用于Smad3靶基因相关miRNA的回收和鉴定的探针、试剂盒和方法

摘要

本发明涉及了一种用于靶基因相关miRNA的回收和鉴定方法的探针，使用该探针的回收和鉴定方法以及试剂盒。具体涉及靶向Smad3基因mRNA的miRNA回收和鉴定的核酸探针，其具有SEQ ID NO:26的核苷酸序列。本发明提供了这种定点回收、鉴定miRNA的作用原理。本发明公开了这种新型回收、鉴定方法的用途和实施策略，特别是应用于细胞内特定基因RNA位点的miRNA的回收和鉴定。本发明证实这种定点回收技术可以特异性回收与Smad3因mRNA相结合的miRNA，并证实这些miRNA可以调控Smad3，该方法可以有效的回收、鉴定靶向特定基因mRNA的miRNA。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域。具体而言，本发明涉及靶基因相关miRNA 回收、鉴定技术的实施方法及应用，尤其是在动物细胞系中的应用，例如在人肿 瘤细胞株中的实施方法和用途。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是长约20～24nt、非编码的微小RNA，它们通过抑制 mRNA翻译或者促进mRNA降解对靶基因进行转录后水平的调控(Bartel,D.P.， Cell.2004,116:281-297)。MiRNA是一种调控细胞功能作用非常广泛的非编码小 RNA，几乎控制着每一个生物学过程，包括细胞的分化、发育、增殖和凋亡。 此外，现在研究表明miRNA表达水平失调与很多疾病包括肿瘤、自身免疫性疾 病、糖尿病、心脏病等疾病密切相关(Hobert,Trends Biochem.Sci.2004,29:462; Lu,J.等，Nature.2005,435:834-838;Li,Q.J.等，Cell.2007,129:147-161;Cheng,H. Y.等，Neuron.2007,54:813-829;Chang,T.C.等，Mol Cell.2007,26:745-752;He,L. 等，Nature.2005,435:828-833;Care,A.等，Nat Med.2007,13:613-618)。

MiRNA的生物学功能是人们非常关注的问题，而miRNA靶基因的确定是研 究miRNA生物学功能的关键，目前有关miRNA靶基因的确定主要靠计算机生物 信息学软件预测和生物学实验方法(Daniel,W.T.等,Nucleic Acids Res.2011, 39:6845-53;U.A.等,Gene.2009,451:1-5)。

目前，常用的计算机生物信息学预测软件有miRanda、PicTar、TargetScan、 PITA和RNA22。生物信息学方法主要是利用某种算法对靶基因样本进行评分及 筛选，因为人们在研究过程中发现，miRNA和靶基因间的作用具有一定规律性。 因此，目前的预测方法虽然各不相同，但主要遵循以下几个常用原则(Krek,A. 等,Nat Genet.2005,37:495-500;Lall,S.等,Curr Biol.2006,16:460-71;Lewis,B.P. 等,Cell.2005,120:15-20；Kiriakidou,M.等,Genes Dev.2004,18:1165-78；Kertesz, M.等,Nat Genet.2007,39:1278-84;Miranda,K.C.等,Cell.2006,126:1203-17)：

(1)miRNA与其靶位点的互补性；

(2)miRNA靶位点在不同物种之间的保守性；

(3)miRNA-mRNA双链之间的热稳定性；

(4)miRNA靶位点处不应有复杂二级结构；

(5)miRNA的5'端与靶基因的结合能力强于3'端。

然而，使用计算机预测动物中miRNA靶基因是一件十分困难的事情，这主 要是因为动物细胞中miRNA和其靶基因采取非完全互补的模式。目前已知的 miRNA靶基因及其确切的靶点并不多，在算法编写过程中没有足够的已知样本 可参考，即使不断增加和改进限制条件，也难以获得同时具有高特异性和高灵 敏度的算法。并且，目前对计算机预测出来的靶基因也没有一个快速的高通量 鉴定方法，这也在很大程度上影响了对算法准确性的评估，因而无法对其进行 优化。

