGCTTCACTCAAAGCTT（序列号31）。另外，在PCR反应液中加入了anti-Taqhigh（＝抗Taq聚合酶抗体，东洋纺）。 

另外，iNOS反义转录物的定量依照实施例1的方法进行。设置在不进行逆转录的情况下进行PCR的对照，确认了肝细胞的全RNA中混入的基因组没有通过PCR而扩增。iNOSmRNA检测结果如图4所示，iNOS反义转录物的检测结果如图5所示。图中，RT（－）表示逆转录（－）的阴性对照。 

（III）利用实时PCR进行mRNA和反义转录物的定量 

逆转录合成的cDNA使用日本Bio-Rad公司的iCycler System，也通过实时PCR进行了定量。在PCR反应液中添加SYBR Green I（Roche-Diagnostics公司）和anti-Taq high（＝抗Taq聚合酶抗体，东洋纺），用公知的方法即触减（Touch Down）法进行PCR。实际的PCR方案如下所述。 

1个循环（94℃，1分钟） 

50个循环（94℃，30秒钟；（72-0.3×n）℃，1分钟；72℃，30秒钟），n为循环数。结果如图6所示。图中，“*”表示“相对于GalN/LPS大鼠（n＝3～6只大鼠/组），p<0.05”。 

（IV）肝脏保护剂带来的iNOSmRNA和iNOS反义转录物量的变化 

未投予肝脏保护剂时，在D-GalN/LPS的静脉注射后，约24小时内几乎全部的动物（90%以上）死亡。随着时间的推移（1～12小时），血中和肝脏中的炎症性介质（TNF-α、IL-1β、IL-6、干扰素γ、CINC-1、MIP-2、NO）增加。显示出反义转录物随着肝脏的iNOSmRNA诱导而增加（iNOSmRNA和iNOS反义转录物都在6小时后达到最大），其结果可见过剩的NO产生。 

IGF-I的投予使死亡率减少至20～30%以下。而且，除了上述的炎症性细胞因子、NO产生被抑制以外，iNOSmRNA和反义转录物诱导的增加也同样被抑制（图4～6）。 

FR183998的投予也使死亡率减少至20～30%以下，除了上述的炎症性细胞因子、NO产生被抑制以外，iNOSmRNA和反义转录物诱导的增加也同样被抑制（图7～9）。 

（IV-1）大鼠急性肝功能衰竭模型中肝脏保护剂IGF-I对iNOSmRNA和反义转录物的表达诱导的效果 

由图4的结果可知，投予了D-半乳糖胺和LPS的大鼠（GalN/LPS大鼠）在3～6小时内iNOSmRNA水平增加，但投予了IGF-I的大鼠中其增加被抑制。 

由图5和6的结果所示，在RT（－）中几乎未见扩增的cDNA，因而 可以认为全RNA中混入的基因组DNA是极微量的。GalN/LPS大鼠在3～6小时内反义转录物水平增加，但投予了IGF-I的大鼠中其增加被抑制。 

（IV-2）大鼠急性肝功能衰竭模型中肝脏保护剂FR183998对iNOSmRNA和反义转录物的表达诱导的效果 

由图7的结果可知，GalN/LPS大鼠在3～6小时内iNOSmRNA水平增加，但投予了FR183998的大鼠中其增加被抑制。 

由图8和9的结果所示，在RT（－）中几乎未见扩增的cDNA，因而可以认为全RNA中混入的基因组DNA是极微量的。GalN/LPS大鼠在3～6小时内反义转录物水平增加，但投予了FR183998的大鼠中其增加被抑制。 

（5）大鼠肝细胞中的正义寡核苷酸的效果（iNOS蛋白质和一氧化氮（NO）量的变化） 

实施例10 

通过和实施例4相同的方法，将在实施例4中获得的正义寡核苷酸S5或随机寡核苷酸Scr5导入肝细胞中，用一氧化氮比色法分析试剂盒（Nitric Oxide Colorimetric Assay Kits（Roche-Diagnostics公司））测定培养基中的一氧化氮（NO）的量。第二天早晨，更换为含有1nM的IL-1β的WE培养基，在37℃下放置8～10小时，之后进行测定。另外，从细胞中提取全蛋白质，通过使用ECL试剂盒（GE Healthcare公司）的Western法来检测iNOS蛋白质。结果如图10所示。 

其结果显示，通过在大鼠肝细胞中导入正义寡核苷酸S5，iNOS蛋白质和培养基中的一氧化氮（NO）量减少。 

（6）利用Northern法来检测iNOS反义转录物 

实施例11 

通过Northern blot analysis（以下简称为Northern法）确认了在用IL-1β刺激的大鼠肝细胞中存在iNOS基因的反义转录物。 

（I）RNA的制备 

用IL-1β刺激大鼠肝细胞一定时间，然后使用Trizol试剂（Invitrogen 公司）提取全RNA。将获得的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free试剂盒（Applied Biosystems公司）进行处理，除去混入的基因组DNA。用PolyATract mRNA分离体系（Promega公司）对Poly（A）+和Poly（A）－RNA进行分级。为了防止非特异性的杂交，使核糖体RNA（rRNA）在最终浓度为5%的聚乙二醇6000和最终浓度为0.75M的NaCl存在下沉淀除去，将上清通过乙醇沉淀来回收，用于电泳。 

