一种规模化制备及纯化细菌O-特异多糖的方法

摘要

本发明公开一种规模化制备及纯化细菌O-特异多糖的方法，该方法包括（1）细菌脂多糖水解为细菌O-特异多糖粗糖，（2）细菌O-特异多糖粗糖的纯化，其纯化依次经过第一次超滤、乙醇分级沉淀、第二次超滤、阴离子交换；阴离子交换是在第二次超滤获得的超滤浓缩液中加入缓冲液，上样于阴离子交换柱，用缓冲液淋洗阴离子交换柱至紫外吸光值不再下降；再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液；（3）目标物溶液的浓缩冻干即得纯化的细菌O-特异多糖。本发明方法不仅操作方便，制备成本低，处理量大适于规模化、产业化生产，而且生产获得的产品杂质含量低，纯度高，达到了进一步开发为人用疫苗的要求。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体的，涉及规模纯化制备细菌O-特异多糖 的方法。

背景技术

革兰氏阴性细菌的特异多糖是脂多糖的一部分。脂多糖（LPS）是革兰氏阴 性细菌细胞壁的主要成分之一，也是细菌内毒素的主要成分。脂多糖虽然是一种 保护性抗原，但也是一种毒力因子，美国NIH的Robbins等经过大量试验提出 LPS水解后得到的O-特异多糖(OSP)的型特异血清IgG抗体具有免疫保护性 （Robbins JB,Chu C,Schneerson R,Hypothesis for vaccine development: protective immunity to enteric diseases caused by nontyphoidal  salmonellae and shigellae may be conferred by serum IgG antibodies to the  O-specific polysaccharide of their lipopolysaccharides.Clin Infect Dis, 1992,15(2):346-361）。赵志强等用OSP制备成的结合物在安全性和免疫原性方 面取得了可喜的结果（赵志强,杨朝辉等,甲型副伤寒结合疫苗的制备及其免疫原 性研究.中华微生物学和免疫性杂志,2006,26(11):1048-1052）。目前将LPS 水解去掉毒性成分脂质A后得到的OSP制备成结合物已经成为许多肠道致病菌疫 苗的研究方向。但已有的纯化方法多局限在先获得纯度较高的LPS后再水解得到 合格的OSP，且对LPS的纯化步骤中多采用酶解、超速离心等方法（Edward K. Synthesis,characterization and immunological properties in mice of  conjugates composed of detoxified LPS of salmonella paratyphi A bound to  Tetanus toxoid,with Emphasis on the role of O-Acetyl[J].Infection and  immunity1996,64(7):2709-2715.），其缺点：酶解、超速离心的成本高，处理 量小不易于规模化、产业化，且容易存在外源因子污染、残留（酶解）；另外， 秦敏等人在纯化步骤采用的方法是先将LPS中核酸指标控制在10%以内，后水解 得到OSP进一步用凝胶过滤的方法才能将OSP中核酸指标控制在0.5%以内,蛋白 指标控制在1～2%（秦敏.甲型副伤寒沙门氏菌LPS提取和O-SP纯化.微生物 学免疫性进展2005,33(1)27-31），此方法要求对OSP纯化前必须将先LPS中核 酸指标控制在10%以内，否则难以达到后续的效果，因此，存在对OSP纯化前的 指标要求苛刻，整体工序复杂，后续的凝胶过滤法也存在上样体积小、流速小等 缺陷，不利于实现规模化、产业化。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在制备纯化成本高、整体工序复 杂、处理量小不易于规模化、产业化、或制品中易残留外源因子、对OSP纯化 前的指标要求苛刻等技术问题，其目的是提供了一种方便、重复性好、利于规 模化制备及纯化细菌O-特异多糖的方法。

