肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的免疫学测定方法

摘要

本发明的目的是实现特异性地识别肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的抗体或其片段、使用该抗体或其片段免疫学地测定肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质、具有高检测性能的消化器癌的检测和检查法。本发明提供肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的免疫学测定方法，其特征在于，使用特异性地识别构成肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的氨基酸序列的不同肽区域的2种以上的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体或其片段，来测定样品中的肌动蛋白丝切蛋白1或其片段。

说明书

技术领域

本发明涉及肌动蛋白丝切蛋白1(cofilin1)蛋白质的免疫学测定方法、 抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体、消化器癌罹患判定方法和肌动蛋白丝 切蛋白1蛋白质测定用试剂盒。

背景技术

肌动蛋白丝切蛋白1(肌动蛋白丝切蛋白(cofilin)、非肌肉型 (non-muscle isoform)18kDa磷蛋白)蛋白质，是属于ADF/COFILIN家族 的细胞骨架结合性蛋白质。是在哺乳类中高度保守的蛋白质之一，在人和/ 或小鼠、大鼠、黑猩猩、牛、狗等中确定了氨基酸序列，已知这些种间显 示98％以上的同一性。已经明确肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质与细胞的形态 和/或运动性的调节(非专利文献1)、细胞质分裂(非专利文献2)、胞吞作用 (非专利文献3)等各种生命现象有关。进而，还报告了该蛋白质在来源于肺 癌(非专利文献4)、胰腺癌(非专利文献5)、乳癌(非专利文献6)、卵巢癌(非 专利文献7)和/或肝癌(非专利文献8)的癌组织和/或癌细胞中表达高，与癌 的进展密切相关(非专利文献9)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Bugyi B.等、2010年、Annual Review of Biophysics、 第39卷、p.449-470

非专利文献2：kaji N.等、2008年、Journal of Biological Chemistry、 第283卷、p.4983-4992

非专利文献3：Okreglak V.等、2007年、The Journal of CellBiology、 第178卷、p.1251-1264

非专利文献4：Keshamouni VG.等、2006年、Journal of Proteome  Research、第5卷、p.1143-1154

非专利文献5：Sinha P.等、1999年、Electrophoresis、第20卷、 p.2952-2960

非专利文献6：Zhang Y.等、2010年、The Journal of International  Medical Research、第38卷、p.1042-1048

非专利文献7：Martoglio A.等、2000年、Molecular Medicine、第6 卷、p.750-765

非专利文献8：Ding S.等、2004年、Proteomics、第4卷、p.982-994

非专利文献9：Yamaguchi H.等、2007年、Biochemica et Biophysica  Acta、第1773卷、p.642-652

发明内容

发明要解决的课题

本发明者等近年发现肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质在早期胃癌患者的血 液中上升，开发了可以将肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质、其突变体和/或它们 的片段作为对胃癌的早期发现有用的诊断标志物而早期地判定胃癌的罹患 的胃癌检测方法。如果能够定量测定肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质，则可以 期待实现以胃癌为代表的消化器癌的早期发现和有效的临床治疗。

但是，肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的现有的检测法限于使用蛋白质印 迹法等的低灵敏度且非定量的免疫学测定法，面向临床应用的新的测定方 法的开发作为课题遗留下来。

因此，本发明的目的在于提供高灵敏度且定量地检测肌动蛋白丝切蛋 白1蛋白质的免疫学测定方法。

用于解决课题的方法

为了解决上述课题而进行了深入研究，结果本发明者们发现，通过将 分别特异性地识别并结合存在于构成肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的氨基酸 序列上的不同特定的肽区域上的表位的2种以上的单克隆抗体进行组合， 对肌动蛋白丝切蛋白1和/或其片段进行免疫学测定，从而可以高灵敏度且 定量地进行检测。本发明是基于上述见解而完成的，即提供以下(1)～(21)。

(1)抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体或其片段，特异性地识别存在 于以下任一肽区域的表位，

a)包含序列号1所示的氨基酸序列中的至少序列号5所示的氨基酸序 列的肽区域，

b)在所述a)的肽区域的氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或几个 氨基酸的肽区域，

c)与所述a)的肽区域的氨基酸序列具有90％以上的同一性的肽区域。

(2)根据(1)所述的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体或其片段，其中， 在轻链中，

CDR1包含序列号8所示的序列，

CDR2包含序列号9所示的序列，和

CDR3包含序列号10所示的序列，以及

在重链中，

CDR1包含序列号11所示的序列，

CDR2包含序列号12所示的序列，和

CDR3包含序列号13所示的序列。

(3)根据(1)所述的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体或其片段，其中， 在轻链中，

CDR1包含序列号14所示的序列，

CDR2包含序列号15所示的序列，和

CDR3包含序列号16所示的序列，以及

在重链中，

CDR1包含序列号17所示的序列，

CDR2包含序列号18所示的序列，和

CDR3包含序列号19所示的序列。

(4)抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体或其片段，特异性地识别存在 于以下任一肽区域的表位，

a)包含序列号1所示的氨基酸序列中的至少序列号6所示的氨基酸序 列的肽区域，

b)在所述a)的肽区域的氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或几个 氨基酸的肽区域，

c)与所述a)的肽区域的氨基酸序列具有90％以上的同源性的肽区域。

(5)根据(4)所述的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体或其片段，其中， 在轻链中，

CDR1包含序列号20所示的序列，

CDR2包含序列号21所示的序列，和

CDR3包含序列号22所示的序列，以及

在重链中，

CDR1包含序列号23所示的序列，

CDR2包含序列号24所示的序列，和

CDR3包含序列号25所示的序列。

(6)抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体或其片段，特异性地识别存在 于以下任一肽区域的表位，

a)包含序列号2所示的氨基酸序列中的至少序列号7所示的氨基酸序 列的肽区域，

b)在所述a)的肽区域的氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或几个 氨基酸的肽区域，

c)与所述a)的肽区域的氨基酸序列具有90％以上的同源性的肽区域。

(7)根据(6)所述的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体或其片段，其中， 在轻链中，

CDR1包含序列号26所示的序列，

CDR2包含序列号27所示的序列，和

CDR3包含序列号28所示的序列，以及

在重链中，

CDR1包含序列号29所示的序列，

CDR2包含序列号30所示的序列，和

CDR3包含序列号31所示的序列。

(8)肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的免疫学测定方法，其中，使用分别 特异性地识别肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的氨基酸序列上的不同表位的2 种以上的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体和/或其片段，来测定样品中的 肌动蛋白丝切蛋白1和/或其片段。

(9)根据(8)所述的测定方法，其中，所述不同表位存在于包含序列号 1和/或2所示的氨基酸序列的肽区域。

(10)根据(9)所述的测定方法，其中，所述不同表位存在于

包含含有序列号1所示的氨基酸序列的肽区域中的至少序列号3所示 的氨基酸序列的肽区域、和/或

包含含有序列号2所示的氨基酸序列的肽区域中的至少序列号4所示 的氨基酸序列的肽区域。

(11)根据(9)所述的测定方法，其中，所述不同表位存在于

包含含有序列号1所示的氨基酸序列的肽区域中的至少序列号5和/ 或6所示的氨基酸序列的肽区域、和/或

包含含有序列号2所示的氨基酸序列的肽区域中的至少序列号7所示 的氨基酸序列的肽区域。

(12)根据(8)所述的测定方法，其中，所述不同表位分别存在于选自包 含序列号5～7所示的氨基酸序列的肽区域中的2个肽区域。

(13)根据(9)所述的测定方法，其中，所述不同表位存在于包含含有序 列号1和/或2所示的氨基酸序列的肽区域中连续的6个～21个氨基酸的肽 区域。

(14)根据(8)所述的测定方法，其中，所述2种以上的抗肌动蛋白丝切 蛋白1单克隆抗体和/或其片段选自(2)、(3)、(5)和(7)所记载的抗肌动蛋白 丝切蛋白1单克隆抗体或其片段。

(15)根据(14)所述的测定方法，其中，2种抗肌动蛋白丝切蛋白1单 克隆抗体和/或其片段是以下任一抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体和/或 其片段的组合，

a)权利要求2和5分别记载的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体和/ 或其片段的组合，

b)权利要求2和7分别记载的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体和/ 或其片段的组合，

c)权利要求3和5分别记载的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体和/ 或其片段的组合，

d)权利要求5和7分别记载的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体和/ 或其片段的组合。

(16)根据(8)～(15)的任一项所述的测定方法，其中，所述样品是血液、 尿、细胞上清、细胞提取液、组织提取液、胃液、唾液、淋巴液、泪液或 精液。

(17)消化器癌罹患判定方法，包括以下步骤：

使用(8)～(16)的任一项所述的测定方法来测定来源于受试体和健常体 的样品中的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质和/或其片段的量的步骤，

将上述测定步骤中测定的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质和/或其片段的 量进行比较，在受试体的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质和/或其片段的量与健 常者的该量相比统计学上有意义地多的情况下，判定为受试体罹患消化器 癌的判定步骤。

(18)根据(17)所述的判定方法，其中，所述消化器癌是早期消化器癌。

(19)根据(17)或(18)所述的判定方法，其中，所述消化器癌是胃癌。

(20)肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的测定用试剂盒，包含分别特异性地 识别肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的不同表位的2种以上的抗肌动蛋白丝切 蛋白1单克隆抗体和/或其片段。

(21)根据(20)所述的试剂盒，包含2种以上的(1)～(7)的任一项所述的 抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体或其片段。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2010-274879 号的说明书和/或附图所记载的内容。

发明的效果

根据本发明的免疫学测定方法，与现有的方法相比，可以定量且高灵 敏度地检测样品中的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质。另外，可以通过简易的 实验操作简便地完成测定。

进而，根据本发明的消化器癌罹患判定方法，可以通过测定血液等受 试体样品中所含的肌动蛋白丝切蛋白1的量，来早期地判定是否罹患消化 器癌。

附图说明

图1显示在表位分析中使用的缺失突变体的一级结构以及各肽区域及 其氨基酸序列号。

图2显示表达人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的细胞株样品的蛋白质印 迹图。+表示导入了pCMV-Myc_人肌动蛋白丝切蛋白1的HEK293细胞， -表示仅导入了pCMV-Myc载体的HEK293细胞。

图3：A～E显示通过使用了2种不同的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆 抗体的夹心ELISA来检测肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的检测灵敏度。

图4：肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质测定用夹心ELISA的检测灵敏度的 评价。B是将A中的虚线圆部分放大而得的图。在B中，箭头所示的值成 为ELISA法的最小检测限值。

图5是通过夹心ELISA来检测胃癌患者和健常者的血浆中的肌动蛋 白丝切蛋白1蛋白质而得的图。

图6是通过夹心ELISA来检测胃癌患者和健常者的血清中的肌动蛋 白丝切蛋白1蛋白质而得的图。

具体实施方式

1.抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体及其片段

本发明的第1实施方式是抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体及其片 段。

1-1.抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体

“肌动蛋白丝切蛋白1”包含：包含GenBank登录NP_005498.1所记 载的氨基酸序列的人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质或其天然突变体，或者像 包含GenBank登录NP_058843所记载的氨基酸序列的大鼠肌动蛋白丝切 蛋白1蛋白质、包含GenBank登录NP_031713.1所记载的氨基酸序列的 小鼠肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质、包含GenBank登录NP_001170183.1所 记载的氨基酸序列的黑猩猩肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质、包含GenBank 登录NP_001015655所记载的氨基酸序列的牛肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质、 或包含GenBank登录NP_533231.1所记载的氨基酸序列的狗肌动蛋白丝 切蛋白1蛋白质那样与人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质显示95％以上的同源 性的哺乳动物中的直系同源物或它们的天然突变体。

这里所说的“天然突变体”是指自然界中存在的突变体，例如，在上 述氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或数个氨基酸的突变体，与上述 氨基酸序列具有90％以上、92％以上或94％以上、优选95％以上、更优 选约97％以上、进一步优选约99％以上的同一性的突变体。“同一性”是 指以二个氨基酸序列不形成最大的一致度的方式导入或不导入间隙而将其 排列(比对)时，相对于一个氨基酸序列的所有氨基酸残基数(也包含间隙数) 的另一个氨基酸序列的同一氨基酸残基数的比例(％)。“数个”是指2～10 的整数，例如，2～7、2～5、2～4、2～3的整数。作为天然突变体的具体 例，可列举基于SNP(单碱基多态性)等多态性的突变体和/或剪接突变体等。 所述替换优选为保守的氨基酸替换。这是因为，如果是保守的氨基酸替换， 则可以具有与具有上述氨基酸序列的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质实质上等 同的结构或性质。所谓保守的氨基酸，已知彼此为非极性氨基酸(甘氨酸、 丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、色氨 酸)和极性氨基酸(除非极性氨基酸以外的氨基酸)、带电氨基酸(酸性氨基酸 (天冬氨酸、谷氨酸)和碱性氨基酸(精氨酸、组氨酸、赖氨酸))和非带电氨 基酸(除带电氨基酸以外的氨基酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸、酪 氨酸)、支链状氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、以及脂肪族氨基酸(甘 氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)等。