由于计算机模拟在预测miRNA靶基因时存在一定的局限性，很多学者希望 能够利用生物学实验方法直接寻找miRNA靶基因。生物学实验方法寻找miRNA 靶基因主要有以下几种方式：

(1)从mRNA水平寻找miRNA靶基因(Lim,L.P.等,Nature.2005,433:769- 773)，通过miRNA影响mRNA的稳定性来寻找miRNA的靶基因。但是，该方法 存在不能区分是直接靶基因还是间接靶基因的缺点。同时，这种方法在寻找起 翻译抑制作用的miRNA靶基因时存在困难；

(2)从miRNA结合的复合体入手寻找靶基因。由于miRNA通过和蛋白质形 成复合体的形式和靶基因mRNA结合起作用，所以该方式通过标记miRNA或者 标记复合蛋白，使用共沉淀的方式来寻找miRNA的靶基因(Beitzinger,M.等, RNA Biol.2007,4:76-84;Ulf Andersson Orom等,Cell.2008,30:460-471；Hafner, M.等,Cell.2010,141:129-141；Chi,S.W.等,Nature.2009,460:479-86)。该方式 可以得到特定miRNA或者全部miRNA的靶序列，但是往往得到的是一种非体内 真实情况的结果，这是因为实验往往采用以过表达miRNA进入细胞的方式进 行，而且非特异性结果非常多，影响了对真实靶基因的确定；

(3)从蛋白质水平寻找miRNA靶基因。研究表明miRNA主要在翻译水平对 靶基因起调控作用，所以很多学者研究蛋白水平的改变来寻找miRNA的靶基因 (Selbach,M.等,Nature.2008,455:58-63;Baek,D.等,Nature.2008,455:64-71)。 该方式和上述的方式(1)一样，不能区分是直接结果还是间接结果，所以也不能 有效的确定miRNA的靶基因。

综上所述，在miRNA研究中，靶基因的寻找仍然是一个世界性的难题，特 别是对动物体内miRNA真实靶基因的寻找自今还没有一种有效准确的方式 (Daniel,W.T.等,Nucleic Acids Res.2011,39:6845-53;U.A.等,Gene. 2009,451:1-5)。全世界每年在这个领域投入的研究资金和人力很多，但是由于 没有一种有效的靶基因寻找方法，导致虽然每年耗费了大量的人力和财力仍然 收效甚微。

因此，本领域中迫切需要开发出有效的miRNA靶基因鉴定方法或者反向的 靶基因相关的miRNA鉴定方法。

发明内容

本发明的目的之一正是提供了一种新型的靶基因相关的miRNA鉴定技术， 及其在相关的miRNA研究中的新用途。本发明的另一目的是提供这种新型的靶 基因相关的miRNA鉴定技术的作用原理。本发明的又一目的是提供了这种新型 技术在miRNA研究中的用途和实施策略，特别是应用于动物细胞中靶基因相关 miRNA的鉴定。本发明提供的新技术可以特异性回收与靶基因mRNA相结合的 miRNA，并证实这些miRNA可以调控靶基因的表达，该方法可以有效的回收、鉴 定靶向特定基因mRNA的miRNA。本发明的还有一个目的是提供用于该技术的探 针，特别是针对Smad3基因的miRNA回收的特异性核酸探针。

在本发明的一个方面，提供了一种核酸探针，其核苷酸序列是SEQ ID  NO:26。

在本发明的另一个方面，提供了包含上述核酸探针的用于分离和/或鉴定 miRNA的试剂盒或套盒，其中所述miRNA能与细胞中特定的靶基因mRNA特异 性结合，所述靶基因是Smad3基因，所述试剂盒或套盒中还包含：