本发明所提供的一种规模化制备及纯化细菌O-特异多糖的方法，包括以下 步骤：

（1）细菌脂多糖水解为细菌O-特异多糖粗糖

将细菌脂多糖用注射用水溶解至细菌脂多糖终浓度为2～30mg/ml后，加入 酸至酸终浓度为0.2～5%，沸水浴维持30～120min，收集上清液，并将上清液 pH调至6.0～8.0，得到细菌O-特异多糖粗糖；或将细菌脂多糖用注射用水溶解 至细菌脂多糖终浓度为2～30mg/ml后，加入氢氧化钠至氢氧化钠终浓度为0.2～ 1mol/L，20～45℃水浴维持1～12小时，收集上清液，并将上清液pH调至6.0～ 8.0，得到细菌O-特异多糖粗糖；

（2）细菌O-特异多糖粗糖的纯化

①第一次超滤：将细菌O-特异多糖粗糖离心收集上清液，采用1～10KD超 滤膜将上清液用注射用水超滤，得超滤浓缩液1，所用的注射用水体积为上清液 体积的2～10倍；

②乙醇分级沉淀：超滤浓缩液1中加入盐1和乙醇，其中盐1的终浓度为 0.1～0.5mol/L，乙醇的终浓度为20～80%，搅拌60～70min，2～8℃条件下沉淀 6～12小时后，离心收集上清液；

③第二次超滤：采用1～10KD超滤膜将步骤（2）②乙醇分级沉淀获得的上 清液用注射用水超滤，得超滤浓缩液2，所用的注射用水体积为上清液体积的2～ 10倍；

④阴离子交换：超滤浓缩液2中加入终浓度为0.001～0.2mol/L的缓冲液 得混合液，混合液的pH调至5.0～8.5，混合液上样于阴离子交换柱，用终浓度 为0.001～0.2mol/L，pH为5.0～8.5的缓冲液淋洗阴离子交换柱至紫外吸光值 不再下降；再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液由缓冲 液和盐2混合而成，洗脱液的pH为5.0～8.5，洗脱液中缓冲液的终浓度为 0.001～0.2mol/L，盐2的终浓度为0.01～0.2mol/L；

（3）目标物溶液的浓缩冻干：将目标物溶液采用1～10KD超滤膜，用注射 用水超滤后，低温真空干燥即得纯化的细菌O-特异多糖；超滤时所用注射用水 体积为目标物溶液体积的2～10倍。

步骤（1）所述的酸为硝酸、冰乙酸、柠檬酸、磷酸中任意一种。

步骤（2）④中所述的阴离子交换柱所用的填料为具有二乙氨乙基或季铵盐 作为配基的阴离子交换填料。

步骤（2）④中所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

步骤（2）②中所述的盐1为氯化钙或硫酸镁。

步骤（2）④中所述的盐2为氯化钠、磷酸钠、乙酸钠中任意一种。

所述的细菌O-特异多糖包括但不限于以下任意一种：甲型副伤寒菌O-特异 多糖、乙型副伤寒菌O-特异多糖、鼠伤寒O-特异多糖，痢疾志贺氏菌O-特异多 糖、O1群霍乱弧菌O-特异多糖、非O1群O139型霍乱弧菌O-特异多糖、伤寒 沙门氏杆菌、铜绿假单胞菌和致病性大肠杆菌的O-特异多糖、副溶血性弧菌O- 特异性多糖。

本发明还提供了用上述规模化制备及纯化细菌O-特异多糖的方法制备获得 的细菌O-特异多糖。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明方法克服了现有技术的提取纯度较高的OSP必须先对LPS进行纯化， 将其核酸含量控制在10%以内，然后再水解、进一步纯化，其水解前要求条件苛 刻、且进一步纯化采用的凝胶过滤法处理量小，不利于实现规模化、产业化生产； 以及在LPS阶段使用酶解、超速离心等价格昂贵、处理量小也不利于实现规模化、 产业化生产；存在外源因子污染的缺陷和不足。本发明方法不仅操作方便，制备 成本低，处理量大适于规模化、产业化生产，而且生产获得的产品杂质含量低， 其蛋白含量小于1%、核酸含量小于0.5%，达到进一步开发为人用疫苗的要求。

具体实施方式：

以下各实施例使用的细菌脂多糖（细菌LPS粗品）均由云南沃森生物技术有 限公司提供，也可向该公司购买，该公司地址：云南省昆明高新技术开发区北区 科发路云南省大学科技园，邮政编码650106。