本说明书中使用的“单克隆抗体”，是指单一的免疫球蛋白，或包含 其框架区(Frame work region：以下记为“FR”)和互补确定区 (Complementarity determining region：以下记为“CDR”)、能够特异性 地识别并结合特定的抗原的多肽。因此，本发明的“抗肌动蛋白丝切蛋白 1单克隆抗体”是指能够特异性地识别并结合肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质 的多肽。“特异性地识别并结合”是指，交差反应性没有或极弱、对除目 标抗原以外的抗原既不识别也不结合，或者基本既不识别也不结合。

典型的免疫球蛋白分子是作为被称为重链和轻链的2条多肽链的组通 过二硫键2组彼此连接而成的四聚体而构成。重链包含N末端侧的重链可 变区(H链V区：以下记为“VH”)和C末端侧的重链恒定区(H链C区域： 以下记为“CH”)，轻链包含N末端侧的轻链可变区(L链V区：以下记为 “VL”)和C末端侧的轻链恒定区(L链C区域：以下记为“CL”)。其中， VH和VL在抗体的结合特异性相关的方面特别重要。该VH和VL均包含 约110个氨基酸残基，其内部具有和与抗原的结合特异性直接相关的3个 CDR(CDR1、CDR2、CDR3)、和作为可变区的骨架结构发挥功能的4个 FR(FR1、FR2、FR3、FR4)。已知CDR形成与抗原分子互补的立体结构， 决定抗体的特异性(E.A.Kabat et al、1991、Sequences of proteins of  immunological interest、Vol.1、eds.5、NIH publication)。与恒定区的氨基酸 序列在种内抗体间基本一定相对，CDR的氨基酸序列在各抗体间变异性 高，因此也称为高变区(Hyper variable region)。在可变区，所述CDR和 FR从氨基酸末端侧向羧基末端侧方向以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、 CDR3、FR4的顺序排列。在免疫球蛋白分子内，VL和VH通过相对地形 成二聚体而形成抗原结合部位。免疫球蛋白已知IgG、IgM、IgA、IgE、 和IgD的各类别，本发明的抗体可以是任一类别。优选是IgG。

本发明的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体的特征在于，特异性地识 别存在于以下(1)～(4)的肽区域的表位：(1)包含序列号1所示的氨基酸序列 中的至少序列号5或6所示的氨基酸序列的肽区域，(2)包含序列号2所示 的氨基酸序列中的至少序列号7所示的氨基酸序列的肽区域，(3)在上述(1) 或(2)的肽区域的氨基酸序列中缺失、替换或添加了1个或几个氨基酸的肽 区域，或(4)与上述(1)或(2)的肽区域的氨基酸序列具有90％以上的同一性 的肽区域。

序列号1所示的氨基酸序列是人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的C末端 侧肽区域(在图1中为M区域的C末端侧5个氨基酸和C1～C3区域)的氨 基酸序列，当以起始蛋氨酸为1位时，相当于122位～166位。序列号5 所示的氨基酸序列是图1中C1区域的氨基酸序列，相当于人肌动蛋白丝 切蛋白1蛋白质的158位～166位。序列号6所示的氨基酸序列是图1中 C3区域的氨基酸序列，相当于人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的127位～146 位。序列号5或6所示的氨基酸序列的肽区域中，存在在制作高灵敏度的 抗肌动蛋白丝切蛋白1抗体方面有效的表位。

作为识别存在于序列号5所示的C1区域中的表位的抗肌动蛋白丝切 蛋白1单克隆抗体的具体例，可列举例如，在后述的实施例3所记载的表 1中用抗体克隆名1E2和2C4表示的抗体克隆等。1E2克隆中，轻链中的 CDR1包含序列号8所示的序列，CDR2包含序列号9所示的序列，而且 CDR3包含序列号10所示的序列，并且重链中的CDR1包含序列号11所 示的序列，CDR2包含序列号12所示的序列，而且CDR3包含序列号13 所示的序列。另外，2C4克隆中，轻链中的CDR1包含序列号14所示的 序列，CDR2包含序列号15所示的序列，而且CDR3包含序列号16所示 的序列，并且重链中的CDR1包含序列号17所示的序列，CDR2包含序列 号18所示的序列，而且CDR3包含序列号19所示的序列。

作为识别存在于序列号6所示的C3区域中的表位的抗肌动蛋白丝切 蛋白1单克隆抗体的具体例，可列举例如，在表1中用抗体克隆名4E12 表示的抗体克隆。4E12克隆中，轻链中的CDR1包含序列号20所示的序 列，CDR2包含序列号21所示的序列，而且CDR3包含序列号22所示的 序列，并且重链中的CDR1包含序列号23所示的序列，CDR2包含序列号 24所示的序列，而且CDR3包含序列号25所示的序列。此外，由于C3 区域仅由9个氨基酸构成，因而C3区域构成表位本身的可能性高。另外， 序列号2所示的氨基酸序列是人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的N末端侧肽 区域(在图1为N1和N2区域以及M区域的N末端侧5个氨基酸)的氨基 酸序列，当以起始蛋氨酸为1位时，相当于1位～54位。序列号7所示的 氨基酸序列是图1中的N2区域的氨基酸序列，相当于人肌动蛋白丝切蛋 白1蛋白质的29位～49位的序列。序列号7所示的氨基酸序列的肽区域 中，存在在制作高灵敏度的抗人肌动蛋白丝切蛋白1抗体方面有效的表位。

作为识别序列号7所示的N2区域的表位的抗肌动蛋白丝切蛋白1单 克隆抗体的具体例，可列举例如，在表1中用抗体克隆名4F12表示的抗 体克隆。4F12克隆中，轻链中的CDR1包含序列号26所示的序列，CDR2 包含序列号27所示的序列，而且CDR3包含序列号28所示的序列，并且 重链中的CDR1包含序列号29所示的序列，CDR2包含序列号30所示的 序列，而且CDR3包含序列号31所示的序列。

在本发明中有用的抗体可以来源于包含鸟和哺乳动物的所有动物源。 可列举例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊、驴、绵羊、骆驼、马、鸡、 或人等。通常优选使用小鼠、大鼠、兔的抗体。

进而，在本发明中，“抗体”可以是多特异性抗体。多特异性抗体是 指在多价抗体，即在一分子内具有多个抗原结合部位的抗体中，各个抗原 结合部位与不同表位结合的抗体。可列举例如，在像IgG这样具有2个抗 原结合部位的抗体中，各个抗原结合部位与不同表位结合的双特异性抗体 (Bispecific antibody)。在本发明中，该多特异性抗体优选各个抗原结合部 位可以与存在于肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质上的不同表位结合。这些抗体 可以使用重组DNA技术通过公知方法人工地改变IgG等来获得。

1-2.抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体的片段

在本说明书中使用的情况下，“单克隆抗体或其片段”中的“其片段” 是所述单克隆抗体的部分片段，是指具有与该抗体所具有的抗原特异的结 合活性实质上等同的活性的多肽链或其复合体。例如，对应于包含至少一 种上述的抗原结合部位的抗体部分、即具有至少1组的VL和VH的多肽 链或其复合体。作为具体例，可列举通过将免疫球蛋白用各种肽酶切割而 生成的大量被充分赋予了特征的抗体片段等。作为更具体的例子，可列举 Fab、F(ab’)2、Fab’等。Fab是IgG分子被木瓜蛋白酶在铰链区的二硫键 的N末端侧切割而生成的片段，由包含VH和构成CH的3个结构域(CH1、 CH2、CH3)中与VH相邻的CH1的多肽、以及轻链构成。F(ab’)2是IgG 分子被胃蛋白酶在铰链区的二硫键的C末端侧切割而生成的Fab’的二聚 体。Fab’与Fab相比，H链长了一些，长了相当于包含铰链区部分，但实 质上具有与Fab等同的结构。Fundamental Immunology、Paul ed.、3d ed.、 1993。Fab’可以通过将F(ab’)2在温和条件下还原，切割铰链区的二硫键 而获得。这些抗体片段均包含抗原结合部位，具有与抗原(即在本发明中为 肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质或其片段)特异性地结合的能力。

本发明的单克隆抗体的片段可以是化学合成或使用重组DNA法来合 成的。可列举例如，使用重组DNA法而新合成的抗体片段。具体不限定， 对应于将本发明的单克隆抗体的一个以上的VL和一个以上的VH介由具 有适当的长度和序列的接头(linker)肽等人工地连接而得的单聚体多肽分 子、或其多聚体多肽。作为这样的多肽的例子，可列举单链Fv(scFv：single  chain Fragment of variable region(可变区的单链片段))(参照Pierce  catalog and Handbook、1994-1995、Pierce Chemical co.、Rockford、IL)、双 价抗体(diabody)、三价抗体(triabody)或四价抗体(tetrabody)等合成抗体 等。在免疫球蛋白分子中，VL和VH通常位于各自的多肽链(L链和H链) 上。单链Fv是将这些可变区通过充分的长度的柔软性接头连接，具有1 条多肽链中包含VL和VH的结构的合成抗体片段。在单链Fv内，两可变 区可以彼此自组装而形成1个功能性的抗原结合部位。单链Fv可以通过 将编码该单链Fv的重组DNA使用公知技术插入噬菌体基因组使其表达而 获得。双价抗体是具有以单链Fv的二聚体结构为基础的结构的分子 (Holliger et al、1993、Proc.Natl.Acad.Sci USA、90：6444-6448)。例如，在所 述接头的长度短于约12氨基酸残基的情况下，单链Fv内的2个可变部位 不能自组装，但通过形成双价抗体，即通过使2个单链Fv彼此作用，从 而一个Fv链的VL可以与另一个Fv链的VH组装，从而可以形成2个功 能性的抗原结合部位(Marvin et al、2005、Acta Pharmacol.Sin.、26： 649-658)。进而，通过在单链Fv的C末端侧添加半胱氨酸残基，2条Fv 链可以彼此形成二硫键，从而也可以形成稳定的双价抗体(Alafsen et al、 2004、Prot.Engr.Des.Sel.、17：21-27)。这样，双价抗体是二价的抗体片段， 但各个抗原结合部位不需要与同一表位结合，也可以具有识别、特异性地 结合各自不同的表位的双特异性。三价抗体和四价抗体与双价抗体同样地 具有以单链Fv结构为基础的单链Fv的三聚体和四聚体结构。分别为三价 和四价的抗体片段，可以是多特异性抗体。进而，本发明的抗体片段包含 使用噬菌体展示文库鉴定、且具有抗原结合能力的抗体片段(例如，参照 McCafferty et al.、1990、Nature、Vol.348、522-554)。此外，还可以参照例如， Kuby、J.、Immunology、3rd Ed.、1998、W.H.Freeman&Co.、New York。

1-3.抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体及其片段的其他特征

本发明的抗体或其片段可以进行修饰。这里所说的修饰，包含在本发 明的抗体或其片段具有与肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的特异的结合活性方 面所必要的功能上的修饰(例如，糖基化)、和在检测本发明的抗体或其片 段方面所必要的标记的任一种。所述抗体标记可列举例如，利用荧光色素 (FITC、罗丹明、德克萨斯红、Cy3、Cy5)、荧光蛋白质(例如，PE、APC、 GFP)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶)、或生物 素或(链霉亲和素)的标记。另外，本发明的抗体的糖基化可以为了调整抗 体对目标抗原的亲和性而改变。这样的改变例如可以通过改变抗体序列内 的一个以上的糖基化部位来实现。如果更具体地说明，则例如，可以通过 在构成FR内的一个以上的糖基化部位的氨基酸序列中导入一个以上的氨 基酸替换来除去该糖基化部位，从而使该部位的糖基化丧失。这样的去糖 基化在增加抗体对抗原的亲和性方面是有效的(美国专利第5714350号、和 美国专利第6350861号)。

本发明中使用的单克隆抗体或其片段，为了确认对肌动蛋白丝切蛋白 1蛋白质或其片段的特异性，优选在使用前预先验证与其他抗原(蛋白质或 其片段)的交差反应性。在本发明的抗体或其片段中，应确认交差性的抗原 可列举属于ADF/COFILIN家族的蛋白质、特别是与肌动蛋白丝切蛋白1 蛋白质结构类似的肌动蛋白丝切蛋白2(cofilin2)蛋白质。另外，除了上述蛋 白质以外，更优选对于部分结构与肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质相同的其他 蛋白质也预先确认本发明中使用的抗体或其片段的交差反应性。交差反应 的确认可以使用以肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质作为抗原的ELISA法。只要 在应试验反应特异性的抗体、即抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体及其片 段与肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的反应中，使应确认交差性的其他抗原蛋 白质共存，就可以通过观察两者的竞争状态来进行交差性的确认。利用了 竞争抑制的原理这样的交差性的确认方法不需要对所有抗原调制反应体 系，因此可以迅速地进行筛选。