（II）Northern法：电泳 

将上述4种RNA、即无刺激大鼠肝细胞的全RNA、IL-1β刺激大鼠肝细胞的全RNA、IL-1β刺激大鼠肝细胞的Poly（A）+RNA和IL-1β刺激大鼠肝细胞的Poly（A）－RNA，用含有2.2M福尔马林的琼脂糖进行电泳和分离。 

（III）Northern法：杂交 

依照常法，将凝胶中的RNA转移至Nytran N过滤器（Whatman公司）。之后，在DIG EasyHyb缓冲液（Roche-Diagnostics公司）中，与地高辛（DIG）标记的iNOS的3’UTR的正义探针在73℃下进行一夜的杂交。第二天早晨，依照Roche-Diagnostics公司的操作手册，将过滤器进行洗涤。另外，iNOS的3’UTR的正义探针是通过使用DIG-11-UTP（Roche-Diagnostics公司）和T3RNA聚合酶（Stratagene公司）在试管内合成RNA而制得的。 

（IV）Northern法：检测 

依照Roche-Diagnostics公司的操作手册进行封闭，将其和与碱性磷酸酶结合了的抗DIG抗体（Roche-Diagnostics公司）一起孵育。洗涤后，使其与底物CDP-Star（Applied Biosystems公司）反应，然后通过X射线胶片来检测与iNOS正义探针杂交的RNA的条带。 

（V）结果和考察 

上述4种RNA的利用Northern法得到的分析结果（X射线胶片的放射自显影图）如图11所示。 

在“IL-1β刺激大鼠肝细胞的全RNA”和“IL-1β刺激大鼠肝细胞的Poly（A）－RNA”中观察到了600～1000个核苷酸（nt）的涂片（smear）状的深色条带。由于使用了iNOS的3’UTR的正义探针，因而可以认为这些涂 片状条带是iNOS的反义转录物的条带。因此可知，iNOS的反义转录物的长度并非恒定，而是各种长度（600～1000个核苷酸）的转录物的集合。 

综合RACE的结果和核糖核酸酶保护分析（Ribonuclease Protection Assay）的结果，可以认为，如图12所示，iNOS的反义转录物被合成。图中，虚线表示形成了600个核苷酸以上的各种长度的反义转录物。图中的数字为iNOS基因的外显子的编号，黑色部分为蛋白质的翻译区域，反白框是位于外显子27中的3’UTR。iNOS的mRNA示于基因的图中上侧。 

（7）iNOS反义转录物的过剩表达所带来的mRNA的稳定化 

实施例12 

当在大鼠肝细胞中使iNOS基因的反义转录物过剩表达时，确认了mRNA通过iNOS的3’UTR而稳定化。 

在一般的报告基因的情况下，将萤光素酶基因与iNOS基因的启动子结合。由于iNOS基因的启动子是“诱导型启动子”，因此在大鼠肝细胞中，由于IL-1β刺激，启动子活性发生较大的变化，经常不能观察到报告基因后结合的3’UTR的作用。因此，使用了无论是否受到刺激都能促成恒定量的表达的“组成型启动子”即延伸因子-1α（EF）基因的启动子。因此，由EF启动子控制的萤光素酶基因和β半乳糖苷酶基因无论是否受到刺激都能以恒定量表达。由此，可以单纯地观察到含有poly（A）信号序列的iNOSmRNA的3’UTR对萤光素酶mRNA的稳定性所带来的影响。 

以pGL3-Basic质粒（Promega公司）为基础构建以下3种载体。构建的载体的示意图如图13所示。 

（i）报告基因（萤光素酶载体）： 

EF启动子＋萤光素酶基因（Luc）＋iNOS3’UTR 

EF启动子＋萤光素酶基因（Luc）＋SVpA 

（萤光素酶mRNA组成型地表达，但可以通过光素酶基因的后部控制mRNA的稳定性） 

（ii）iNOS反义转录物表达载体： 

CMV启动子＋反向插入iNOS3’UTR＋SVpA 

（iNOS反义转录物在细胞内过剩地表达） 

（iii）内部标准（β半乳糖苷酶载体）： 

EF启动子＋β半乳糖苷酶（lacZ）基因＋SVpA 

（β半乳糖苷酶mRNA组成型地表达） 

另外，SVpA是来源于SV40病毒的poly（A）信号的序列，已知是稳定的3’UTR，加成了SVpA的mRNA难以被破坏。作为iNOS3’UTR的对照的CMV启动子是来源于巨细胞病毒的比EF启动子更强的组成型启动子。 

