谷子抗锈基因共分离的分子标记及其检测方法

摘要

本发明涉及一种谷子抗锈基因共分离的分子标记及其检测方法，用于谷子抗锈资源的利用及抗锈品种的选育，所述分子标记为SNP+InDel/SLAF-75316。本发明成功地将共分离标记SNP+InDel/SLAF-75316应用于辅助选择育种，结合田间接种鉴定方法，将会加速抗锈新品种的选育进程，提高抗锈育种效率、减少农药防治锈病造成的环境污染，同时节约种植成本，具有明显的经济效益、生态效益。

说明书

技术领域

本发明涉及谷子抗锈基因共分离的分子标记及其检测方法，属于分子育种领域，用于谷子抗锈资源的利用及抗锈品种的选育。

背景技术

谷子（Setaria italica (L.) Beauv.）抗旱耐瘠、粮草兼用、营养丰富，分布于亚、欧等地。谷子在中国的种植面积和产量均居世界之首，是北方重要的粮食作物。

谷子锈病是粟单胞锈菌（Uromyces setariae-italicae Yoshino）引起，是谷子生产上的主要病害，一般减产10%～30%，流行年份植株倒伏，颗粒无收，严重影响着谷子的稳产和高产。随着产业化水平的提高、气候变暖等，锈病危害更加严重，已经成为制约谷子产业发展的重要因素之一。防治谷锈病最经济、有效的措施是培育和利用谷子抗锈品种，为此，发掘抗病资源、标记和克隆抗病基因是非常必要的前提。

谷子抗锈资源的鉴定工作开始于20世纪80年代，至今已进行了4次大规模鉴定，每次鉴定出的抗锈资源占总资源的比例仅在0.11%～1.76%，最近一次的最大规模抗锈资源鉴定工作是由本课题组董志平研究员利用谷子强毒性小种从8个国家的16800多份谷子种质资源中鉴定出89份抗源，其中高抗抗源只有9份，仅占总鉴定数的0.056%。可见谷子抗锈资源十分匮乏。为此，寻找抗源、选育谷子抗锈品种成为谷子抗病育种的重要任务。

谷子抗源十里香是上述9份高抗资源之一，分别用混合锈菌和单个生理小种鉴定，它表现出高度抗锈性或免疫性，并且遗传性稳定，是一份十分珍贵的研究材料。目前谷子上仅有一篇本课题组于2010年发表的关于抗锈基因AFLP标记的研究报道，标记与抗锈基因的遗传距离是7.4 cM，不能在生产上进行辅助育种。为此，本研究旨在获得与抗锈基因共分离的分子标记，为分子辅助育种奠定基础，加快利用抗源培育抗锈品种的进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种谷子抗锈基因共分离的分子标记及其检测方法，用于谷子抗锈资源的利用及抗锈品种的选育，所述分子标记为SNP+InDel/SLAF-75316。

本发明所提供的谷子抗锈基因共分离的分子标记SNP+InDel/SLAF-75316是通过以下方法获得的：

1）从谷子种质资源中选育出含有抗锈基因的谷子高抗锈病抗源十里香，将其与高感锈病谷子品种豫谷1号配制正反交杂交组合F₁，对5叶期叶片喷雾接种谷锈菌强毒性小种A₅₇的单孢菌系93-5，鉴定结果为全部抗病，收获正反交F₁后再自交，构建抗锈基因的F₂分离群体，同样方法接种鉴定，抗病单株与感病单株的分离比例符合3:1，说明十里香对强毒性单孢菌系93-5的抗锈性由显性单基因控制；

2）利用简化基因组深度测序技术（“SLAF-seq”技术）在十里香和豫谷1号之间开发了5669个多态性SLAF标记。用这些标记对50个F₂代抗病单株混合DNA和50个F₂代感病单株混合DNA进行了抗锈关联性分析，获得1个抗锈关联区域，物理距离是0.53M，包含4个多态性SLAF标记，如表1所示：

表1：抗锈关联区内4个多态性SLAF标记列表

多态性SLAF标记基因组位置SLAF75240scaffold_8,34233005,34233365,-SLAF75294scaffold_8,34528342,34528670,+SLAF75316scaffold_8,34638806,34639120,+SLAF75322scaffold_8,34684190,34684544,+