1-4.抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体和杂交瘤制作方法

本发明的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体或产生该抗体的杂交瘤可 以通过以下所记载的方法来制作。但是，不限于本方法，还可以通过本领 域公知的其他所有方法来制作。

1-4-1.抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体制作方法

为了制作与存在于包含构成肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的氨基酸序列 中的序列号1～7所示的任一氨基酸序列的肽区域中的表位特异性地结合 的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体，有如下方法：以肌动蛋白丝切蛋白 1蛋白质的全长作为免疫原制作单克隆抗体，然后，筛选与包含序列号1～ 7所示的任一氨基酸序列的肽区域特异性地结合的抗体的方法，以及预先 以包含序列号1～7所示的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的片段的肽作为免疫 原制作单克隆抗体的方法。

(1)肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的调制

作为免疫原(抗原)使用的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质例如可以通过以 下方法调制。

肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质可以是天然型、重组型、或像肽合成那样 化学合成氨基酸序列的全部或一部分而得的合成肌动蛋白丝切蛋白1蛋白 质的任一种。天然型肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质，可以使用公知的蛋白质 分离·纯化技术，例如凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱，从以血液或 尿那样的体液为代表的样品、或培养细胞的培养上清中回收。重组型肌动 蛋白丝切蛋白1蛋白质可以在导入了编码该蛋白质的DNA的微生物、昆 虫细胞、或动物细胞中表达之后，使用公知的蛋白质分离·纯化技术从该 细胞回收。合成肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质，例如可以利用公开的肌动蛋 白丝切蛋白1蛋白质氨基酸序列信息，通过本技术领域公知的方法、例如 固相肽合成法等来合成。该合成肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质可以与KLH(钥 孔虫戚血蓝蛋白)、OVA(乳清白蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)等载体蛋白质 连接。

即使在以序列号1～7所示的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的片段作为 免疫原的情况下，也可以使用天然型肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段、重 组型肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段、或合成肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质 片段的任一种。作为肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段，可以使用包含在序 列号1～7所示的序列中6个以上、7个以上、8个以上、9个以上、10个 以上、11个以上、12个以上、13个以上、14个以上、15个以上、16个以 上、17个以上、18个以上、19个以上、20个以上、21个以上、22个以上、 或23个以上的连续的氨基酸残基的寡肽或多肽作为抗原。

在使用天然型肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的片段作为免疫原的情况 下，例如，可以将纯化的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质用胰蛋白酶等适当的 蛋白酶处理后，用反向柱对峰进行分离分级，用质谱仪确定各峰所含的肽 的氨基酸序列，使用作为序列号1～7所示的部分序列或其一部分的峰作为 免疫原。

在使用重组型肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的氨基酸部分序列作为免疫 原的情况下，可以将编码上述的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的DNA序列 中的编码序列号1～7所示的氨基酸部分序列或其一部分的DNA序列部 分，与制作全长肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质时同样地插入表达用载体中， 并导入各种细胞，从而可以得到序列号1～7所示的氨基酸部分序列、或其 一部分重组型肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质。

以下，对于序列号1～7所示的重组型肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片 段(以下，称为肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段)的调制进行详述。

(a)编码重组型肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段的多核苷酸的调制

作为在肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段的表达中使用的载体，可以使 用能够在宿主微生物中自主地增殖的噬菌体或质粒。例如，作为质粒，可 列举来源于大肠菌的质粒(pET30a、pGEX6p、pUC118、pUC119、pUC18、 pUC19等)、来源于枯草菌的质粒(pUB110、pTP5等)、来源于酵母的质粒 (YEp13、YEp24、YCp50等)。另外，作为噬菌体，可列举λ噬菌体(λgt11、 λZAP等)。进而，还可以使用牛痘病毒等动物病毒、杆状病毒等昆虫病毒 载体。

为了在上述载体中插入编码肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段的多核苷 酸，例如有：将纯化的该多核苷酸用适当的限制性酶切割，使用DNA连 接酶等连接到用适当的限制性酶切割后的载体内部的方法。

(b)肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段表达载体向宿主内的导入

将所得的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段表达载体导入到能够表达该 表达载体的宿主中，得到肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段表达转化体。关 于使用的宿主，只要是适合所使用的载体、并能够表达肌动蛋白丝切蛋白 1蛋白质的宿主就不特别限定。优选使用例如，细菌(大肠菌(例如，大肠杆 菌：Escherichia coli)、枯草菌(例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等)、 酵母、昆虫细胞、动物细胞(COS细胞、CHO细胞(Journal of immunology 、1998、Vol.160、3393-3402)等。向细菌导入上述载体的导入方法只要是将该 载体导入细菌的公知的方法就不特别限定。可列举例如，热休克法、使用 钙离子的方法、电穿孔法等。这些技术均在本领域是公知的，在各种文献 中记载。例如，请参照Sambrook、J.et.al、1989、Molecular Cloning：A Laboratory Manual Second Ed.(分子克隆实验指南第二版)、Cold Spring  Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York。另外，动物细 胞的转化优选使用脂质体法(PNAS、1989、Vol.86、6077)、(PNAS、1987、 Vol.84、7413)、电穿孔法、磷酸钙法(Virology、1973、Vol.52、456-467)、 DEAE-葡聚糖法等。

在以细菌为宿主的情况下，肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段表达载体 优选能在该细菌中自主复制的同时，由启动子序列、核糖体结合序列、编 码肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段的DNA序列、转录终止序列构成。另 外，可以包含编码控制启动子的调节因子的基因。启动子只要能在大肠杆 菌等宿主中发挥功能就可以使用任一种。

在以酵母、动物细胞、昆虫细胞等真核细胞为宿主的情况下，同样可 以按照本技术领域公知的方法得到肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段表达转 化体。在真核细胞中使用的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段表达载体中， 除了启动子序列、编码肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段的DNA序列以外， 还可以根据需要连接增强子等顺式元件、剪接信号(供体部位、受体部位、 分支点等)、多聚A添加信号、选择标志物序列、核糖体结合序列(SD序列) 等。

(c)转化体的培养和重组型肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段的表达

接着，培养上述制作的转化体。将转化体在培养基中培养的方法按照 在宿主的培养中使用的通常的方法进行。例如，在以细菌为宿主的情况下， 培养基只要含有细菌能够同化的碳源、氮源、无机盐类等，且细菌能够生 长、增殖就不特别限定。可以使用天然培养基、合成培养基的任一种。作 为更具体的例子，可列举LB培养基，但当然不限于此。另外，为了选择 性地进行转化体的培养，根据需要可以将氨苄青霉素和/或四环素等抗生素 添加到培养基中。培养通常在通气搅拌培养等需氧条件下、在37℃进行6～ 24小时。培养期间，pH值优选保持在中性附近。pH值的调整使用无机或 有机酸、碱溶液等进行。在转化体是CHO细胞等动物细胞的情况下，在 Gibco社制DMEM培养基中以1×10⁵细胞/mL接种宿主细胞，在37℃的5 ％CO₂培养箱中培养即可。培养中可以根据需要在培养基中添加氨苄青霉 素和/或四环素等抗生素。

在所述肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段表达载体是包含蛋白质表达控 制系统(例如，在宿主是细菌的情况下，对应于阻遏物基因和操纵基因等) 的蛋白质表达诱导型载体的情况下，需要对所述转化体进行规定的处理， 从而诱导肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段的表达。表达诱导的方法根据载 体所含的蛋白质表达控制系统不同而不同，因而进行适合该系统的诱导处 理即可。例如，在以细菌为宿主的蛋白质表达诱导型载体中，最一般利用 的蛋白质表达控制系统是包含lac阻遏物基因和lac操纵基因的系统。本系 统可以通过IPTG(异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷)处理来诱导表达。为了在 具有包含该系统的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质表达载体的转化体中表达目 的的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质，在培养基中添加适当量(例如，终浓度 1mM)的IPTG即可。

(d)重组型肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段的提取和/或回收

培养后，肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段在菌体内或细胞内生产的情 况下，可以通过将菌体或细胞回收并破碎来提取蛋白质。另外，在肌动蛋 白丝切蛋白1蛋白质片段在菌体外或细胞外生产的情况下，直接使用培养 液，或者通过离心分离等除去菌体或细胞，使用上清即可。然后，可以通 过将一般的蛋白质的纯化方法、例如硫酸铵沉淀、凝胶色谱、离子交换色 谱、亲和色谱等单独或适宜组合使用，从而从所述培养物中分离纯化肌动 蛋白丝切蛋白1蛋白质。是否得到了肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段，通 过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等来确认即可。

(2)抗肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段抗体的产生细胞的制作

将上述(1)所得的作为免疫原的重组型肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片 段溶解在缓冲液中而调制免疫原溶液。此时，为了有效地进行免疫，根据 需要也可以添加佐剂。作为佐剂的例子，可列举市售的弗氏完全佐剂 (FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)等，这些可以单独或混合使用。

接下来，将上述调制的免疫原溶液施与哺乳动物、例如大鼠、小鼠(例 如近交系小鼠BALB/c)、兔等，进行免疫。作为免疫原的施与方法，可列 举例如，使用FIA或FCA的皮下注射、使用FIA的腹腔内注射、或使用 0.15mol/L氯化钠的静脉注射，但不限于此。免疫原的1次的施与量根据免 疫动物的种类、施与途径等适宜确定，每1只动物约50～200μg。另外， 对免疫的间隔不特别限定，在初次免疫后，以数日～数周的间隔、优选以 1～4周的间隔进行2～6次、优选3～4次补加免疫。初次免疫之后，通过 ELISA(酶联免疫吸附分析，Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)法等 来测定免疫动物的血清中的抗体价，如果抗体价达到峰值平台(Plateau)， 则将免疫原注射到静脉内或腹腔内，作为最终免疫。然后，最终免疫那天 起2～5天后、优选3天后，采取抗体产生细胞。

1-4-2.产生抗肌动蛋白丝切蛋白1部分序列单克隆抗体的杂交瘤的制 作方法

(1)由免疫动物的抗体产生细胞的回收和细胞融合

通过进行由免疫动物得到的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合 来制作生产特异性地识别肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的部分序列的单克隆 抗体的杂交瘤。作为抗体产生细胞，可列举脾脏细胞、淋巴结细胞、末梢 血细胞等，优选为脾脏细胞或局部淋巴结细胞。作为与抗体产生细胞融合 的骨髓瘤细胞，可以使用一般能买到的来源于小鼠等的株化细胞。作为使 用的细胞株，优选为具有药剂选择性，且具有在未融合的状态下不能在 HAT选择培养基(包含次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶)中生存、仅在与抗 体产生细胞融合的状态能够生长的性质的细胞株。另外，株化细胞优选来 源于与免疫动物同种系的动物。作为骨髓瘤细胞的具体例，可列举作为来 源于BALB/c小鼠的次黄嘌呤·鸟嘌呤·磷酸核糖·转移酶(HGPRT)缺损 细胞株的P3X62-Ag.8株(ATCCTIB9)、P3X63-Ag.8.U1株(JCRB9085)、 P3/NSI/1-Ag4-1株(JCRB0009)、P3x63Ag8.653株(JCRB0028)或 Sp2/0-Ag14株(JCRB0029)等。

为了使上述骨髓瘤细胞与抗体产生细胞进行细胞融合，在不含血清的 DMEM、RPMI1640培养基等动物细胞培养用培养基中，将抗体产生细胞 与骨髓瘤细胞以约1∶1～20∶1的比例混合，在细胞融合促进剂的存在下进 行融合反应。作为细胞融合促进剂，可以以约10～80％的浓度使用平均分 子量1,500～4,000Da的聚乙二醇等。另外，根据情况，为了提高融合效率 可以并用二甲基亚砜等辅助剂。进而，可以使用利用了电刺激(例如电穿孔) 的市售的细胞融合装置使抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合(Nature，1977， Vol.266，550-552)。

(2)目的杂交瘤的筛选

作为从细胞融合处理后的细胞选择出产生目的抗肌动蛋白丝切蛋白1 片段单克隆抗体的杂交瘤的方法，将细胞悬浮液用例如含胎牛血清的 RPMI1640培养基等适当稀释后，在96孔微量滴定板上以2×10⁶个/孔左右 接种，在各孔中加入选择培养基，然后适当交换选择培养基来进行培养。 培养温度为20～40℃、优选为约37℃。在骨髓瘤细胞是作为HGPRT缺损 株或胸苷激酶(TK)缺损株的细胞株的情况下，通过使用包含次黄嘌呤·氨 基喋呤·胸苷的选择培养基(HAT培养基)，可以选择性地仅使抗体产生细 胞与骨髓瘤细胞的杂交瘤生长、增殖，因此，可以选择在用选择培养基培 养开始后约10天左右生长出的细胞作为杂交瘤。