超滤膜及夹具：0.5平米、0.1平米（购于Pall公司）；

纯化仪：AKTA explorer（购于GE Healthcare公司）；

离心机：CR21G（购于日立公司）；

冻干机：Labconco4.5L77500-70（购于Labconco公司）；

层析填料：

DEAE Sepharose FF、QSepharoseFF、Q Sepharose HP、SOURCE30Q、Capto  Q（购于GE公司）；

其余化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

实施例1：

（1）甲型副伤寒菌LPS水解为甲型副伤寒菌O-特异多糖粗糖

将甲型副伤寒菌LPS用注射用水充分溶解至甲型副伤寒菌LPS终浓度为 2mg/ml；加入硝酸至硝酸终浓度为0.2%（质量分数），沸水浴维持120min，收集 上清液，并将上清液pH调至6.0，该上清液即为得到的甲型副伤寒菌O-特异多 糖粗糖。

（2）甲型副伤寒菌O-特异多糖粗糖的纯化

①第一次超滤：

将甲型副伤寒菌O-特异多糖粗糖离心收集上清液，上清液采用1KD超滤 膜，用注射用水超滤，得超滤浓缩液1，超滤时所用的注射用水体积为上清液体 积的5倍。

②乙醇分级沉淀：

超滤浓缩液1中加入氯化钙至氯化钙终浓度为0.1mol/L，加入乙醇至乙 醇终浓度为80%（体积分数）；搅拌60min，2～8℃条件下沉淀6小时后，离心收 集上清液。

③第二次超滤：

将步骤（2）②乙醇分级沉淀收集的上清液采用1KD超滤膜，用注射用水 超滤得超滤浓缩液2，超滤时所用注射用水体积为上清液体积的5倍。

④阴离子交换：

超滤浓缩液2中加入Tris-HCl缓冲液至Tris-HCl的终浓度为0.2mol/L 得混合液，混合液的pH调至7.0；将混合液上样于DEAE Sepahrose FF阴离子 交换柱，用终浓度为0.2mol/L，pH为7.0的Tris-HCl缓冲液淋洗阴离子交换柱 至紫外吸光值不再下降；再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的 洗脱液由Tris-HCl缓冲液和氯化钠混合而成，洗脱液的pH为7.0，洗脱液中 Tris-HCl缓冲液的终浓度为0.2mol/L，氯化钠的终浓度为0.01mol/L。

（3）目标物溶液（即甲型副伤寒菌O-特异多糖溶液）的浓缩冻干：

将目标物溶液采用1KD超滤膜，用注射用水超滤后，在-48℃真空干燥即得纯 化的甲型副伤寒菌O-特异多糖；超滤时所用注射用水体积为目标物溶液体积的5 倍。

（4）甲型副伤寒菌O-特异多糖产品的检测：

分别将步骤（1）获得的甲型副伤寒菌O-特异多糖粗糖（纯化前）与步骤（3） 获得甲型副伤寒菌O-特异多糖（纯化后）进行检测：其中蛋白含量的检测依据 《中国药典》2010版三部（附录ⅥB第二法）进行；核酸含量的检测依据《中 国药典》2010版三部（附录ⅡA）进行；O-乙酰基含量的检测依据《中国药典》 2010版三部（附录ⅥF）进行；内毒素含量的检测依据《中国药典》2010版三 部（附录ⅫE）进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部（附录ⅧC）进 行，其结果见表1。

表1实施例1的纯化前后的甲型副伤寒菌O-特异多糖检测结果比较

实验及检测结果表明：本发明方法不仅操作方便，制备成本低，处理量大适 于规模化、产业化生产，避免了带来外源因子污染，而且生产获得的产品杂质含 量低、纯度高，符合制备人用疫苗的要求。

