一种呼吸道病毒的生物素-亲和素酶联免疫检测方法

摘要

本发明公开了一种呼吸道病毒的生物素-亲和素酶联免疫检测方法，结合生物素-亲和素系统的高度放大作用和抗原-抗体识别的特异性，建立了一种用于检测呼吸道病毒的新的检测方法。该检测方法检测呼吸道病毒抗原的灵敏度高于ELISA，与RT-PCR比较灵敏度略低，但特异性一致，因此该技术方法能满足临床检测呼吸道病毒的要求。该检测方法易于操作，价格低廉，特别适合于呼吸道病毒感染的早期快速诊断。

说明书

技术领域

本发明涉及一种呼吸道病毒的生物素-亲和素酶联免疫检测方法。

背景技术

感染性疾病是由病毒、细菌、真菌、衣原体、支原体、螺旋体和立克次氏体等微生物引起的疾病。全球每年因感染性疾病导致的死亡病例多达1700万人，发展中国家的感染率、发病率和死亡率都明显高于发达国家，其中病毒感染约占40-50%，而且往往形成流行传播。

病毒性感染中主要包括呼吸道病毒感染、胃肠道病毒感染、血液传播病毒感染、性传播病毒感染和虫媒传播的病毒感染；前两者约占病毒性感染的80%。危害人类健康的主要呼吸道病毒包括：流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、肠道病毒、博卡病毒、偏肺病毒、麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、鼻病毒、冠状病毒等。呼吸道病毒主要通过飞沫、空气等介质由呼吸道侵入机体引起疾病，它们传播快、容易形成流行。患者发生急性咽炎、喉炎、气管炎、支气管炎、肺炎、哮喘等及胸膜炎、心肌炎、中耳炎、扁桃体炎等并发症。尤其是老人和婴幼儿以及肾病、心脏病患者等常合并严重的并发症引起死亡。不少病毒性感染，如流感、副流感、鼻病毒等，由于型别较多，病变表浅，感染后免疫力不持久，又无交叉保护免疫，易造成反复感染；妊娠早期妇女受呼吸道病毒感染后，如风疹病毒、巨细胞病毒等，可影响胎儿发育，导致先天畸形、流产等。

呼吸道病毒感染必须及早探明病原体，才能及时进行针对性治疗和预防，阻止病毒的传播，减少病毒给人类社会带来的危害，所以早期、准确的检测，探明病毒的种类致关重要。但目前我国针对病毒性疾病的检验难以满足临床的需要，

目前临床针对呼吸道病毒感染的检测方法有多种，最常见的是通过对特异性抗体的检测来间接证明致病病毒，如：免疫荧光法和酶标免疫法；病毒分离培养鉴定法是传统的检测金标准；而病毒核酸检测技术则是近年发展起来的。不同的技术方法各有其优势，但也存在各自的不足。

⑴病毒培养分离鉴定技术

病毒分离培养是最为经典的方法，它是通过将采集的临床样品接种细胞进行病毒增殖培养，能客观反映所感染病毒的存在及种类，但这种方法费时、费力，结果受人为技术影响很大，因此不能用于疾病的早期快速诊断。

⑵病毒核酸检测技术

核酸检测技术是针对病毒特异性的核酸序列设计引物和探针从而去检测病毒的存在，如：核酸杂交技术、RT-PCR技术等，目前已是常用的一种技术方法，其特异性强、灵敏度高，而且可以对检测目标物进行定量等特点，但对引物序列的准确性要求很高，实验过程也易受到环境污染的影响，因此对实验条件和实验人员的技术水平要求都很高，同时需要昂贵的仪器设备，因此该技术不适合广泛推广。

⑶免疫检测技术

免疫检测技术是目前应用最广泛的一类技术方法，包括：免疫荧光法、酶联免疫法、免疫层析法等，该类技术是采用了抗原抗体结合的基本原理，通过标记不同的指示物来判断实验结果，这些方法各有其技术优势但也存在各自的不足，如：免疫荧光的灵敏度较高，但操作复杂，非特异性明显，很难避免出现假阳性，实验结果的判断主观性也较强；酶联免疫法操作相对简单，实验条件要求较低，但检测病毒时该方法灵敏度不够，目前多用于抗体检测；免疫层析法操作简单，快速更是一大优点，但灵敏度却是免疫检测技术中最低的，特别是在对抗原检测方面很难达到临床要求。

因此能兼顾灵敏度高、特异性强、操作简单的检测方法是临床病毒检测的发展方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种呼吸道病毒的生物素-亲和素酶联免疫检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种呼吸道病毒的生物素-亲和素酶联免疫检测方法，包括以下步骤：