(i)细胞交联试剂；

(ii)RNA提取试剂；

(iii)解交联剂；

(iv)核酸探针偶联物回收试剂；

(v)miRNA分离和/或鉴定试剂。

在本发明的另一个方面提供了从细胞中回收和/或鉴定miRNA，用于靶基因 mRNA的检测的方法，所述靶基因是Smad3基因mRNA，其中所述miRNA能与 细胞中所述靶基因mRNA特异性结合，其特征在于，所述方法包括：

(a)使得上述核酸探针进入细胞并与所述靶基因mRNA结合；

(b)对所述细胞进行交联，以使得连接有所述核酸探针的所述靶基因 mRNA和与之特异性结合的miRNA保持结合状态；

(c)从所述细胞中回收核酸探针-靶基因mRNA结合物、核酸探针-靶基因 mRNA-miRNA结合物；

(d)对步骤(c)的回收产物进行解交联；

(e)分离和/或鉴定与所述靶基因mRNA特异性结合的miRNA。

在该方面的一个优选例中，核酸探针进入细胞是通过电刺激、化学方法或 机械方法实现的，优选化学刺激法、脂质体介导法、电击法、电穿孔、激光致 孔或DEAE一葡聚糖介导，更优选脂质体介导法。

在该方面的还有一个优选例中，所述交联的方式选自：紫外线交联、多聚 甲醛交联或它们的组合，优选多聚甲醛交联。

在该方面的一个优选实施方式中，在步骤(b)和(c)之间还包括破碎细胞。

在该方面的一个优选实施方式中，破碎细胞是通过选自下组的方式进行 的：用细胞裂解液裂解、超声波破碎、研磨破碎，优选超声波破碎方式。

在该方面的另一个优选例中，步骤(c)中的所述回收是通过亲和吸附或亲和 层析进行的，所用载体选自：交联琼脂糖凝胶、交联磁珠，优选交联磁珠。

在该方面的另一个优选例中解交联是通过选自下组的一种或多种方式进 行的：用蛋白酶K处理、30～90℃处理、或它们的组合，优选65℃处理。

在该方面的还有一个优选例中miRNA的分离和/或鉴定采用选自下组中的 一种或多种方式进行：miRNA芯片检测、miRNA定量PCR检测、miRNA定量PCR 芯片检测或miRNA大规模测序，优选miRNA定量PCR芯片检测。

在一些实施例中，所述RNA提取试剂包括破碎细胞用的试剂。

在另一些实施例中，所述试剂盒或套盒还包含选自下组中的一种或多种物 质：容器、稀释剂、缓冲剂、破碎细胞用的试剂、说明书。

在本发明的另一个方面，说明书中记载了采用本发明的探针、本发明的试 剂盒或套盒，使用本发明的方法回收和/或鉴定miRNA。

在本发明的又一方面内容中是提供这种新型的靶基因相关的miRNA鉴定 技术的作用原理。靶基因互补的探针可以特异性回收靶基因及其结合的miRNA, 从而为研究特定基因相关的miRNA研究提供了新技术手段。

在本发明的又一方面内容中提供了这种新型的靶基因相关的miRNA鉴定 技术在研究动物细胞中特定基因相关miRNA的用途和实施策略，特别是应用于 哺乳动物细胞株中特定基因相关的miRNA的预防和治疗。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中以下附图显示仅为了图示说明 本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。