实施例2：

（1）乙型副伤寒菌LPS水解为乙型副伤寒菌O-特异多糖粗糖

将乙型副伤寒菌LPS粗品用注射用水充分溶解至乙型副伤寒菌终浓度为 10mg/ml；加入冰乙酸至冰乙酸终浓度为2%（质量分数），沸水浴维持90min，收 集上清液，并将上清液pH调至8.0，得到乙型副伤寒菌O-特异多糖粗糖。

（2）乙型副伤寒菌O-特异多糖粗糖的纯化

①第一次超滤：

将乙型副伤寒菌O-特异多糖粗糖离心收集上清液，上清液采用3KD超滤 膜用注射用水超滤，得超滤浓缩液1，超滤时所用的注射用水体积为上清液体积 的3倍。

②乙醇分级沉淀：

超滤浓缩液1中加入硫酸镁至终浓度为0.5mol/L；加入乙醇至终浓度为 60%（体积分数）；搅拌60min，2～8℃条件下沉淀8小时后，离心收集上清液；

③第二次超滤：

将步骤（2）②乙醇分级沉淀收集的上清液采用3KD超滤膜，用注射用水超 滤得超滤浓缩液2，超滤时所用注射用水体积为上清液的3倍；

④阴离子交换：

超滤浓缩液2中加入Tris-HCl缓冲液至Tris-HCl的终浓度为0.01mol/L 得混合液，混合液的pH为8.5；将混合液上样于Q Sepahrose HP阴离子交换柱， 用终浓度为0.01mol/L，pH为8.5的Tris-HCl缓冲液淋洗阴离子交换柱至紫外 吸光值不再下降；再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液 由Tris-HCl缓冲液和磷酸钠混合而成，洗脱液的pH为8.5，洗脱液中Tris-HCl 缓冲液的终浓度为0.01mol/L，磷酸钠的终浓度为0.2mol/L。

（3）目标物溶液（即乙型副伤寒菌O-特异多糖溶液）的浓缩冻干：

将目标物溶液采用3KD超滤膜，用注射用水超滤浓缩，在-48℃真空干燥即 得纯化的乙型副伤寒菌O-特异多糖，超滤时所用注射用水的用量为目标物溶液 体积的3倍。

（4）乙型副伤寒菌O-特异多糖产品的检测：

分别将步骤（1）获得的乙型副伤寒菌O-特异多糖粗糖（纯化前）与步骤（3） 纯化获得的乙型副伤寒菌O-特异多糖进行检测：其中蛋白含量的检测依据《中 国药典》2010版三部（附录ⅥB第二法）进行；核酸含量的检测依据《中国药 典》2010版三部（附录ⅡA）进行；O-乙酰基含量的检测依据《中国药典》2010 版三部（附录ⅥF）进行；内毒素含量的检测依据《中国药典》2010版三部（附 录ⅫE）进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部（附录ⅧC）进行，其 结果见表2。

表2实施例2的纯化前后的乙型副伤寒菌O-特异多糖检测结果比较

实验及检测结果表明：本发明方法不仅操作方便，制备成本低，处理量大适 于规模化、产业化生产，避免了带来外源因子污染，而且生产获得的产品杂质含 量低、纯度高，符合制备人用疫苗的要求。

实施例3

（1）鼠伤寒菌LPS水解为鼠伤寒菌O-特异多糖粗糖

将鼠伤寒菌LPS用注射用水溶解至鼠伤寒菌LPS终浓度为20mg/ml；加入冰 乙酸至冰乙酸终浓度为5%（质量分数），沸水浴维持60min，收集上清液，并将 上清液pH调至7.0，得到鼠伤寒菌O-特异多糖粗糖。

（2）鼠伤寒菌O-特异多糖粗糖的纯化

①第一次超滤：

将鼠伤寒菌O-特异多糖粗糖离心收集上清液，上清液采用5KD超滤膜，用注 射用水超滤，得超滤浓缩液1，超滤时所用的注射用水体积为上清液体积的5倍。

②乙醇分级沉淀：

超滤浓缩液1中加入氯化钙至氯化钙终浓度为0.2mol/L；加入乙醇至乙醇终浓 度为50%（体积分数）；搅拌60min，2～8℃条件下沉淀12小时后，离心收集上 清液。