用HAT培养基选择出的杂交瘤，首先，以对天然型或重组型肌动蛋 白丝切蛋白1蛋白质、或包含序列号1～7所示的氨基酸序列的肽区域的结 合活性为指标进行筛选。接着对于产生对肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质具有 结合活性的抗体的杂交瘤进行交差性的试验。即，验证对其他CXC家族 等的结合活性，选择能够容许的。能够容许的交差性是指在目的的抗体的 用途中可以无视的程度的交差性。例如，如果是用于免疫学测定的单克隆 抗体，如果在最终测定系统中由交差反应产生的信号强度从背景水平被抑 制在低于由特异的反应产生的信号强度的1％，则可以说事实上无交差反 应。

为了确认对肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的反应性、和/或与其他 ADF/COFILIN家族的交差反应性，可以利用例如ELISA法。在ELISA 法中，准备固相化有成为抗原的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质或其片段的微 板，在其中加入将上述杂交瘤的培养上清适当稀释而得的样品使其反应。 充分反应后将孔洗涤，加入针对免疫球蛋白的2次抗体的标记体使其进一 步反应。再次将孔进行洗涤，利用最终与孔结合的2次抗体的标记进行测 定，则可以定量地获知培养上清中存在的抗体对抗原的结合活性。

杂交瘤还可以使用重组DNA技术进行筛选。首先，从按照上述的方 法获得的杂交瘤组中提取mRNA。mRNA的提取使用例如实施例1所述那 样的公知方法即可。接着，使用寡聚dT引物和/或随机引物获得所述mRNA 的cDNA。以该cDNA为模板，利用包含位于编码可变区的基因的上游的 信号序列的碱基序列、和恒定区侧的碱基序列的引物组进行PCR。将所得 的扩增产物插入适当的克隆载体进行克隆化，从而可以得到由该杂交瘤所 生产的抗体的可变区基因的文库。作为更具体的例子不限定，但可以使用 由Novagen社提供的Mouse Ig Primer进行PCR，将扩增产物(小鼠免疫 球蛋白可变区cDNA)插入由Invitrogen社提供的ZERO BLUNT PCR TOPO Vector的EcoRI部位进行克隆化，将所得的载体组制成编码可变区 氨基酸序列的基因文库。接下来，以上述本发明所公开的可变区或各CDR 的氨基酸序列为基础设计探针，从上述文库筛选阳性克隆，从而可以筛选 生产本发明的抗体的杂交瘤。

(3)使用杂交瘤的抗体产生

本发明中的杂交瘤可以通过使用小鼠进行腹水化而用于抗体生产。具 体地，可以在制作杂交瘤时使用的融合伴侣中使用的细胞所来源的小鼠、 和/或裸鼠的腹腔内接种杂交瘤，适宜采集腹水，从而回收包含抗体的腹水 液。更具体地，可以将以SP/0细胞作为融合伴侣的杂交瘤接种于在姥鲛烷 接种后经过10天后的BALB/c小鼠的腹腔中，从而回收含抗体的腹水液。

另外，本发明中的杂交瘤可以通过使用适合的培养基进行培养来用于 抗体生产。具体地，可以在Gibco社制的杂交瘤SFM培养基中以1×10⁵细胞/mL接种杂交瘤，在37℃的5％CO₂培养箱中培养至杂交瘤灭绝，从 而得到包含抗体的培养液上清，但不限于此。

(4)重组抗肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段单克隆抗体的制作方法

本发明的抗体或其片段可以利用编码特异性地识别本发明所公开的 肌动蛋白丝切蛋白1片段的单克隆抗体的氨基酸序列的cDNA序列，通过 重组DNA操作来获得。

例如，可以使用编码下述氨基酸序列的DNA序列，所述氨基酸序列 编码来源于以上述“1-4-2(2)”的方法获得的抗肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质 片段单克隆抗体产生杂交瘤的该抗体的可变区，将编码VH和VL的碱基 序列与编码任意的CL和CH的碱基序列分别连接，将各个多核苷酸插入 适当的表达载体，导入宿主细胞后，作为完整的免疫球蛋白分子使其表达。 另外，还可以使用CDR接枝抗体技术，将编码可变区的多核苷酸插入适 当的表达载体中，并导入宿主细胞后，作为完整的免疫球蛋白分子使其表 达，所述可变区是将编码上述“1-4-2(2)”的方法所得的可变区的氨基酸序 列中的CDR序列的氨基酸序列插入到任意的免疫球蛋白的各CDR中而得 的。此时，使得重链和轻链在同一宿主细胞内表达，能够作为包含重链/ 轻链的2聚体而产生是方便的。具体地，例如，可以用轻链表达载体和重 链表达载体对细胞进行共转化，从共转化细胞得到本发明的抗体。或者， 还可以将编码上述氨基酸序列的多核苷酸直接插入到适当的表达载体，并 导入宿主细胞后，作为免疫球蛋白分子的片段使其表达。或者，可以如上 所述，作为将分别编码包含所述氨基酸序列的VL和VH、或轻链和重链 的多核苷酸用适当的接头连接而插入噬菌体中而得的单链Fv，或作为双价 抗体等的合成抗体片段使其表达。此外，还可以通过灵活利用近年开发的 基因工学技术而使重组抗体在噬菌体表面表达的噬菌体展示抗体技术 (Brinkmann et al、1995、J Immunol Methods、182、41-50、国際公开 WO97/13844号、同90-02809号)，人工地使编码重链、轻链的基因洗牌 (shuffling)，使多样化的单链Fv抗体作为噬菌体融合蛋白表达，从而获得 特异抗体。

关于编码重组抗肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质片段单克隆抗体或其片段 的多核苷酸的调制、该插入了多核苷酸的载体、该载体的宿主导入法，使 用如上述“1-4-1.抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体制作方法”所记载的本 领域公知的重组DNA技术来进行即可。目的重组抗肌动蛋白丝切蛋白1 蛋白质抗体或其片段可以从转化细胞的培养液中或该细胞内获得。

作为免疫球蛋白表达载体，可使用例如，质粒、噬菌粒、粘粒、病毒 载体(例如，基于SV40病毒的载体、基于EB病毒的载体、基于BPV的载 体)等，但不限于这些。例如，作为基于BPV的载体的1种的BCMGS Neo 载体，是通过转化到COS7细胞等中而可以高效地表达外来基因的优选载 体(鸟山一“ウシパピロ一マウイルスベクタ一(牛乳头瘤病毒载体)”、村 松正实和冈山博人编、実験医学别冊：遺伝子工学ハンドブツク(实验医学 分册：基因工程学手册)、1991、羊土社、297-299)。

所述载体除了编码抗体或其片段的多核苷酸之外，还可以包含表达上 述抗体或其片段所需的调控元件(例如，启动子、增强子、终止子、多聚腺 苷化部位、剪接部位)、或根据需要的选择标志物。

作为转化的宿主，除了上述“1-4-1.抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗 体制作方法”中记载的宿主之外，优选使用SP2/0(小鼠骨髓瘤)细胞 (Europian Journal of Cancer Resarch Preview(1996)Vol.5、512-519； Cancer Resarch(1990)Vol.50、1495-1502)。

本发明中的、含有用于表达抗体或其片段的载体的宿主细胞，可以通 过按照常规方法进行培养从而在其培养液上清或宿主细胞内产生抗体。具 体地，在以CHO细胞为宿主的情况下，可以在Gibco社制DMEM培养 基中以1×10⁵细胞/mL接种宿主细胞，通过在37℃的5％CO₂培养箱中培 养，获得包含抗体的培养液上清。另外，例如宿主细胞为大肠杆菌的情况 下，可以接种在LB培养基等大肠杆菌的培养中一般使用的培养基中进行 培养，通过诱导蛋白质的表达，从而在培养液上清或宿主细胞内产生抗体。

此外，在作为表达产物的抗体或其片段包含恒定区的情况下，可以使 用蛋白A柱、蛋白G柱、抗免疫球蛋白抗体亲和柱等从培养液上清和/或 细胞破碎液中进行纯化·回收。另一方面，以仅由可变区构成、不含恒定 区的状态表达的情况下，所述纯化方法不能应用，所以应用其他适当的纯 化方法。例如，作为在其C末端侧融合组氨酸标签等对纯化有利的标签序 列的结构使其表达，则可以通过利用了对应的配基的亲和色谱来纯化。在 不是与标签的融合蛋白质的情况下，可以按照硫酸铵沉淀、离子交换色谱、 反相色谱、凝胶过滤色谱、羟基磷灰石色谱等蛋白质纯化的常规方法进行 纯化。

1-4-3.所得的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体所识别的肌动蛋白丝 切蛋白1蛋白质上的表位的确认

所得的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体所特异性地识别的肌动蛋白 丝切蛋白1蛋白质上的序列、即表位序列，可以通过以该蛋白质的基因为 基础使用PCR反应等制作各种缺失突变基因，分析由该突变型基因得到的 突变型肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质与单克隆抗体的结合性来确定。具体通 过如下方法来进行。首先，制备肌动蛋白丝切蛋白1基因的5’末端侧、或 3’末端侧、或5’末端和3’末端两侧的10～400碱基缺失了的各种长度的片 段，并制作插入了这些片段的表达载体。这样的伴随有缺失突变的基因片 段的调制法在“续生化学实验讲座、第1卷、遺伝子研究法(基因研究法)II、 289-305页、日本生化学会编”中记载。首先，从导入了各个缺失突变体的 表达载体和全长肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的表达载体的宿主细胞中，通 过上述方法调制各种缺失突变体蛋白质和全长肌动蛋白丝切蛋白1蛋白 质。接着，以这些蛋白质作为抗原通过ELISA法进行对抗肌动蛋白丝切蛋 白1单克隆抗体的各种缺失突变体和全长蛋白质的结合性的评价。在对全 长导入了特定的氨基酸序列的缺失的突变体中丧失了单克隆抗体的结合性 的情况下，可以判断该单克隆抗体的表位序列中的至少一部分区域包含在 缺失的氨基酸序列中。进而，通过评价该单克隆抗体针对2种、优选3种 不同的缺失突变体的反应性，可以进一步挤压表位序列。

另外，所得的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体所识别的肌动蛋白丝 切蛋白1蛋白质上的表位序列可以通过如下方法确认。

首先，使还原烷基化的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质与抗肌动蛋白丝切 蛋白1单克隆抗体反应而形成抗原抗体复合体之后，使用胰蛋白酶等适当 的蛋白酶进行分解处理。因为即使受到分解处理，抗体也不易被胰蛋白酶 消化，因此可以使用蛋白G Sepharose等回收抗原抗体复合体。此时，抗 原通过蛋白酶处理，除了与抗体结合而被保护的部分以外被消化，因而通 过将回收的抗原抗体复合体用LC-MS进行分析，可以鉴定与抗体结合而 被保护的部分、即抗体所识别的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质上的表位。

进而，抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体所识别的肌动蛋白丝切蛋白 1蛋白质上的表位序列还可以通过例如使用合成肽的竞争法来确认。首先， 通过固相合成法等制备构成肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的氨基酸序列中每 6～21氨基酸的合成肽。在上述的利用ELISA法来确认针对肌动蛋白丝切 蛋白1蛋白质的结合性的实验中使抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体在与 固相肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质反应时，使该合成肽作用，如果确认了抗 肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体的结合被抑制，则可以判断该合成肽的氨 基酸序列是抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体所识别的表位序列。

2.肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的免疫学测定方法

本发明的第2实施方式涉及肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的免疫学测定 方法。本发明的免疫学测定方法的特征在于，使用分别特异性地识别肌动 蛋白丝切蛋白1蛋白质的氨基酸序列上的不同表位的2种以上的抗肌动蛋 白丝切蛋白1单克隆抗体和/或其片段，测定样品中的肌动蛋白丝切蛋白1 和/或其片段。通过使用单克隆抗体或其片段，可以实现肌动蛋白丝切蛋白 1蛋白质的定量性和检测灵敏度优异的测定。

本发明的测定方法中使用的“样品”是指可能包含肌动蛋白丝切蛋白 1蛋白质和/或其片段的各种样品。例如，包含编码肌动蛋白丝切蛋白1蛋 白质的DNA或其片段的培养细胞、培养细胞破碎液、培养液上清、或哺 乳动物样品。“哺乳动物样品”是指从哺乳动物采集的组织(例如，术后采 集组织)、和/或血液、淋巴液、尿、脑脊液、唾液、精液等体液等所有来 源于哺乳动物的生物体样品，优选为血液或尿。本发明所说的血液包含血 清、血浆或间质液。另外，对哺乳动物的种类不特别限定，优选为灵长类， 更优选为人。