图1：本发明的靶基因相关的miRNA鉴定方法的示例性技术路线图；

图2：采用本发明的靶基因相关的miRNA鉴定技术特异性回收靶基因 mRNA：

A：p21基因mRNA的模式图以及探针的结合位点、PCR检测位点；

B：用p21探针在HepG2和PC-3细胞中特异回收p21基因mRNA的检测结果 以及对照探针回收结果的检测情况；

C：STAT3基因mRNA的模式图以及探针的结合位点、PCR检测位点；

D：STAT3探针在HepG2细胞中特异回收STAT3基因mRNA的检测结果以 及对照探针回收结果的检测情况；

E：Smad3基因mRNA的模式图以及探针的结合位点、PCR检测位点；

F：Smad3探针在HepG2细胞中特异回收Smad3基因mRNA的检测结果以及 对照探针回收结果的检测情况；

图3：采用本发明的靶基因相关的miRNA鉴定技术特异性回收与p21基因 mRNA相关的miRNA：

A：用靶基因相关的miRNA鉴定技术特异性回收与p21基因mRNA相关的 miRNA的定量PCR芯片检测结果；

B：与p21基因mRNA相关的miRNA的PCR检测结果；

图4：用靶基因相关的miRNA鉴定技术检测到的与p21基因mRNA相关的 miRNA的功能分析：

A：用靶基因相关的miRNA鉴定技术特异性回收到的与p21基因mRNA相 关的miRNA对p21基因表达影响的荧光报告基因检测结果；

B：用靶基因相关的miRNA鉴定技术特异性回收到的与p21基因mRNA相 关的miRNA对p21基因表达影响的RNA水平以及蛋白水平检测结果；

C：用靶基因相关的miRNA鉴定技术特异性回收到的与p21基因mRNA相 关的miRNA对p21基因功能(细胞增殖)影响的检测结果；

结果显示为平均值±标准差，n=3；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，成功建立了靶基因相关的miRNA鉴定技 术。发明人还将靶基因相关的miRNA鉴定技术应用于动物细胞株，成功鉴定到 与Smad3基因mRNA结合的miRNA，并且证实这些miRNA可以调控Smad3基因 的表达，由此发明人建立了一种全新的miRNA靶向研究技术，从而在此基础上 完成了本发明。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由…… 构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、 “基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括” 的下位概念。

本发明提到的特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭 示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任 何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭 示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

具体而言，miRNA的寻靶研究是分子生物学和细胞生物学研究的热点和难 点，寻找鉴定miRNA靶基因或者鉴定靶基因相关的miRNA的有效技术在功能基 因组研究具有广阔地应用前景。

发明人通过研究发现：生物素标记的DNA探针可以通过杂交的方式特异性 结合与探针互补的mRNA，通过亲合素交联的磁珠可以特异性回收与探针互补 的mRNA片段。设计针对基因Smad3的探针实验表明，在肝癌细胞株HepG2中 Smad3探针可以特异性回收Smad3基因mRNA片段，而不能回收其它基因片段， 对照探针不能回收任何基因mRNA片段。设计针对其它基因如p21、STAT3的探 针得到了相似的结果。综合以上实验，本发明人证实了生物素标记探针可以特 异性结合并回收与探针互补的mRNA片段，该方式对于研究与mRNA片段结合 的物质(例如miRNA)具有广泛和极高的应用价值。

本发明所附的图1中描述了本发明的一种优选实施方式，但本领域普通技 术人员可基于本领域中的常规方法和具体操作的目的，对其中所用的方式、试 剂、步骤等进行相应改变或改进，而并不脱离本发明的精神。例如，可将探针 上的生物素标记物替换为其它标记物；该方法不仅可作用于图中所示的 miRNP，也可作用于尚未结合蛋白质的mRNA-miRNA结合物；等等。

特异性结合靶基因mRNA的miRNA的回收和鉴定方法

本发明提供了一种回收和鉴定特异性结合靶基因mRNA的miRNA的方法， 所述方法通过将特异性针对靶基因mRNA的探针导入细胞内并与该靶基因 mRNA相结合，使得该探针间接地与结合于该靶基因mRNA的miRNA或 miRNP(即结合miRNA的核糖核蛋白复合体)结合，通过对细胞进行交联处理可 稳定该结合，然后从细胞中分离包含探针的结合物，通过解交联该结合物、回 收其中的RNA，通过鉴定即可辨别所获的miRNA。