③第二次超滤：

将步骤（2）②乙醇分级沉淀收集的上清液采用5KD超滤膜，用注射用水超 滤得超滤浓缩液2，超滤时所用注射用水体积为上清液体积的5倍。

④阴离子交换：

超滤浓缩液2中加入磷酸盐（PB）缓冲液至PB的终浓度为0.001mol/L 得混合液，混合液的pH为5.0；将混合液上样于Q Sepahrose FF阴离子交换柱， 用终浓度为0.001mol/L，pH为5.0的Tris-HCl？缓冲液淋洗阴离子交换柱至紫 外吸光值不再下降；再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱 液由PB缓冲液和乙酸钠混合而成，洗脱液的pH为5.0，洗脱液中PB缓冲液（磷 酸盐缓冲液（PB））的终浓度为0.001mol/L，乙酸钠的终浓度为0.01mol/L。

（3）目标物溶液（即鼠伤寒菌O-特异多糖溶液）的浓缩冻干：

将目标物溶液采用5KD超滤膜，用注射用水超滤浓缩后，在-48℃真空干燥 即得纯化的鼠伤寒菌O-特异多糖，注射用水的用量为目标物溶液体积的5倍。

（4）鼠伤寒菌O-特异多糖产品的检测：

分别将步骤（1）获得的鼠伤寒菌O-特异多糖粗糖（纯化前）与经步骤（3） 获得的鼠伤寒菌O-特异多糖（纯化后）进行检测，其中蛋白含量的检测依据《中 国药典》2010版三部（附录ⅥB第二法）进行；核酸含量的检测依据《中国药 典》2010版三部（附录ⅡA）进行；O-乙酰基含量的检测依据《中国药典》2010 版三部（附录ⅥF）进行；内毒素含量的检测依据《中国药典》2010版三部（附 录ⅫE）进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部（附录ⅧC）进行，其 结果见表3。

实验及检测结果表明：本发明方法不仅操作方便，制备成本低，处理量大适 于规模化、产业化生产，避免了带来外源因子污染，而且生产获得的产品杂质含 量低、纯度高，符合制备人用疫苗的要求。

表3实施例3的纯化前后的鼠伤寒菌O-特异多糖检测结果比较

实施例4：

（1）痢疾志贺氏菌LPS水解为痢疾志贺氏菌O-特异多糖粗糖

将痢疾志贺氏菌LPS用注射用水充分溶解至痢疾志贺氏菌LPS终浓度为 2mg/ml；加入磷酸至磷酸终浓度为3%，沸水浴维持30min，收集上清液，并将上 清液pH调至7.0，得到痢疾志贺氏菌O-特异多糖粗糖。

（2）痢疾志贺氏菌O-特异多糖粗糖的纯化

①第一次超滤：

将痢疾志贺氏菌O-特异多糖粗糖离心收集上清液，上清液采用3KD超滤 膜，用注射用水超滤，得超滤浓缩液1，超滤时所用的注射用水体积为上清液体 积的10倍。

②乙醇分级沉淀

超滤浓缩液1中加入硫酸镁至硫酸镁终浓度为0.3mol/L；加入乙醇至乙 醇终浓度为40%（体积分数）；搅拌70min，2～8℃条件下沉淀6小时后，离心收 集上清液。

③第二次超滤：

将步骤（2）②乙醇分级沉淀收集的上清液上清液采用3KD超滤膜，用注射 用水超滤得超滤浓缩液2，超滤时所用注射用水体积为上清液的10倍。

④阴离子交换

超滤浓缩液2中加入PB缓冲液至PB的终浓度为0.05mol/L得混合液， 混合液的pH为7.2；将混合液上样于SOURCE30Q阴离子交换柱，用终浓度为 0.05mol/L，pH为7.2的PB缓冲液淋洗阴离子交换柱至紫外吸光值不再下降； 再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液由PB缓冲液和氯 化钠混合而成，洗脱液的pH为7.2，洗脱液中PB缓冲液的终浓度为0.05mol/L， 氯化钠的终浓度为0.2mol/L。