3）为了确定表1中筛选到的多态性标记与抗锈基因的连锁关系，将这些标记进一步在270个F₂代感病单株中验证。其具体做法是：首先，利用抗锈关联区域两侧最远的多态性标记（SLAF75240和SLAF75322）在F₂代所有感病单株中测序验证，共筛选到18个交换单株；剩余2个标记仅扫描所有交换单株，其中只有SLAF75316标记在18个交换单株中扩增后均表现亲本豫谷1号的感病基因型，即没有发生交换，说明SLAF75316标记与抗锈基因共分离；

SLAF75240标记的引物核酸碱基序列是：

SLAF75240 F：5’ATTTCATGTCATCGTGTTGCT 3’

SLAF75240 R：5’CGCTTGTATCACTGGATGCA 3’

SLAF75294标记的引物核酸碱基序列是：

SLAF 75294 F：5’CGTTTCAACTCGCTACCTT 3’

SLAF 75294 R：5’CTCAATGGTCTCCAGGAGC 3’

SLAF75316标记的引物核酸碱基序列是：

SLAF75316 F：5’AGTCGAATTACAGCTCAAATG 3’

SLAF75316 R：5’TTACATGATGTGTACTCAAACC 3’

SLAF75322标记的引物核酸碱基序列是：

SLAF75322 F：5’AAGAGAGTGCGGGAGAAAAA 3’

SLAF75322 R：5’TAGCTGGCTCCAGGACTACAA 3’

4）SLAF75316标记的检测方法：先利用CTAB方法提取十里香与豫谷1号的F₂群体中感病单株的基因组DNA，引物对十里香（抗锈）的基因组DNA扩增产物为441bp，而对豫谷1号（感锈）的基因组DNA扩增产物为444bp。通过对上述两个亲本的PCR产物回收、纯化、测序和序列分析（图1），证实SLAF-75316标记在两个亲本中存在两种多态性形式：包括20个SNP位点、3个插入和6个缺失位点，因此将该标记命名为SNP+InDel/SLAF-75316；

5）收集谷锈菌单孢菌系93-5接种鉴定的15份谷子感病材料和1份由十里香育成的抗病材料（冀创1号），用SNP+InDel/SLAF-75316标记引物进行PCR扩增，回收产物并测序，检测的所有感病材料与豫谷1号的基因型完全一致，检测的抗病品种冀创1号与十里香的基因型完全一致，说明该共分离标记可以准确鉴定抗、感基因型。

扩增抗病谷子DNA，能够扩出441bp的扩增片段，而感病谷子扩增出444bp片段，两个片段序列存在多个SNP位点和多个InDel位点。由于该标记是基于与抗锈基因共分离而设计的共显性分子标记，可以进行基因型鉴定，即可以对抗锈基因的纯合基因型和杂合基因型进行鉴别，即杂合基因型中SNP位点在测序峰图中会出现双峰，Indel位点在测序峰图中显示为其后边峰会出现杂峰。

本研究所提供的鉴定抗锈基因的分子标记方法，具有如下优点：

通过本发明的分子标记在国际上首次获得了对谷子进行抗锈基因型鉴别的共显性分子标记。

本发明成功地将共分离标记SNP+InDel/SLAF-75316应用于辅助选择育种，结合田间接种鉴定方法，将会加速抗锈新品种的选育进程，提高抗锈育种效率、减少农药防治锈病造成的环境污染，同时节约种植成本，具有明显的经济效益、生态效益。

附图说明

图1为SNP+InDel/SLAF-75316标记引物对两个亲本十里香和豫谷1号扩增产物测序后的序列比对结果：（P为父本十里香，M为母本豫谷1号，Consensus为父母本的保守序列）。

具体实施方法

下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、一种谷子抗锈基因共分离分子标记SNP+InDel/SLAF-75316的获得