将（i）和（iii）的质粒同时导入大鼠肝细胞时，由于EF启动子是组成型的，因此萤光素酶mRNA（Luc）和β半乳糖苷酶mRNA（βGal）的合成量大致是恒定的。进而，如果iNOS反义转录物表达载体（ii）添加时和未添加时存在差别，则Luc mRNA/βGal mRNA（Luc/βGal值）应该也存在差别。如果Luc/βGal值根据iNOS反义转录物表达载体的有无而变化，则iNOS反义转录物的过剩表达通过iNOS3’UTR而影响萤光素酶mRNA的稳定性。 

[方法] 

（I）转染 

在原代培养大鼠肝细胞中通过上述的方法（MATra）导入以下的质粒。 

（i）报告基因（400ng/孔） 

±（ii）iNOS反义转录物表达载体（50ng/孔） 

（iii）内部标准（400ng/孔） 

放入iNOS反义转录物表达载体的为AS（+）、未放入的为AS（－）。 

（II）RNA的制备 

进行转染，经过一夜后，更换肝细胞的培养基，然后随时间推移提取全RNA。依照通常的方法，使用Trizol试剂（Invitrogen公司）进行。将获得的全RNA用含有DNase的TURBO DNA-free试剂盒（Applied Biosystems公司）进行处理，除去混入的基因组DNA。以该全RNA为模板，使用寡聚（dT）引物进行逆转录，从而合成针对mRNA的cDNA。 

（III）利用实时PCR进行mRNA的定量 

使用合成的cDNA，通过实时PCR进行定量。使用日本Bio-Rad公司的iCycler系统。在PCR反应液中添加SYBR Green I（Roche-Diagnostics公司）和anti-Taq high（＝抗Taq聚合酶抗体，东洋纺），用公知的方法即Touch Down法进行PCR。实际的PCR方案如下所述。 

1个循环（94℃，1分钟） 

50个循环（94℃，30秒钟；（72-0.3×n）℃，1分钟；72℃，30秒钟）（n为循环数）。 

作为报告基因的萤光素酶（Luc）的mRNA的PCR中使用的引物为以下2种。 

正向： 

5’-GCGAAGGTTGTGGATCTGGATAC-3’（序列号32） 

反向： 

5’-GAGCCACCTGATAGCCTTTGTAC-3’（序列号33） 

内部标准β半乳糖苷酶（βGal）的mRNA的PCR中使用的引物为以下2种。 

正向： 

5’-GTCACACTACGTCTGAACGTCGA-3’（序列号34） 

反向： 

5’-TGCAGAGGATGATGCTCGTGACG-3’（序列号35） 

进行实时PCR后，使用iCycler系统的分析软件来计算萤光素酶mRNA（Luc）和β半乳糖苷酶mRNA（βGal）的循环阈（Ct）值，之后将二者相除，求得Luc/βGal值。 

[结果] 

对于iNOS反义转录物表达载体添加和未添加的情况，随时间变化显示了Luc/βGal值。结果如图14所示。 

（i）报告基因（EF启动子+Luc+iNOS3’UTR）、 

±（ii）iNOS反义转录物表达载体、 

（iii）内部标准。 

此时，比较添加了iNOS反义转录物表达载体时AS（+）和未添加时 AS（－），可见Luc/βGal值显著地增加。图中，“**”表示“相对于AS(－)，p<0.01”。 

即，iNOS反义转录物通过iNOS3’UTR使萤光素酶mRNA稳定化。 

作为对照，使用连结有SVpA的报告基因的结果如图15所示。 

（i）报告基因（EF启动子+Luc+SVpA）、 

±（ii）iNOS反义转录物表达载体、 

（iii）内部标准。 

此时，比较添加了iNOS反义转录物表达载体时[AS（+）]和未添加时[AS（－）]，未见Luc/βGal值增加。即，SVpA并不影响mRNA的稳定性。 

[意义] 

根据以上结果（iNOS反义转录物的过剩表达实验），可以认为，iNOS反义转录物具有作用于iNOS3’UTR而使mRNA稳定化的作用。与利用硫代反义寡核苷酸的iNOSmRNA的knockdown实验的结果综合来看，可以说iNOS反义转录物通过iNOS3’UTR而使iNOSmRNA稳定化。 

因此，强烈暗示了利用iNOS反义转录物来控制iNOSmRNA的稳定性的机理会在肝脏等的炎症中发挥重要的作用。另外，该机理可以成为NO所相关的多种疾病的治疗靶的。 

通过投予肝脏保护剂，抑制了iNOSmRNA和反义转录物的诱导。以上的结果强烈暗示了反义转录物在体内（in vivo）也作为iNOSmRNA表达诱导的控制因子而相关。因此认为，使用肝脏保护剂的反义转录物的表达抑制会减少肝脏等的炎症时的iNOS诱导和NO产生，是肝功能障碍的有效治疗方法。