作为表位所存在的肽区域的具体例，可列举含有序列号1和2所示的 氨基酸序列的肽区域。更优选包含含有序列号1所示的氨基酸序列的肽区 域中至少序列号3所示的氨基酸序列的肽区域、和包含含有序列号2所示 的氨基酸序列的肽区域中至少序列号4所示的氨基酸序列的肽区域。另外， 进一步优选在包含含有序列号1所示的氨基酸序列的肽区域中至少序列号 5和6所示的氨基酸序列的肽区域、和包含含有序列号2所示的氨基酸序 列的肽区域中至少序列号7所示的氨基酸序列的肽区域。包含序列号5、6 和7所示的氨基酸序列的肽区域进一步优选作为表位所存在的肽区域。这 是因为如上所述，这些肽区域中存在对于制作高灵敏度的抗体有效的表位。

在本发明中，表位只要存在于肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质或其片段上， 就不特别限制。例如，不同表位在肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质上可以存在 于彼此分离的位置，也可以存在于接近的位置。另外，不同表位分别存在 于上述包含序列号1～7所示的氨基酸序列的肽区域的任一者的情况下，可 以不同表位存在于各自不同肽区域上，或如果是能够包含多个表位的包含 充分的长度的氨基酸的肽区域，则可以存在于单一的肽区域上。在表位存 在于不同肽区域上的情况下，对肽区域的组合不特别限定。例如，可以表 位存在于分别含有序列号1和2所示的氨基酸序列的各个肽区域，也可以 存在于包含含有序列号1所示的氨基酸序列的肽区域上的序列号5和6所 示的氨基酸序列的各个肽区域。或者，可以存在于包含序列号5和6、序 列号5和7或序列号6和7所示的氨基酸序列的各个肽区域。

本实施方式中使用的2种以上的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体和 /或其片段可以使用上述第1实施方式所述的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆 抗体和/或其片段。例如，包含选自后述表1所记载的抗体克隆组、优选为 至少包含1E2、2C4、2D12、2F5、3F11、3G2、4F12、4E12和4G10的 抗体克隆组、更优选为至少包含1E2、2C4、4F12、4E12的抗体克隆组的 2种以上的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体和/或其片段的组合，或者至 少包含4F12和1E2、4F12和4E12、1E2和3F11、1E2和4E12、2C4和 4E12、3G2和4E12、4G10和4E12、2D12和1E2、2D12和2C4、或4E12 和2F5的组合。

在本实施方式中使用的更优选的2种以上的抗肌动蛋白丝切蛋白1单 克隆抗体和/或其片段包含选自以下(1)～(4)中的2种以上的抗肌动蛋白丝 切蛋白1单克隆抗体和/或其片段的组合：(1)至少在轻链中，CDR1包含序 列号8所示的序列，CDR2包含序列号9所示的序列，和CDR3包含序列 号10所示的序列，以及在重链中，CDR1包含序列号11所示的序列，CDR2 包含序列号12所示的序列，和CDR3包含序列号13所示的序列抗肌动蛋 白丝切蛋白1单克隆抗体或其片段；(2)在轻链中，CDR1包含序列号14 所示的序列，CDR2包含序列号15所示的序列，和CDR3包含序列号16 所示的序列，以及在重链中，CDR1包含序列号17所示的序列，CDR2包 含序列号18所示的序列，和CDR3包含序列号19所示的序列的抗肌动蛋 白丝切蛋白1单克隆抗体或其片段；(3)在轻链中，CDR1包含序列号20 所示的序列，CDR2包含序列号21所示的序列，和CDR3包含序列号22 所示的序列，以及在重链中，CDR1包含序列号23所示的序列，CDR2包 含序列号24所示的序列，和CDR3包含序列号25所示的序列的抗肌动蛋 白丝切蛋白1单克隆抗体或其片段；以及(4)在轻链中，CDR1包含序列号 26所示的序列，CDR2包含序列号27所示的序列，和CDR3包含序列号 28所示的序列，以及在重链中，CDR1包含序列号29所示的序列，CDR2 包含序列号30所示的序列，和CDR3包含序列号31所示的序列的抗肌动 蛋白丝切蛋白1单克隆抗体或其片段。

在本实施方式中使用的进一步优选的2种以上的抗肌动蛋白丝切蛋白 1单克隆抗体和/或其片段可列举：(1)至少轻链中的CDR1包含序列号8所 示的序列、CDR2包含序列号9所示的序列、和CDR3包含序列号10所示 的序列、且重链中的CDR1包含序列号11所示的序列、CDR2包含序列号 12所示的序列、和CDR3包含序列号13所示的序列的抗体或其片段，与 轻链中的CDR1包含序列号26所示的序列、CDR2包含序列号27所示的 序列和CDR3包含序列号28所示的序列、且重链中的CDR1包含序列号 29所示的序列、CDR2包含序列号30所示的序列和CDR3包含序列号31 所示的序列的抗体或其片段的组合；(2)至少轻链中的CDR1包含序列号8 所示的序列、CDR2包含序列号9所示的序列和CDR3包含序列号10所示 的序列、且重链中的CDR1包含序列号11所示的序列、CDR2包含序列号 12所示的序列和CDR3包含序列号13所示的序列的抗体或其片段，与轻 链中的CDR1包含序列号20所示的序列、CDR2包含序列号21所示的序 列和CDR3包含序列号22所示的序列、且重链中的CDR1包含序列号23 所示的序列、CDR2包含序列号24所示的序列和CDR3包含序列号25所 示的序列的抗体或其片段的组合；(3)至少轻链中的CDR1包含序列号14 所示的序列、CDR2包含序列号15所示的序列和CDR3包含序列号16所 示的序列、且重链中的CDR1包含序列号17所示的序列、CDR2包含序列 号18所示的序列和CDR3包含序列号19所示的序列的抗体或其片段，与 轻链中的CDR1包含序列号20所示的序列、CDR2包含序列号21所示的 序列、和CDR3包含序列号22所示的序列、且重链中的CDR1包含序列 号23所示的序列、CDR2包含序列号24所示的序列和CDR3包含序列号 25所示的序列的抗体或其片段的组合；以及(4)至少轻链中的CDR1包含序 列号20所示的序列、CDR2包含序列号21所示的序列和CDR3包含序列 号22所示的序列、且重链中的CDR1包含序列号23所示的序列、CDR2 包含序列号24所示的序列和CDR3包含序列号25所示的序列的抗体或其 片段，与轻链中的CDR1包含序列号26所示的序列、CDR2包含序列号 27所示的序列和CDR3包含序列号28所示的序列、且重链中的CDR1包 含序列号29所示的序列、CDR2包含序列号30所示的序列和CDR3包含 序列号31所示的序列的抗体或其片段的组合。

作为构成肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的氨基酸序列的部分序列的序列 号1～7所示的氨基酸序列，是在人、小鼠、大鼠、牛、狗和黑猩猩中显示 100％同源性的、在哺乳动物中高度保守的区域，通过使用识别这些序列的 抗体，可以构建与来源于各种哺乳动物种的样品对应的、通用的肌动蛋白 丝切蛋白1蛋白质测定系统。

本发明的免疫学的测定可以使用利用2种以上的抗体和/或其片段的 公知的免疫学测定方法。例如，可以通过ELISA法、EIA法、荧光免疫测 定法、放射免疫测定法或发光免疫测定法等使用标记抗体的免疫学测定法、 表面等离子体共振法(SPR法)、或水晶振子微天平测定法(QCM法)实施。 另外，本发明的免疫学测定方法可以通过对免疫比浊法、胶乳凝集反应、 胶乳比浊法、红血球凝集反应或粒子凝集反应等的免疫复合体凝集物的生 成，通过光学的方法测量其透射光和/或散射光，或者目视测量其透射光和 /或散射光的测定法来实施。

ELISA(酶联免疫吸附测定法，Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 法也称为酶免疫吸附分析法，是对样品中所含的微量的目标抗原，使用酶 标记的抗体或抗原，利用该酶的作用而作为显色浓度和/或荧光强度来检测 抗原抗体反应，从而定量目标抗原的方法。即，是将本发明的抗体或其片 段、或肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质或其片段固定于固相载体，酶法检测该 抗体等与肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质等的免疫学反应的方法。已知直接法、 间接法、夹心法等方法，但在本发明中，特别优选应用夹心法。夹心法是， 使固定于固相载体的第1抗体(固相化抗体)与抗原结合后，加入识别与第1 抗体不同的表位的第2抗体(标记抗体/一抗)使其与抗原结合，在第2抗体 是标记抗体的情况下，检测其标记，另外在第2抗体是一抗的情况下，通 过第3抗体(二抗)来检测的方法。关于ELISA法的测定方法的详细，请参 照公知的方法(日本临床病理学会编“临床病理临时增刊特集第53号臨床 検查のためのイムノアツセイ-技術と応用-(用于临床检查的免疫测定- 技术与应用-)”、临床病理刊行会、1983年、石川荣治等编“酵素免疫測 定法(酶免疫测定法)”、第3版、医学书院、1987年、北川常广等编“タ ンパク質核酸酵素别冊No.31酵素免疫測定法(蛋白质核酸酶分册 No.31酶免疫测定法)”、共立出版、1987年、入江实编“ラジオイムノア ツセイ(放射免疫测定)”、讲谈社サイエンテイフイク、1974年、入江实 编“続ラジオイムノアツセイ(放射免疫测定续)”、讲谈社サイエンテイ フイク、1979年)。

作为上述固相载体，可以使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、 聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚甲基丙烯酸酯、胶乳、明胶、琼脂 糖、纤维素、Sepharose、玻璃、金属、陶瓷或磁性体等材质制成的珠、微 板、试验管、棒或试验片等形状的不溶性载体。本发明的抗体或其片段或 肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质或其片段向固相载体的固定，可以按照物理吸 附法、化学结合法或并用这些的方法等公知的方法使其结合，从而实现。

作为上述标记物质，在ELISA法的情况下，例如，可以使用过氧化 物酶(POD)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧 化酶、乳酸脱氢酶、淀粉酶或生物素-抗生物素蛋白复合体等，在荧光免疫 测定法的情况下，可以使用异硫氰酸荧光素、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、 取代罗丹明异硫氰酸酯、二氯三嗪异硫氰酸酯、Alexa480或AlexaFluor488 等，并且在放射免疫测定法的情况下，可以使用氚(³H)、碘125(¹²⁵I)或碘 131(¹³¹I)等，但不限于此。另外，发光免疫测定法可以使用NADH-FMNH₂- 荧光素酶系、鲁米诺-过氧化氢-POD系、吖啶酯系或二氧杂环丁烷化合物 系等。标记物质与抗体的结合法在ELISA法的情况下，可以使用戊二醛法、 马来酰亚胺法、二硫吡啶法或过碘酸法等公知的方法，在放射免疫测定法 的情况下，可以使用氯胺T法、鲍尔通-亨特(Bolton-Hunter)法等公知的方 法。

以下，列举使用分别特异性地识别存在于包含序列号5和6所示的氨 基酸序列的肽区域中的表位的抗肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质单克隆抗体， 通过夹心ELISA法来实施本发明的免疫学测定方法的情况为例具体地进 行说明。但是，本发明的实施方式不限于此。

首先，将特异性地识别存在于包含序列号5所示的氨基酸序列的肽区 域中的表位的单克隆抗体，固相化于不溶性的载体。固相化的抗体(固相化 抗体)可以是1种也可以是几种。接下来，使包含肌动蛋白丝切蛋白1蛋白 质的样品与固相化抗体的表面作用，在固相载体的表面形成包含固相化抗 体和肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的抗原抗体复合体。然后，使用洗涤液进 行充分洗涤，除去未与固相化抗体结合的物质。接着，将特异性地识别存 在于包含序列号6所示的氨基酸序列所示的氨基酸序列的肽区域中的表位 的单克隆抗体作为标记抗体进行标记，使该标记抗体作用于结合了上述固 相化抗体和肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的复合体的载体。固相化抗体和标 记抗体识别肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的不同表位，因而在固相载体上形 成包含固相化抗体/肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质/标记抗体的三重复合体。然 后，使用洗涤液将未结合的标记抗体充分洗涤后，利用三重复合体中的标 记抗体的标记进行检测，从而可以检测和定量样品中存在的肌动蛋白丝切 蛋白1蛋白质。标记抗体可以是1种也可以是几种，但优选使用2种以上， 更优选使用3种。另外，在固相化抗体和标记抗体所来源的动物种不同的 情况下，即使不对标记抗体进行标记，也可以作为一抗而作用于固相化抗 体/肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质，使用识别该一抗的标记二抗进行检测。此 外，固相化中使用的抗体和标记中使用的抗体可以分别调换使用。