1、供试材料

利用谷子锈病高抗抗源十里香与高感品种豫谷1号，以及其杂种F₁、F₂群体。

2、材料抗锈性鉴定

对亲本十里香和豫谷1号及F₁、F₂单株进行抗性接种鉴定。谷子5叶期时，收集谷子锈菌强毒性小种A₅₇的单孢菌系93-5，制备孢子悬浮液（浓度为1.0×10⁵个/mL）喷雾接种，保湿20 h。12 d后待感病植株明显发病时调查亲本和后代植株发病情况，明确每个植株的反应型。反应型调查标准参考梁克恭等的方法，分为5级：0级（免疫）——全株无症状表现；1级（高抗）——夏孢子堆针尖大小，周围组织有枯死反应。夏孢子堆破裂时，叶片表皮撕裂不明显；2级（中抗）——夏孢子堆较小，周围组织稍有褪绿或褪绿反应不明显。夏孢子堆破裂时叶片表皮撕裂易见；3级（中感）——夏孢子堆中等大小，周围组织褪绿反应明显，夏孢子堆破裂时，叶片表皮撕裂较明显；4级（高感）夏孢子堆较大，早期周围组织褪绿反应不明显，夏孢子堆破裂时叶片表皮撕裂明显。其中0—2级归为抗病，3级和4级归为感病。

3、遗传分析群体

2006年利用谷子锈病高抗抗源十里香，与高感品种豫谷1号配制正反交杂交种F₁，2007年种植F₁并收获F₂种子，2008年种植正交F₁来源的F₂群体1000株，并在5叶期之前取叶片以提取基因组DNA。对5叶期叶片喷雾接种谷锈菌单孢菌系93-5，正反交F₁全部抗病，F₂分离群体中抗病单株与感病单株的分离比例符合3:1，说明十里香对强毒性单孢菌系93-5的抗锈性由显性单基因控制。

4、筛选与谷子抗锈基因共分离的分子标记

利用简化基因组深度测序技术（“SLAF-seq”技术）在十里香和豫谷1号之间开发了5669个多态性SLAF标记。用这些标记对50个F₂代抗病单株混合DNA和50个F₂代感病单株混合DNA进行了抗锈关联性分析，获得1个抗锈关联区域，物理距离是0.53M，包含4个多态性SLAF标记，如表1所示。

表1：抗锈关联区内4个多态性SLAF标记列表

多态性SLAF标记基因组位置SLAF75240scaffold_8,34233005,34233365,-SLAF75294scaffold_8,34528342,34528670,+SLAF75316scaffold_8,34638806,34639120,+SLAF75322scaffold_8,34684190,34684544,+

为了确定表1中筛选到的多态性标记与抗锈基因的连锁关系，将这些标记进一步在270个F₂代感病单株中验证。其具体做法是：首先，利用抗锈关联区域两侧最远的多态性标记（SLAF75240和SLAF75322）在F₂代所有感病单株中测序验证，共筛选到18个交换单株；剩余2个标记仅扫描所有交换单株，其中只有SLAF75316标记在18个交换单株中扩增后均表现亲本豫谷1号的感病基因型，即没有发生交换，说明SLAF75316标记与抗锈基因共分离。

SLAF75240标记的引物核酸碱基序列是：

SLAF75240 F：5’ATTTCATGTCATCGTGTTGCT 3’

SLAF75240 R：5’CGCTTGTATCACTGGATGCA 3’

SLAF75294标记的引物核酸碱基序列是：

SLAF 75294 F：5’CGTTTCAACTCGCTACCTT 3’

SLAF 75294 R：5’CTCAATGGTCTCCAGGAGC 3’

SLAF75316标记的引物核酸碱基序列是：

SLAF75316 F：5’AGTCGAATTACAGCTCAAATG 3’

SLAF75316 R：5’TTACATGATGTGTACTCAAACC 3’

SLAF75322标记的引物核酸碱基序列是：

SLAF75322 F：5’AAGAGAGTGCGGGAGAAAAA 3’

SLAF75322 R：5’TAGCTGGCTCCAGGACTACAA 3’

SLAF75316标记的检测方法：先利用CTAB方法提取十里香与豫谷1号的F₂群体中感病单株的基因组DNA，引物对十里香（抗锈）的基因组DNA扩增产物为441bp，而对豫谷1号（感锈）的基因组DNA扩增产物为444bp。通过对上述两个亲本的PCR产物回收、纯化、测序和序列分析（图1），证实SLAF-75316标记在两个亲本中存在两种多态性形式：包括20个SNP位点、3个插入和6个缺失位点，因此将该标记命名为SNP+InDel/SLAF-75316。