（3）目标物溶液（即痢疾志贺氏菌O-特异多糖溶液）的浓缩冻干

将目标物溶液采用3KD超滤膜，用注射用水超滤浓缩后，在-48℃真空干燥 即得纯化的痢疾志贺氏菌O-特异多糖，注射用水的用量为目标物溶液体积的10 倍。

（4）痢疾志贺氏菌O-特异多糖产品的检测

分别将步骤（1）获得的痢疾志贺氏菌O-特异多糖粗糖（纯化前）与步骤（3） 获得的痢疾志贺氏菌O-特异多糖（纯化后）进行检测：其中蛋白含量的检测依 据《中国药典》2010版三部（附录ⅥB第二法）进行；核酸含量的检测依据《中 国药典》2010版三部（附录ⅡA）进行；O-乙酰基含量的检测依据《中国药典》 2010版三部（附录ⅥF）进行；内毒素含量的检测依据《中国药典》2010版三 部（附录ⅫE）进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部（附录ⅧC）进 行，其结果见表1。

表4实施例4的纯化前后的痢疾志贺氏菌O-特异多糖检测结果比较

实验及检测结果表明：本发明方法不仅操作方便，制备成本低，处理量大适 于规模化、产业化生产，避免了带来外源因子污染，而且生产获得的产品杂质含 量低、纯度高，符合制备人用疫苗的要求。

实施例5：

（1）O1群霍乱弧菌LPS水解为O1群霍乱弧菌O-特异多糖粗糖

将O1群霍乱弧菌LPS用注射用水充分溶解至O1群霍乱弧菌LPS终浓度为 30mg/ml；加入氢氧化钠至氢氧化钠终浓度为0.2mol/L，20℃水浴维持12h(小 时)，收集上清液，并将上清液pH调至6.0，得到O1群霍乱弧菌O-特异多糖粗 糖。

（2）O1群霍乱弧菌O-特异多糖粗糖的纯化

①第一次超滤：

将O1群霍乱弧菌O-特异多糖粗糖离心收集上清液，上清液采用3KD超 滤膜，用注射用水超滤，得超滤浓缩液1，超滤时所用的注射用水体积为上清液 体积的5倍。

②乙醇分级沉淀：

超滤浓缩液1中加入氯化钙至终浓度为0.4mol/L；加入乙醇至终浓度为 20%（体积分数）；搅拌70min，2～8℃条件下沉淀8小时后，离心收集上清液。

③第二次超滤：

将步骤步骤（2）②乙醇分级沉淀收集的上清液上清液采用3KD超滤膜， 用注射用水超滤得超滤浓缩液2，超滤时所用注射用水体积为上清液的5倍。

④阴离子交换：

超滤浓缩液2中加入Tris-HCl缓冲液至Tris-HCl的终浓度为0.001mol/L 得混合液，混合液的pH为5；将混合液上样于Capto Q阴离子交换柱，用终浓 度为0.001mol/L，pH为5的Tris-HCl缓冲液淋洗阴离子交换柱至紫外吸光值不 再下降；再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液由 Tris-HCl缓冲液和乙酸钠混合而成，洗脱液的pH为5，洗脱液中Tris-HCl缓冲 液的终浓度为0.001mol/L，乙酸钠的终浓度为0.15mol/L。

（3）目标物溶液（即O1群霍乱弧菌O-特异多糖溶液）的浓缩冻干：

将目标物溶液采用10KD超滤膜，用注射用水超滤浓缩后，在-48℃真空干燥 即得纯化的O1群霍乱弧菌O-特异多糖，注射用水的用量为目标物溶液体积的5 倍。

（4）O1群霍乱弧菌O-特异多糖产品的检测：

分别将步骤（1）获得的O1群霍乱弧菌O-特异多糖粗糖（纯化前）与步骤（3） 经纯化获得的O1群霍乱弧菌O-特异多糖进行检测：其中蛋白含量的检测依据《中 国药典》2010版三部（附录ⅥB第二法）进行；核酸含量的检测依据《中国药 典》2010版三部（附录ⅡA）进行；O-乙酰基含量的检测依据《中国药典》2010 版三部（附录ⅥF）进行；内毒素含量的检测依据《中国药典》2010版三部（附 录ⅫE）进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部（附录ⅧC）进行，其 结果见表5.