另外，还可以将标记抗体和包含肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的样品预 先混合而形成抗原抗体复合体，然后作用于固相化抗体。如果对固相化的 抗体预先进行生物素标记，则可以将生物素化固相化抗体、包含肌动蛋白 丝切蛋白1蛋白质的样品、实施了除生物素以外的标记的抗体混合而形成 抗原抗体复合体，然后作用于固相化了抗生物素蛋白的载体，从而利用除 生物素化以外的标记检测抗原抗体复合体。

进而，本发明的免疫学测定方法还可以使用免疫层析试纸条。免疫层 析试纸条例如由包含容易吸收样品的材料的样品接受部、含有本发明的诊 断剂的试剂部、样品与诊断剂的反应物移动的展开部、使展开来的反应物 显色的标记部、显色的反应物展开来的提示部等构成。市售的妊娠诊断剂 等与此具有同样的形态。本测定方法的原理如下。首先，在样品接受部给 予样品，于是样品接受部吸收样品而使样品到达试剂部。接着，在试剂部， 样品中的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质与上述抗肌动蛋白丝切蛋白1部分序 列单克隆抗体或其片段进行抗原抗体反应，反应复合体在展开部移动并到 达标记部。在标记部，发生上述反应复合体与标记二抗的反应，如果与该 标记二抗的反应物展开至提示部，则确认显色。上述免疫层析试纸条侵袭 性极低，完全不会给使用者带来痛苦和/或由试剂使用产生的危险性，因此 可以在家庭中的监测中使用，将其结果在各医疗机构水平精查·治疗(外科 的切除等)，从而可以实现转移·复发预防。另外现在，该试纸条可以通过 例如日本特开平10-54830号公报所记载的那样的制造方法来廉价地大量生 产。

举出使用特异性地识别存在于包含序列号5所示的氨基酸序列的肽区 域中的表位的单克隆抗体(作为第1抗体)、和特异性地识别存在于包含序 列号6所示的氨基酸序列的肽区域中的表位的单克隆抗体(作为第2抗体) 的情况为例来具体说明使用了免疫层析试纸条的免疫学测定方法。首先， 使包含肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的样品与样品接受部接触，于是样品接 受部吸收该样品而使该样品到达试剂部。接着，在试剂部，样品中的肌动 蛋白丝切蛋白1蛋白质与第1抗体之间发生抗原抗体反应，所形成的抗原 抗体复合体在展开部移动而到达标记部。在标记部，上述抗原抗体复合体 与经标记的第2抗体发生反应，如果与该标记化第2抗体的反应物展开至 提示部，则确认显色。

另外，本发明的测定方法还可以使用表面等离子体共振法(SPR法)。 表面等离子体共振现象是指对金属薄膜以特定的入射角度(共振角)照射激 光，则反射光强度显著衰减的现象。利用了SPR现象的原理的SPR传感 器可以高灵敏度地测定金属薄膜表面上的吸附物。因此，在该金属薄膜表 面上预先固定化抗体和/或目标抗原，通过在该金属薄膜表面上通过样品， 从而可以监测抗原抗体反应的结果所生成的样品通过前后的金属表面上的 吸附物的差。已知替换法、间接竞争法等，可以使用任一种。本技术在本 领域是公知的。例如，请参照永田和弘、和半田宏、生体物質相互作用の リアルタイム解析実験法(生物体物质彼此作用的实时分析实验法)、シユ プリンガ一·フエアラ一ク东京、东京、2000。

进而，本发明的测定方法还可以使用水晶振子微天平测定法(QCM 法)。该方法利用了物质吸附于安装于水晶振子的电极表面，则根据其质量 水晶振子的共振频率减少的现象。使用了该方法的QCM传感器是能够根 据水共振频率的变化量而定量地捕获极微量的吸附物的质量测定传感器。 本技术在本领域是公知的。请参考例如，J.Christopher Love、L.A.Estroff、 J.K.Kriehel、R.G.Nuzzo、G.M.Whitesides、2005、Self-Assembled  Monolayers of a Form of Nanotechnology、Chemical Review、 105：1103-1169；森泉丰荣、中本高道、1997、传感器工学、昭晃堂等。

3.消化器癌罹患判定方法

本发明的第3实施方式涉及消化器癌罹患判定方法。本实施方式的判 定方法以样品中的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质和/或其片段作为消化器癌罹 患判定用标志物测定其量，基于与健常体的量的比来判定受试体中的消化 器癌的罹患的有无。本实施方式的方法包括测定步骤(1)和判定步骤(2)。以 下，对于各步骤具体进行说明。

(1)测定步骤“测定步骤”是使用上述第2实施方式所记载的测定方 法测定来源于受试体和健常体的样品中的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的量 的步骤。

“受试体”是指供给本发明的判定方法的个体。受试体的种类只要是 哺乳动物就不特别限定。优选为人(以下，在本说明书中，在人是受试体 的情况下，称为“受试者”)。

“健常体”是指至少没有罹患消化器癌的个体，优选指健康的个体。 健常体需要与受试体是同一生物种。例如，在受试者的情况下，健常体也 必须是人(在本说明书中，这种情况，以后称为“健常者”)。健常体的身 体的条件优选与受试体相同或近似。所谓身体的条件，例如，在人的情况 下，对应于人种、性别、年龄、身高、体重等。

本实施方式中的样品由于来源于受试体和健常体，因而是哺乳动物样 品。即，对应于从哺乳动物采集的组织(例如，术后采集组织)、和/或血液、 淋巴液、尿、脑脊液、唾液、精液等体液等所有来源于哺乳动物的生物体 样品。优选为血液，特别优选为血清或血浆。另外，由于以测定值的比较 为前提，因而作为原则，需要来源于受试体和健常体的样品的种类相同。 例如，在来源于受试体的样品是血清的情况下，作为原则希望来源于健常 体的样品也是血清。

样品中的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的测定方法依据第2实施方式的 测定方法进行即可，因而这里省略了其详细说明。

(2)判定步骤

“判定步骤”是比较上述测定步骤中测定的来源于受试体和健常体的 样品中的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质和/或其片段的量，在受试体的肌动蛋 白丝切蛋白1蛋白质和/或其片段的量与健常者的该量相比统计学上有意义 义地多的情况下，判定受试体罹患了消化器癌的步骤。“消化器癌”是指 消化系统器官中发生的原发性恶性肿瘤。例如，食道癌、胃癌、十二指肠 癌、小肠癌(包含空肠癌、回肠癌)、大肠癌(包含盲肠癌、结肠癌、直肠癌)、 和胰腺癌。作为本实施方式的判定对象特别优选的消化器癌是胃癌。但是， 不限于消化器癌，也可以是乳癌、肝癌、肺癌等其他上皮系肿瘤、和/或恶 性黑色素瘤等皮肤癌。

在本步骤中，通过上述测定步骤来比较由来源于受试体和健常体的各 个样品获得的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质和/或其片段的量。比较的量可以 是像浓度这样的相对量，或者可以是绝对量。在绝对量的情况下，需要预 先使供测定的样品的量在受试体和健常体中为等量，或者以基于供测定的 样品的量的比以等量的方式换算。在本步骤中，基于来源于受试体的样品 中的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质和/或其片段的量与来源于健常体的样品中 的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质和/或其片段的量相比，是否在统计学上有意 义地多，将有意义地多的受试体分类为消化器癌罹患组，将没有有意义的 差的受试体分类为消化器癌非罹患组。而且，被分类为消化器癌罹患组的 受试体被判定为罹患消化器癌，或者其可能性极高，另外被分类为消化器 癌非罹患组的受试体虽然不能完全排除罹患消化器癌的可能性，但可判定 其可能性低。

这里，“统计学上有意义”是指，例如，所得的值的危险率(有意义水 准)小于5％、1％或0.1％的情况。因此，“统计学上有意义地多”是指将 分别从受试体和健常体得到的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质和/或其片段的量 的差异进行统计学处理时，两者间存在有意义的差异，且受试体的上蛋白 质的量与健常体的该量相比多。通常，相对于关于血液样品中的肌动蛋白 丝切蛋白1蛋白质的量，受试体比健常体多2倍以上、优选3倍以上、更 优选4倍以上、最优选5倍以上的情况。如果量的差异为3倍以上，则置 信度高，可以说是统计学上有意义地多。统计学处理的检验方法适宜使用 能够判断有意义性的有无的公知检验方法即可，不特别限定。例如，可以 使用学生t检验法、多重比较检验法。

健常体的血液样品中的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的量也可以在测定 受试体的血液样品中的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的量时测定，但也可以 利用预先测定的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的量。特别是，如果预先测定 健常体的各种身体条件下的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的量，将其值输入 计算机进行数据库化，则可以通过将受试体的身体条件输入该计算机，从 而即时地利用在与该受试体的比较中具有最适的身体条件的健常体的肌动 蛋白丝切蛋白1蛋白质的量，因此是便利的。

对在本发明中成为对象的消化器癌的病期不特别限定，遍及早期消化 器癌到晚期消化器癌。特别是，本发明的判定方法由于实施方式1的抗体 和/或其片段的高灵敏度性，在即使是对于现有的方法来说困难的早期消化 器癌也能够进行其检测的方面也是优异的。“早期消化器癌”是指局限于 肿瘤发生的局部(粘膜内)，无向周围组织的浸润的癌，或即使有浸润其范 围也局限于局部的癌。消化器癌的早期发现可以显著提高5年生存率，因 此能够早期判定其罹患的本发明的实际效益高。

这样，根据本发明的消化器癌的检测方法，通过使用抗体免疫学地测 定血液样品中的消化器癌检测用标志物，从而可以简便且迅速、并早期地 判定受试体是否罹患消化器癌。

根据本发明的判定方法，使用受试体的血浆和/或血清等样品，可以从 早期判定该受试体是否罹患消化器癌。

4.使用本发明测定法的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质测定用试剂盒

本发明的第4实施方式涉及肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的测定用试剂 盒。本实施方式的试剂盒的特征在于，作为必需的构成物，包含2种以上 分别特异性地识别构成肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的氨基酸序列上的不同 表位的抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体和/或其片段。本试剂盒所含的上 述抗体和/或其片段可列举例如，上述实施方式1所述的抗体和/或其片段。 另外，本试剂盒所含的2种以上的抗体和/或其片段的组合可列举例如上述 第2实施方式所述的抗体和/或其片段的组合。此外，本试剂盒根据需要可 以加入标记二抗、标记的检测所需的底物、阳性对照和/或阴性对照、在样 品的稀释和/或洗涤中使用的缓冲液和/或使用说明书等。

根据本发明，可以通过上述第1实施方式所记载的免疫学测定方法容 易且简便地测定血液等适当的样品所含的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质。另 外，基于其结果和上述第3实施方式的方法，还可以简便且迅速地判定样 品提供者的消化器癌的罹患的有无。

实施例

以下，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例任 何限制。

<实施例1>利用大肠杆菌的重组型肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的调 制

(人肌动蛋白丝切蛋白1基因的调制)

为了调制作为抗体的免疫原使用的重组型人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白 质，由作为人胎儿肾细胞株的HEK293细胞调制人肌动蛋白丝切蛋白1 mRNA。mRNA的调制使用Qiashredder和RNeasy mini kit(Qiagen社制)， 详细按照附带的方案。

接下来，使用逆转录酶SuperscriptII(invitrogen社制)以所得的总 mRNA为模板合成cDNA，制作人cDNA文库。逆转录反应按照上述酶所 附带的方案。

接着，以所得的人cDNA文库为模板，使用包含序列号32和35所示 的碱基序列的引物组进行PCR。序列号32所示的碱基序列包含人肌动蛋 白丝切蛋白1基因的5’末端侧区域的一部分及其上游侧的BamHI识别序 列。序列号35所示的碱基序列包含人肌动蛋白丝切蛋白1基因的3’末端侧 区域的一部分及其下流侧的EcoRI识别序列。DNA聚合酶使用KOD(东 洋纺社制)，以包含cDNA文库10ng和各引物10pmol的方式按照KOD所 附带的方案调制PCR的反应液。反应条件是在94℃的温度加热5分钟， 然后将94℃保持15秒、55℃保持30秒、68℃保持30秒的循环重复35次 后，最后在68℃保温4分钟的条件下进行。扩增的DNA片段使用Wizard  SV Gel and PCR Clean-up System(Promega社制)来纯化。通过该反应得 到全长约500bp的PCR产物。