5、确认分子标记SNP+InDel/SLAF-75316基因型与表现型的关系

5.1 、DNA提取

参照Gill等人提供的CTAB法提取谷子叶片基因组DNA，并做适当修改，具体步骤如下：

（1）将1-1.5 g谷子叶片在预冷研钵中用液氮研磨成粉末；

（2）将粉末转移到1.5 mL离心管中，加入CTAB提取缓冲液650μL（事先在65℃水浴），摇动使粉末均匀分散于提取液中；

（3）65℃水浴40 min，其间颠倒混匀样品3-4次；

（4）冷却至室温后，加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1），轻轻混匀，4℃ 12 000 rpm离心15 min；

（5）取上清，转入新1.5 mL离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1），轻轻混匀，4℃ 12 000 rpm离心15 min；

（6）取上清，转入新1.5 mL离心管中，加入等体积（650μL）-20℃预冷的异丙醇，摇匀，-20℃自由沉淀30 min；

（7）4℃ 12000 rpm离心15 min；

（8）弃上清，75%乙醇清洗沉淀1-2次；

（9）弃75%乙醇， DNA沉淀风干后，溶解于200μL TE（1/10），4℃保存备用。

用0.8%的琼脂糖电泳检测DNA样品质量。

5.2、引物设计及PCR反应

在抗锈关联性分析结果中，SLAF75316标记在父本十里香中的序列是：AGTAGGGGGGAAGCAAGCAGAATATTGAGAAATGTGACAT，在母本豫谷1号中的序列是：AGTAGGGGGAAAACAAGTGGAATATTGAGAAATGTGACGT，两者存在4个SNP位点，分子量均是40 bp。为了方便PCR扩增检测，我们利用已知的豫谷1号基因组序列信息，分别选取了该标记上游208 bp和下游196 bp，组成了全长是444 bp的新的SLAF75316标记片段，位于基因组Scaffold_8上34638598～34639041，即SNP+InDel/SLAF-75316标记，根据这段序列我们设计了上下游引物：

SNP+InDel/SLAF-75316 F：AGTCGAATTACAGCTCAAATG

SNP+InDel/SLAF-75316 R：TTACATGATGTGTACTCAAACC

引物合成由上海生工公司完成。将合成的引物用双蒸水稀释为10 μM，-20℃保存备用。

以提取的基因组DNA为模板，按下列反应体系进行PCR。PCR反应体系（20 μL）为：100 ng 基因组DNA模板、400 μM dNTPs、1×PCR buffer、各0.5 μM上下游引物，1.5 U Taq DNA聚合酶，补纯水至20 μL。PCR扩增程序为：95℃，4 min；94℃ 30 sec，56℃ 30 sec，72℃ 30 sec，32个循环；72℃，延伸10 min；10℃，冷却10 min，结束反应。PCR反应在ABI VERITI热循环仪中进行，扩增产物加入指示剂（0.25%溴酚蓝、40%蔗糖水溶液）后用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，凝胶成像系统拍照后保存。

标记电泳后，在长波紫外灯下精确切取待回收片段，置于1.5 mL离心管中。用Agarose Gel DNA Purification kit (TaKaRa)试剂盒回收。回收的PCR纯化产物送北京中科希林生物公司测序。

利用标记SNP+InDel/SLAF-75316引物对“十里香/豫谷1号”F₂群体中的18个交换单株进行PCR扩增-产物回收纯化-测序分析。我们发现标记基因型与表现型完全一致，即所有感病表型的F₂交换单株的SNP+InDel/SLAF-75316基因型都与豫谷1号一致。

该标记与抗锈基因共分离。

实施例2：利用标记对谷子抗感材料的标记基因型分析。

谷子感病材料包括宽九、小香米、品103（统一编号是27389）、品104（27390）、品111（27397）、品143（27429）、品149（27435）、品176（27462）、品206（27609）、品207（27610）、品208（27611）、品211（27614）、品212（27615）、品213（27616）各一份，由中国农科院作物科学研究所国家种质库保存；金谷米由河北农科院谷子研究所育成并保存。

谷子抗病材料包括冀创1号一份，是本课题组以十里香为父本，与其它谷子品种杂交并经过多年选育获得，具有同十里香一样稳定的抗锈特性。

我们利用该标记对上述16份谷子材料进行了SNP+InDel/SLAF-75316标记分析。15份感病材料基因型同感病亲本豫谷1号，1份抗病材料基因型同抗病亲本十里香。

本发明成功地将SNP+InDel/SLAF-75316标记应用于辅助选择育种，加快利用抗源培育抗锈品种的进程。