1)        用100μl特异性病毒抗体包被酶标板，37℃放置2小时后，4℃过夜放置，洗板，甩干；

2)        加入200μl含10%小牛血清的PBS缓冲液，37℃湿盒孵育2h，洗板，甩干；

3)        分别加入100μl待检病毒样品，37℃湿盒孵育1～2h，洗板，甩干；

4)        加入100μl生物素标记的二抗，37℃湿盒孵育1～2h，洗板，甩干；

5)        加入100μl亲和素标记的酶，37℃湿盒孵育1～2h，洗板，甩干；

6)        加入100μl显色底物，37℃孵育5～15min进行显色反应，用酶标仪测定OD值；以大于阴性对照值OD值3SD作为阳性结果的阈值。

优选的，步骤1）中所述特异性病毒抗体为纯化的单克隆抗体或多克隆抗体。

优选的，步骤1）中，用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液将特异性病毒抗体稀释至1～10μg/ml浓度后包被酶标板。

优选的，步骤4）中所述生物素标记的病毒抗体为纯化的单克隆抗体或多克隆抗体。。

优选的，洗板所用洗涤液为含0.5mol/L Tween-20的PBS缓冲液。

优选的，步骤5）中所述亲和素标记的酶为辣根过氧化物酶。

优选的，所述显色底物为四甲基联苯胺。

优选的，步骤6）中，显色反应结束后，加入50μl 2mol/L的硫酸溶液，使反应终止。

优选的，在450nm波长下测定OD值。

本发明的有益效果是：

本发明结合生物素-亲和素系统的高度放大作用和抗原-抗体识别的特异性，建立了一种用于检测呼吸道病毒的生物素-亲和素酶联免疫检测方法。该检测方法检测呼吸道病毒抗原的灵敏度高于ELISA，与RT-PCR比较灵敏度略低，但特异性一致，因此该技术方法能满足临床检测呼吸道病毒的要求。该检测方法易于操作，价格低廉，特别适合于呼吸道病毒感染的早期快速诊断。

附图说明

图1为流感病毒生物素-亲和素酶联免疫检测方法与酶联双抗体夹心法检测极限实验对比图。

图2为呼吸道合胞病毒生物素-亲和素酶联免疫检测方法与酶联双抗体夹心法检测极限实验对比图。

具体实施方式

本发明在常规酶联免疫检测方法的基础上，结合生物素与亲和素间的高度信号放大作用，建立了一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，即起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，从而大大提高了检测呼吸道病毒抗原灵敏度的目的。

下面结合实施例，进一步阐述本发明内容。

实施例1

抗流感病毒单克隆抗体的制备：

1） 流感病毒抗原制备及小白鼠免疫

临床分离的甲型流感H1N1亚型病毒株（实验室编号：甲流/H1N1/318）经核酸测序和特异性抗体鉴定，用MDCK细胞扩大培养病毒，再经超速离心机纯化病毒颗粒，混合弗氏完全佐剂，常规方法免疫Balb/c小鼠。

2） 骨髓瘤细胞培养

骨髓瘤SP2/0细胞（购于中国典藏物保存中心），用含有10%胎牛血清的DMED培养液培养，每天更换新鲜培养液使成为对数分裂期生长旺盛的细胞。

3) 细胞融合

取免疫鼠脾脏，分离淋巴细胞，与SP2/0细胞在PEG（分子量2000）的条件下以1:10的比例进行融合，经选择培养液培养后，筛选抗体分泌阳性细胞并对其进行克隆培养，建立细胞株，再对单克隆抗体进行特异性分析和用于酶联实验的抗体配对分析。

3） 将杂交瘤细胞注入用降脂烷致敏的Balb/c小鼠腹腔，5天后抽取腹水，经饱和硫酸氨沉淀，用亲和层析法纯化抗体，测定包被用抗体和标记用抗体的工作浓度。

实施例2

抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体制备：

临床分离的呼吸道合胞病毒株（实验室编号：RSV-3702），经核酸测序和特异性抗体鉴定，用HeLa细胞扩大培养病毒，再经超速离心机纯化病毒颗粒，后续实验方案同实施例1流感病毒单克隆抗体的制备。

实施例3

抗体生物素标记：

1)        将纯化的单克隆抗体用0.1 mol/L的碳酸氢钠缓冲液（pH 8.0）稀释到1mg/ml，用0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液（pH 8.0）透析处理24小时，得到抗体溶液；

2)        用1ml二甲基亚砜（DMSO）溶解NHSB( N-羟基琥珀酰亚胺生物素)1mg，得到NHSB溶液；

3)        将1ml抗体溶液加入120μl NHSB溶液，在室温下持续搅拌2小时，再加入9.6μl 1mol/L的NH₄Cl，在室温下搅拌10分钟；

4)        在4℃下，用PBS缓冲液透析24小时，期间换液一次，再用分子筛柱缓慢洗脱，收集，加入叠氮钠（终浓度0.5g/L）及终浓度为1.0g/L的牛血清白蛋白（BSA），再加入50%甘油，混匀，置-20℃保存。

实施例4

病毒TCID₅₀测定：

(1) 准备细胞

分别将MDCK细胞（用于培养流感病毒）、HELA细胞（用于培养呼吸道合胞病毒）接种至细胞培养板，置二氧化碳培养箱中培养，每个孔的细胞铺成单层大约60％丰度时接种病毒。