将所得的DNA片段进行BamHI切割和EcoRI切割后，为了插入 BamHI切割、EcoRI切割和BAP处理的开环pET30a(Novagen社制)内而 进行连接反应。DNA连接酶使用Ligation High(东洋纺社制)，反应按照附 带的方案。接着，使用连接反应后的溶液进行感受态细胞的转化。感受态 细胞使用大肠杆菌株DH5α(タカラバイオ社制)，详细按照附带的方案。 转化处理后的菌涂布在含有抗生素卡那霉素100μg/mL的LB平板上，在 37℃培养一夜。将所得的转化体用含有100μg/mL的卡那霉素的LB液体 培养基在37℃培养一夜，通过Mini-Prep来得到目的pET30a_肌动蛋白丝 切蛋白1。

接着，以所得的pET30a_肌动蛋白丝切蛋白1基因(10ng)作为模板， 使用包含序列号39和40所示的碱基序列的引物组进行PCR。序列号39 所示的碱基序列包含人肌动蛋白丝切蛋白1基因的5’末端区域的一部分及 其上游侧的EcoRI识别序列。序列号40所示的碱基序列包含人肌动蛋白 丝切蛋白1基因的3’末端区域的一部分及其下流侧的BglII识别序列。DNA 聚合酶使用KOD(东洋纺社制)，以包含cDNA文库10ng和各引物10pmol 的方式，按照KOD所附带的方案调制PCR的反应液。反应条件是在94 ℃的温度加热5分钟，然后将94℃保持15秒、55℃保持30秒、68℃保持 30秒的循环重复35次后，最后在68℃保温4分钟的条件下进行。扩增的 DNA片段使用Wizard SV Gel and PCR Clean-up System(Promega社制) 进行纯化。通过该反应获得全长约500bp的PCR产物。

将所得的DNA片段进行EcoRI切割和BglII切割后，为了插入到 EcoRI切割、BamHI切割和BAP处理的开环pCMV-Myc(Clontech社制) 内而进行连接反应。DNA连接酶使用Ligation High(东洋纺社制)，反应按 照附带的方案。接着，使用连接反应后的溶液进行感受态细胞的转化。感 受态细胞使用大肠杆菌株DH5α(タオラバイオ社制)，详细按照附带的方案。 转化处理后的菌涂布在含有抗生素卡那霉素50μg/mL的LB平板上，在37 ℃培养一晚。将所得的转化体用含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体 培养基以37℃培养一晚，通过Mini-Prep而得到目的pCMV-Myc_人肌动 蛋白丝切蛋白1。

(重组型人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的调制)

为了调制重组型人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质，使用pET30a_肌动蛋 白丝切蛋白1进行大肠杆菌株Rosetta-Gami2(Novagen社制)的转化。将 所得的转化体用包含卡那霉素和氯霉素的LB培养基10mL在37℃进行一 夜前培养。接下来，在1L的相同培养基接种前培养，在37℃培养5小时， 添加终浓度0.25mM的IPTG，在32℃进行12小时培养，诱导目的的重组 型人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的表达后，通过离心分离回收菌体。

将所得的菌体用PBS洗涤后，使用B-PER(PIERCE社制)将不溶性级 分作为沉淀进行制备。详细按照附带的方案。接下来将不溶性级分用6M 的脲可溶化后，使用TALON Metal Affinity Resin(CLONETECH社制)吸 附组氨酸标签融合人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质。将吸附了蛋白质的树脂 用包含10mM咪唑的6M的脲洗涤后，使用包含1M咪唑的6M的脲溶液 进行溶出。

接下来由所得的溶出级分进行蛋白质的重折叠。首先，对加入了6M 的脲的PBS溶液透析一夜后，将PBS阶段地添加到透析液中进行稀释， 使得透析液中的脲的终浓度为1M。最后对新调制的PBS溶液透析一夜， 对于所得的重折叠溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过考马斯亮蓝染色来 确认分子量约16,000Da的组氨酸标签融合人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的 纯化。

<实施例2>针对人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的小鼠单克隆抗体的制 作和筛选

(抗人肌动蛋白丝切蛋白1抗体产生小鼠的制作)

将实施例1所得的50μL的1mg/mL的人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质 溶液与50μL的Sigma adjuvant system(Sigma社制)混合，将总量腹腔施与 6周龄的BALB/c小鼠。在2周后、和4周后施与等量的同样地调制的人 肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质溶液。接着，从小鼠尾部静脉采集100μL血液， 静置一夜后，以5000×g离心5分钟，将上清作为血清回收。

在平底96孔板(Nunc社制)的孔中加入100μL的0.1μg/mL人肌动蛋 白丝切蛋白1蛋白质溶液，进行一夜固相化。将孔中的蛋白溶液抛弃后， 注入稀释至4倍的封闭溶液(包含1％BSA的PBS-T)400μL，室温静置1 小时。然后，用PBS-T洗涤，制成人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质固相化平 板。将上述所得的血清稀释1000倍，在人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质固相 化平板的孔中加入100μL，在室温静置1小时。然后，抛弃孔中的溶液， 用PBS-T洗涤后，加入HRP标记抗小鼠IgG溶液(GEヘルスケア社制) 100μL，进一步在室温静置1小时。抛弃孔中的溶液，用PBS-T洗涤后， 加入TMB溶液100μL反应15分钟。以450nm的吸光度确认反应所生成 的显色，判断在采集了显色的血液样品的小鼠中，产生了针对人肌动蛋白 丝切蛋白1蛋白质的抗体。

(抗人肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体的制作)

对于确诊了针对人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的抗体的产生的小鼠， 将与上述同样地调制的人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质溶液进行腹腔施与，3 天后进行脾脏的摘出。对摘出的脾脏用注射器开孔，注入RPMI1640培养 基(GIBCO社制)而挤出脾脏细胞，得到脾脏细胞液。将所得的脾脏细胞液 以1200转/分钟离心7分钟后除去上清，用RPMI1640培养基洗涤。再次 悬浮于RPMI1640培养基而数出细胞数，调制脾脏细胞数的1/10量的SP2/0 骨髓瘤细胞液。将两细胞液混合，以2200转/分钟离心10分钟，抛弃上清。 轻敲而使细胞分散，添加将PEG(ROCHE社制)与HBSS(GIBCO社制)以 5∶1混合而得的溶液1mL进行搅拌。以后的操作中只要不特别说明，溶液 和/或培养基全部使用在37℃保温后的。

在加入了PEG和HBSS的细胞溶液中，经过5分钟添加RPMI1640 培养基9mL，缓慢混合后，以2200转/分钟离心10分钟，除去上清。将所 得的沉淀细胞悬浮于添加了15％FCS和HAT(ROCHE社制)的RPMI1640 培养基中，在96孔细胞培养平板(グライナ一社制)中每1孔注入200μL， 在37℃、5％CO₂下培养1周。

将在HAT添加条件下生长的集落判定为脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合 而成的杂交瘤，将集落生长的孔的上清稀释5倍，在上述人肌动蛋白丝切 蛋白1蛋白质固相化平板的孔中添加100μL，通过与上述同样的方法来确 认抗体产生的有无。将能够确认抗体的产生的孔作为阳性。将阳性孔的集 落悬浮于包含15％FCS和HT(invitrogen社制)的RPMI培养基中，通过有 限稀释法进行阳性克隆的克隆化。对于克隆化的结果所得的39种杂交瘤， 在SFM培养基中驯化，进行抗体的产生。在100％SFM培养基60mL中 以1×10⁵细胞/mL接种杂交瘤，进行10天培养至细胞灭绝后，将培养液以 3000转/分钟离心分离15分钟，除去细胞。对于所得的培养上清，使用 ProSep-vA Ultra chromatography(ミリポア社制)纯化所含的抗体。

<实施例3>肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质抗体的表位鉴定

(缺失突变体的制作)

对于获得的39种纯化抗体，以如下方法确定表位序列。首先，作为 GST融合蛋白质调制实施例1所示的突变体A～突变体E的5种人肌动蛋 白丝切蛋白1蛋白质缺失突变体和全长的人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质(图 1)。

以pET30a_肌动蛋白丝切蛋白1基因(10ng)作为模板，对于突变体A 使用包含序列号32和37所示的碱基序列的引物组，对于突变体B使用包 含序列号33和35所示的碱基序列的引物组，对于突变体C使用包含序列 号32和38所示的碱基序列的引物组，对于突变体D使用包含序列号32 和36所示的碱基序列的引物组，对于突变体E使用包含序列号34和38 所示的碱基序列的引物组，对于全长的人肌动蛋白丝切蛋白1使用包含序 列号32和35所示的碱基序列的引物组，分别通过PCR来获得基因。序列 号32、33和34所示的碱基序列包含人肌动蛋白丝切蛋白1基因的5’末端 区域的一部分及其上游侧的BamHI识别序列。序列号35～38所示的碱基 序列包含人肌动蛋白丝切蛋白1基因的3’末端侧区域的一部分及其下流侧 的EcoRI识别序列。

将所得的上述6种PCR产物分别进行BamHI切割和EcoRI切割后， 为了插入BamHI切割、EcoRI切割和BAP处理后的开环pGEX6P-1(GE ヘルスケア)内而进行连接反应。DNA连接酶使用Ligation High(东洋纺社 制)，反应按照附带的方案。接着，使用连接反应后的溶液进行感受态细胞 的转化。感受态细胞使用大肠杆菌株DH5α(タカラバイオ社制)，详细按 照附带的方案。转化处理后的菌涂布在含有抗生素氨苄青霉素100μg/mL 的LB平板上，在37℃培养一夜。将所得的转化体用含有100μg/mL氨苄 青霉素的LB液体培养基以37℃培养一夜，通过Mini-Prep得到导入了目 的的全长人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质和5种缺失突变体的基因的6种表 达载体。

将上述6种表达载体分别向大肠杆菌株Rosetta-Gami2(Novagen社制) 进行转化，通过下述所示的操作来调制全长的人肌动蛋白丝切蛋白1和5 种缺失突变体的重组GST融合蛋白质。首先，将转化体用包含氨苄青霉素 和氯霉素的LB培养基10mL以37℃进行一夜前培养。接下来，在1L的 相同培养基中接种前培养，以37℃培养5小时，添加终浓度0.5mM的 IPTG，以37℃进行12小时培养，诱导目的的重组型人肌动蛋白丝切蛋白 1蛋白质的表达后，通过离心分离回收菌体。

将所得的菌体用PBS洗涤后，使用B-PER(PIERCE社制)获得可溶性 级分。详细按照附带的方案。接下来使用谷胱甘肽Sepharose4B(GEヘル スケア)，吸附可溶性级分的重组GST融合蛋白质。将吸附了蛋白质的树 脂用TBS(150mM NaCl、50mM Tris-Cl、5mM EDTA、pH值8.0)洗涤后， 用包含10mM还原型谷胱甘肽的TBS溶出。将所得的GST融合蛋白质调 制成1mg/mL用于以下的实验。

(对人肌动蛋白丝切蛋白1缺失突变体的单克隆抗体的反应性的评价)

对于全长人肌动蛋白丝切蛋白1、5种缺失突变体的重组GST融合蛋 白质调制1μg/mL溶液，分别将各100μL加入平底96孔板(Nunc社制)的 孔中，固相化3小时。对于各个孔，抛弃孔内的GST融合蛋白质溶液后， 注入封闭溶液(包含1％BSA的PBS-T)400μL，在4℃静置1小时。然后， 抛弃溶液，将PBS-T洗涤后的平板作为抗原蛋白质固相化平板。另外，制 作不实施GST融合蛋白质的固相化、仅进行封闭反应的平板，作为空白平 板。接下来，将用包含1％BSA的PBS-T稀释至终浓度1μg/mL的上述39 种抗人肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体分别加入空白平板和GST融合蛋白 质固相化平板，在室温反应1小时。抛弃孔内的溶液并用PBS-T洗涤后， 与100μL的HRP标记抗小鼠IgG抗体溶液(GEヘルスケア)在室温反应1 小时。接着，用PBS-T洗涤后，加入TMB溶液100μL而进行显色反应1 分钟。反应的停止通过添加100μL的2N硫酸溶液来进行。显色通过测定 450nm的吸光度来确认。在与空白孔相比吸光度高0.5以上的情况下，认 定为“有反应性”，判断为固相化的重组GST融合蛋白质与添加的单克隆 抗体结合。将针对各个GST融合蛋白质的39种抗人肌动蛋白丝切蛋白1 单克隆抗体的结合性示于表1。在表1中，将判断为“有反应性”的情况 用“○”表示，将判断为“无反应性”的情况用“×”表示。

(表位序列的鉴定)

以39种各抗人肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体的针对全长的人肌动 蛋白丝切蛋白1和5种缺失突变体的反应性的差异为指标确定表位序列。 例如，4E12抗体仅与全长的人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质和突变体B反应， 与其他缺失突变体不反应。因此可知，4E12抗体的表位序列的至少一部分 序列存在于全长人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质和突变体B中，包含在其他 缺失突变体中作为缺失的区域的序列号4所示的C3区域中(图1)。