表5实施例5的纯化前后的O1群霍乱弧菌O-特异多糖检测结果比较

实验及检测结果表明：本发明方法不仅操作方便，制备成本低，处理量大适 于规模化、产业化生产，避免了带来外源因子污染，而且生产获得的产品杂质含 量低、纯度高，符合制备人用疫苗的要求。

实施例6：

（1）铜绿假单胞菌LPS水解为铜绿假单胞菌O-特异多糖粗糖：将铜绿假单 胞菌LPS用注射用水充分溶解至铜绿假单胞菌LPS终浓度为30mg/ml；加入氢氧 化钠至氢氧化钠终浓度为1mol/L，45℃水浴维持1小时，收集上清，并将水解 液pH调至8.0，得到铜绿假单胞菌O-特异多糖粗糖。

（2）铜绿假单胞菌O-特异多糖粗糖的纯化

①第一次超滤：

将铜绿假单胞菌O-特异多糖粗糖离心收集上清液，上清液采用10KD超滤膜， 用注射用水超滤，得超滤浓缩液1，超滤时所用的注射用水体积为上清液的2倍。

②乙醇分级沉淀：

超滤浓缩液1中加入硫酸镁至硫酸镁终浓度为0.2mol/L；加入乙醇至乙醇终 浓度为70%（体积分数）；搅拌60min，2～8℃条件下沉淀12小时后，离心收集 上清液。

③第二次超滤：

将步骤步骤（2）②乙醇分级沉淀收集的上清液上清液采用10KD超滤膜，用 注射用水超滤得超滤浓缩液2，超滤时所用注射用水体积为上清液的2倍。

④阴离子交换：

超滤浓缩液2中加入PB缓冲液至PB的终浓度为0.2mol/L得混合液，混 合液的pH为6.0；将混合液上样于DEAE Sepahrose FF阴离子交换柱，用终浓 度为0.2mol/L，pH为6.0的PB缓冲液淋洗阴离子交换柱至紫外吸光值不再下降； 再用洗脱液洗脱，收集洗脱峰即为目标物溶液，所述的洗脱液由PB缓冲液和磷 酸钠混合而成，洗脱液的pH为6.0，洗脱液中PB缓冲液的终浓度为0.2mol/L， 磷酸钠的终浓度为0.1mol/L。

（3）目标物溶液（即铜绿假单胞菌O-特异多糖溶液）的浓缩冻干：

将目标物溶液采用10KD超滤膜，用注射用水超滤浓缩后，在-48℃真空干燥 即得纯化的铜绿假单胞菌O-特异多糖，注射用水的用量为目标物溶液体积的2 倍；

（4）铜绿假单胞菌O-特异多糖产品的检测：

分别将步骤（1）获得的铜绿假单胞菌O-特异多糖粗糖（纯化前）与步骤（3） 获得的铜绿假单胞菌O-特异多糖（纯化后）进行检测：其中蛋白含量的检测依 据《中国药典》2010版三部（附录ⅥB第二法）进行；核酸含量的检测依据《中 国药典》2010版三部（附录ⅡA）进行；O-乙酰基含量的检测依据《中国药典》 2010版三部（附录ⅥF）进行；内毒素含量的检测依据《中国药典》2010版三 部（附录ⅫE）进行；鉴别试验依据《中国药典》2010版三部（附录ⅧC）进 行，其结果见表6。

表6实施例6的纯化前后的铜绿假单胞菌O-特异多糖检测结果比较

实验及检测结果表明：本发明方法不仅操作方便，制备成本低，处理量大适于 规模化、产业化生产，避免了带来外源因子污染，而且生产获得的产品杂质含量 低、纯度高，符合制备人用疫苗的要求。