(2) 病毒液稀释及接种培养

采用本实验室临床分离鉴定的流感病毒(甲流H1N1亚型-318)和呼吸道合胞病毒（RSV-3702），分别将其连续增毒培养后的病毒悬液按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7进行梯度稀释，每个稀释度接种8孔细胞，在37℃ CO₂培养箱中孵育1h后吸去病毒液，加入200μlDMEM维持液，继续在37℃ CO₂培养箱中培养。每天定时取出培养板在显微镜下观察细胞病变（CPE）。

（3）TCID₅₀计算方法

观察CPE，找出能引起半数细胞感染的病毒稀释倍数，采用Reed-Muench法计算得出病毒的滴度分别为：流感病毒 10^-4。2/0.1ml，呼吸道合胞病毒 10^-4 /0.1ml。

实施例5

（1）流感病毒1个TCID₅₀含量的极限检测：

1)        用100μl特异性病毒抗体（其中含抗流感病毒单克隆抗体1ug/ml）包被酶标板，4℃过夜放置；

2)        洗板后，加入200μl含10%小牛血清的PBS缓冲液，37℃湿盒孵育2h封板，然后洗板；

3)        将实施例4测定1个TCID₅₀的流感病毒样品进行1:180、1:360、1:720、1:1440、1:2880、1:5760、1:11520、1:23040、1:46080、1:92160的梯度倍比稀释，分别加入包被有病毒特异性抗体的酶标板中，每个浓度平行4个孔，每孔100μl，并设阴性、阳性对照，37℃湿盒孵育1h；

4)        洗板后，加入100μl实施例1制备的生物素标记的特异性病毒抗体，37℃湿盒孵育1h；

5)        洗板后，加入100μl亲和素标记的辣根过氧化物酶，37℃湿盒孵育1h；

6)        洗板后，加入100μl四甲基联苯胺（TMB）底物，37℃显色10min，用酶标仪在450nm波长下测定OD值，-/+性临界OD值为0.1。

检测结果如下表和图1所示：

稀释倍数18036072014402880576011520230404608092160OD值2.852.822.792.672.01.420.750.330.190.12

（2）呼吸道合胞病毒1个TCID50含量的极限检测：

检测方法同“流感病毒1个TCID₅₀含量的极限检测”，但病毒稀释倍数为1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200。

检测结果如下表和图2所示：

稀释倍数100200400800160032006400128002560051200OD值3.03.03.02.822.341.300.680.300.140.08

对比例

1、非生物素酶联免疫检测方法（双抗体夹心法）测定流感病毒1个TCID₅₀含量的极限检测

1)        用100μl包被液（其中含有特异性抗流感病毒单克隆抗体1ug/ml）包被酶标板，37度湿盒2小时后4℃过夜放置；

2)        洗板后，加入200μl含10%小牛血清的PBS缓冲液，37℃湿盒孵育2h封板，然后洗板；

3)        将实施例4测定1个TCID₅₀的流感病毒样品进行1:180、1:360、1:720、1:1440、1:2880、1:5760、1:11520、1:23040、1:46080、1:92160的梯度倍比稀释，分别加入包被有病毒特异性抗体的酶标板中，每个浓度平行4个孔，每孔100μl，并设阴性、阳性对照，37℃湿盒孵育1h；

4)        洗板后，加入100μl辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃湿盒孵育1h；

5)        洗板后，加入100μl四甲基联苯胺（TMB）底物，37℃显色10min，用酶标仪在450nm波长下测定OD值，-/+性临界OD值为0.1。

检测结果如下表和图1所示：

稀释倍数18036072014402880576011520230404608092160OD值2.672.251.70.80.410.250.170.09  

2、非生物素酶联免疫检测方法（双抗体夹心法）测定呼吸道合胞病毒1个TCID₅₀含量的极限检测：检测方法同1中“流感病毒1个TCID₅₀含量的极限检测”。

检测结果如下表和图2所示：

稀释倍数100200400800160032006400128002560051200OD值2.712.251.240.510.330.180.06   

实施例4

临床标本检测：

（1）用实施例3的（1）中所述方法对用某品牌流感病毒核酸检测试剂盒（RT-PCR法）检测的临床标本进行检测，结果如下：

100份RT-PCR阳性标本，本方法检测出阳性95份，灵敏度符合率95%；

100份RT-PCR阴性标本，本方法未检测出阳性，特异性符合率100%。

（2）用实施例3的（2）中所述方法对用某品牌呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒（RT-PCR法）检测的临床标本进行检测，结果如下：

100份RT-PCR阳性标本，本方法检测出阳性91份，灵敏度符合率91%；

100份RT-PCR阴性标本，本方法未检测出阳性，特异性符合率100%

综上，可见，生物素酶联检测技术在检测呼吸道病毒抗原时其灵敏度高于双抗体夹心法；与病毒核酸检测试剂盒（RT-PCR）比较灵敏度略低，但特异性一致，因此该技术方法能满足临床检测呼吸道病毒的要求。