对其他克隆也进行同样的分析，根据39种抗人肌动蛋白丝切蛋白1 单克隆抗体所识别的表位存在于作为包含人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的 部分序列的肽区域的N1、N2、M、C1、C2或C3的哪一区域来进行分类(表 1)。

表1：

有反应性：○

无反应性：×

<实施例4>人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质测定用ELISA的构建

(HEK293细胞中的人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的表达)

将HEK293细胞(2×106细胞)在包含10％FCS的DMEM培养基 (GIBCO社制)中使用细胞培养用皿(コ一ニング社制)培养一夜，使用 LipofectAmine2000(Invitrogen社制)按照附带的方案导入pCMV-Myc_人 肌动蛋白丝切蛋白1或pCMV-Myc。培养2天后，去除培养基，用10mL 的PBS洗涤后，加入1％NP40缓冲液(1％NP40、150mM NaCl、5mM EDTA、100mM Tris-Cl、pH值8.0)1.0mL，4℃静置30分钟。将细胞悬浮 于1％NP40缓冲液中，移至1mL的离心管，以1,5000×g离心后，回收上 清。各样品5μL用LDS样品缓冲液(Invitrogen社制)进行改性处理，使用 NuPage4-12％Bis-Tris Gel(Invitrogen社制)进行电泳后，将蛋白质向 PVDF膜转移。将其与兔多克隆抗体(Proteintech Group社)反应，进一步 与过氧化物酶标记2次抗体反应。使用WesternLightning Plus-ECL(Perkin  Elmer社制)使X射线膜感光而使免疫反应的蛋白质可视化。其结果是，仅 在pCMV-Myc_人肌动蛋白丝切蛋白1导入细胞中检测到人肌动蛋白丝切 蛋白1蛋白质的条带(图2)。

(抗体的组合的选定)

为了选定可能进行高灵敏度检测的夹心ELISA用的2种抗体的组合， 对于由获得的39种抗体和生物素标记的同样39种抗体的组合得到的1521 种组合(39×39种组合)，比较夹心ELISA的检测灵敏度的优劣。作为样品 的阳性对照使用pCMV-Myc_肌动蛋白丝切蛋白1导入细胞提取液，作为 阴性对照使用pCMV-Myc导入细胞提取液进行ELISA测定，以阳性对照 的测定值减去阴性对照的测定值而得的值为指标，判定检测灵敏度的优劣。

首先，对于39种纯化抗体调制3μg/mL溶液，分别在平底96孔板(Nunc 社制)的孔中加入各100μL，固相化5小时。抛弃孔内的纯化抗体溶液后， 注入封闭溶液(包含1％BSA的PBS-T)400μL，4℃静置一夜。然后，抛弃 溶液，将用PBS-T洗涤后的平板作为纯化抗体固相化平板。接下来，将 pCMV-Myc_人肌动蛋白丝切蛋白1导入细胞、或pCMV-Myc导入细胞的 蛋白质提取液用1％NP40缓冲液稀释10倍后，对于每1种固相化抗体， 对39孔各添加100μL，在室温反应1小时。接着，抛弃孔内的溶液用PBS-T 洗涤后，将获得的39种抗体的生物素体用包含1％BSA的1％NP40缓冲 液稀释至0.5μg/mL，将它们分别加入与pCMV-Myc_人肌动蛋白丝切蛋白 1导入细胞的提取液反应的孔和与pCMV-Myc导入细胞的提取液反应的 孔，室温反应1小时。抛弃孔内的溶液并用PBS-T洗涤后，与100μL的 avidin-HRP溶液(R&D社制)在室温反应1小时。进而，抛弃avidin-HRP 溶液，用PBS-T洗涤后，加入TMB溶液100μL反应5分钟。反应的停止 通过添加100μL的2N硫酸溶液来进行。显色通过测定450nm的吸光度来 确认，对于39种固相化抗体和39种生物素标记抗体的全部组合，测定阳 性对照和阴性对照的人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质浓度，以阳性对照减去 阴性对照而得的值为基础确定灵敏度好的抗体的组合。其结果明确了，通 过使用特异性地识别C1区域、C3区域或N2区域的任一区域的2种抗肌 动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体，可以特别高灵敏度地检测人肌动蛋白丝切 蛋白1蛋白质(图3)。

<实施例5>抗肌动蛋白丝切蛋白1单克隆抗体的氨基酸序列的分析

(使用杂交瘤的单克隆抗体的轻链和重链cDNA序列和氨基酸序列的 确定)

对于筛选出的5种抗体的组合所需的4种抗体，确定轻链和重链的 cDNA序列和氨基酸序列。首先，将产生各个抗体的杂交瘤使用添加了15 ％FCS的RPMI1640培养基，在37℃、5％CO₂下培养至1×10⁶细胞/mL。 然后，将培养液以1200转/分钟离心分离5分钟而回收细胞。从回收的杂 交瘤调制mRNA。调制使用Qiashredder和RNeazy mini kit(Qiagen社 制))，详细按照附带的方案。接下来，使用逆转录酶SuperscriptII(invitrogen 社制))，以所得的总mRNA为模板使用寡聚dT引物合成cDNA，从而制 作cDNA文库。

以每个杂交瘤分别得到的cDNA文库为模板，使用Mouse Ig Primer (Novagen社制)进行PCR，将扩增产物(小鼠免疫球蛋白可变区cDNA)使用 Invitrogen社所提供的ZERO BLUNT TOPO PCR cloning Kit(invitorogen 社)进行连接。接下来，使用连接反应液进行感受态细胞的转化。感受态细 胞使用DH5α(タカラバイオ社制)，详细按照附带的方案进行。转化处理后 的菌涂布于含有50μg/mL的卡那霉素的LB平板，在37℃培养一夜。将来 自各扩增产物的转化体各4克隆接种于含有50μg/mL的卡那霉素的LB液 体培养基，在37℃培养一夜。从各培养液通过Mini-Prep制备载体DNA 溶液，结果，对于各扩增产物，得到了插入了编码单克隆抗体的DNA的 载体溶液各4种。

对于所得的载体溶液，使用M13引物进行编码单克隆抗体的区域的 DNA序列分析。分析使用3130xl基因分析仪(Applied Biosystems社制)来 进行。在插入区域判断无终止密码子的克隆作为编码目的的单克隆抗体的 DNA序列，确定了上述4个抗体(1E2、2C4、4E12、4F12)的轻链、重链 的DNA序列。对于确定的DNA序列，按照大肠杆菌的密码子使用频率确 定编码的氨基酸序列，可以得到序列号8～31所示的序列。

序列号8～31所示的氨基酸序列作为编码1E2的氨基酸序列得到。更 详细地，序列号8、9、10分别编码1E2的轻链CDR1、CDR2、CDR3， 另外序列号11、12、13所示的氨基酸序列分别编码1E2的重链CDR1、 CDR2、CDR3。

序列号14～19所示的氨基酸序列作为编码2C4的氨基酸序列得到。 更详细地，序列号14～16分别编码2C4的轻链CDR1～3，另外序列号17～ 19所示的氨基酸序列分别编码2C4的重链CDR1～3。

序列号20～25所示的氨基酸序列作为编码4E12的氨基酸序列得到。 更详细地，序列号20～22分别编码4E12的轻链CDR1～3，另外序列号 23～25所示的氨基酸序列分别编码4E12的重链CDR1～3。

序列号26～31所示的氨基酸序列作为编码4F12的氨基酸序列得到。 更详细地，序列号26～28分别编码4F12的轻链CDR1～3，另外序列号 29～31所示的氨基酸序列分别编码4F12的重链CDR1～3。

<实施例6>通过使用单克隆抗体1E2和单克隆抗体4E12的夹心 ELISA法的人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的检测

通过实施例3判明了，使用了特异性地识别存在于包含序列号1所示 的氨基酸序列中至少序列号5所示的氨基酸序列的肽区域中的表位的单克 隆抗体1E2、和特异性地识别存在于包含序列号1所示的氨基酸序列中至 少序列号6所示的氨基酸序列的肽区域中的表位的单克隆抗体4E12的生 物素标记体的夹心ELISA法，能够最高灵敏度地检测人肌动蛋白丝切蛋白 1蛋白质。因此，将His-人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质用包含1％BSA和1 ％NP40的TBS缓冲液从1000ng/mL连续稀释至10pg/mL，通过以此为样 品的测定计算出本夹心ELISA的检测灵敏度。其结果是，利用1E2和4E12 的组合的ELISA法的最小检测限值(平均值+2SD与受试体的平均值-2SD 不重合的最小浓度)为10pg/mL(图4箭头)。

<实施例7>利用血浆中的人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质测定的胃癌 的检测

通过使用1E2和4E12的生物素标记体的夹心ELISA法，来检测胃癌 患者和健常者的血浆中的人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质。由胃癌患者51 名(阶段I：24名、阶段II：6名、阶段III：11名、阶段IV：10名)和对 照健常者20名使用Benedict II真空采血管(テルモ社制)进行采血，得到血 浆。血浆分别用包含1％BSA和1％NP40的TBS缓冲液稀释10倍后，使 用100μL作为样品。

首先，对于抗人肌动蛋白丝切蛋白1抗体1E2调制3μg/mL溶液，分 别将100μL加入平底96孔板(Nunc社制)的孔中，固相化5小时。对于各 个孔，抛弃孔内的纯化抗体溶液后，注入封闭溶液(包含1％BSA的PBS-T) 400μL，4℃静置一夜。除去封闭溶液，用400μL的PBS-T洗涤一次后， 添加血浆样品100μL，在室温反应1小时。抛弃孔内的溶液，用PBS-T洗 涤后，将用包含1％NP40的TBS缓冲液稀释至0.5μg/mL的4E12的生物 素标记体每孔注入各100μL，在室温反应1小时。接着，抛弃孔内的溶液 用PBS-T洗涤后，将100μL的avidin-HRP溶液(R&D社制)在室温反应1 小时。进而，抛弃avidin-HRP溶液，用PBS-T洗涤后，加入TMB溶液 100μL反应5分钟。反应的停止通过添加100μL的2N硫酸溶液来进行。 显色通过测定450nm的吸光度来确认。其结果是，在早期和晚期胃癌患者 中，与对照健常者相比，从血浆中检测到了统计学上有意义的高值的人肌 动蛋白丝切蛋白1蛋白质(图5)。

<实施例8>利用血清中的人肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质测定的胃癌 的检测

通过使用1E2和4E12的生物素标记体的夹心ELISA法，检测胃癌患 者和健常者的血清中的人肌动蛋白丝切蛋白1。由胃癌患者15名(阶段I： 7名、阶段II：1名、阶段III：4名、阶段IV：3名)和对照健常者5名使 用Benedict II真空采血管(テルモ社制)进行采血，得到血清。血清分别用 包含1％BSA和1％NP40的TBS缓冲液稀释10倍后，使用100μL作为样 品。

首先，对于抗人肌动蛋白丝切蛋白1抗体1E2调制3μg/mL溶液，分 别在平底96孔板(Nunc社制)的孔中加入各100μL，固相化5小时。对于 各个孔，抛弃孔内的纯化抗体溶液后，注入封闭溶液(包含1％BSA的PBS-T) 400μL，在4℃静置一夜。除去封闭溶液，用400μL的PBS-T洗涤一次后， 添加血清样品100μL，在室温反应1小时。抛弃孔内的溶液，用PBS-T洗 涤后，将用包含1％NP40的TBS缓冲液稀释至0.5μg/mL的4E12的生物 素标记体在每孔中各加入100μL，室温反应1小时。接着，抛弃孔内的溶 液而用PBS-T洗涤后，将100μL的avidin-HRP溶液(R&D社制)在室温反 应1小时。进而，抛弃avidin-HRP溶液，用PBS-T洗涤后，加入TMB 溶液100μL反应5分钟。反应的停止通过添加100μL的2N硫酸溶液来进 行。显色通过测定450nm的吸光度来确认。其结果是，在早期和晚期胃癌 患者中，从血清中也能检测到与对照健常者相比统计学有意义的高值的人 肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质(图6)。

产业可利用性

根据本发明，可以实现存在于来源于各种哺乳类细胞的生物体样品中 的肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质的高灵敏度且定量的检测。另外，根据本发 明的方法，可以使用患者血液高灵敏度地检测早期消化器癌，因此作为利 用非侵袭的检查手法的早期癌患者的筛选法是有用的。进而，作为为了阐 明肌动蛋白丝切蛋白1蛋白质所参与的细胞骨架控制机制的基础研究中的 测定系统也是有用的。

此外，本说明书中所引用的全部发行物、专利和专利申请直接作为参 考引入本说明书中。