采用本发明的方法可获得生理状态下，与靶基因mRNA特异性结合的 miRNA，且可同时获得与同一靶基因mRNA结合的多种miRNA，从而为miRNA 的研究和开发、mRNA调控的研究和应用提供了强有力的工具和途径。以往的 研究中大多采用计算机预测的方法或者人为干扰的方法来预测或研究miRNA， 结果往往产生很高的假阳性率，而采用本发明的方式直接得到细胞内mRNA与 miRNA结合的真实情况，具有更高的可信度和准确性。

A.特异性针对靶基因mRNA的核酸探针

在本发明的方法中可采用基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工 合成的寡核苷酸探针等，优选DNA探针。

在本发明的方法中，优选采用带有可用于靶基因mRNA检测和/或分离的标 记物，所述标记物可为放射性标记物或非放射性标记物，优选非放射性标记物(如 荧光标记物)。可用于本发明方法中的放射性标记物可为本领域中常用的放射性 同位素，包括但不限于例如：同位素³²P、³H、³⁵S等，优选³²P应用最普遍。可 用于本发明方法中的非射性标记物包括但不限于，例如：生物素(biotin)和地高 辛(digoxigenin)，二者都是半抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和 素有独特的亲和力，两者能形成稳定复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋 白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。地高辛是一种类固醇半抗原分子， 可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。

为了分离包含探针-靶基因mRNA的结合物(例如探针-靶基因 mRNA-miRNA)，优选在探针上带有生物对成员中的一员，以便于对该结合物进 行亲和层析等方式的分离。可用于本发明探针标记的生物对成员可选自以下生 物对中的一员：受体-配体、抗原-抗体、酶-底物对中的一个成员，例如生物素- 链霉亲和素、生物素-亲和素、生物素-中性亲和素、凝集素-糖类、葡萄球菌A 蛋白-IgG、抗原-抗体、阳离子-阴离子、或激素维生素和脂质与受体中的一种成 员；优选地高辛、生物素、酶(如碱性磷酸酶、辣根过氧化酶)，更优选生物素。

在本发明的一些实施方式中，所用核酸探针中可包含锁核酸(locked nucleic  acid，LNA)。LNA是一种类寡核苷酸衍生物，结构中β-D-呋喃核糖的2'-O、 4'-C位通过缩水作用形成刚性的结构。LNA核苷酸包括A、C、G、T、Μ、mC 六种碱基，一般可见于A-DNA或RNA。这类核酸可以增加引物或探针(probe) 的解链温度(T_m值)，加强这些物质的稳定性，可应用在实时聚合酶连锁反应 (real-time PCR)等技术中。

本领域普通技术人员可根据探针设计原则设计针对特定靶基因mRNA的 探针，或确定是否采用锁核酸及其位置等，或可由专业的商业公司设计、提供 所述探针(例如Premier公司、康成生物公司等)。

可采用本领域中常规的方法，将所述探针分子导入细胞中。这些方法包括 但不限于：电刺激、化学方法或机械方法，优选化学刺激法、脂质体介导法、 电击法、电穿孔、激光致孔或DEAE一葡聚糖介导，更优选脂质体介导法。

B.细胞的交联

如本文所用，术语“细胞交联”或“对细胞进行交联处理”是指：通过物 理或者化学方法(比如紫外线交联、多聚甲醛交联或它们的组合)使细胞中的核酸 -蛋白质或者蛋白质-蛋白质发生共价结合。

在本发明的方法中，待探针进入细胞内并与靶基因mRNA结合后，对细胞 进行交联处理。该处理的目的是：加固miRNA复合物与靶基因mRNA的结合， 使其在回收阶段更加稳定。

可采用本领域中常规的方法对细胞进行交联处理，这些方法包括但不限于： 紫外线交联、多聚甲醛交联或它们的组合，优选多聚甲醛交联。

C.包含探针-靶基因mRNA的结合物的回收

通过探针在细胞内结合靶基因mRNA，可产生包含探针-靶基因mRNA的结 合物，例如探针-靶基因mRNA-miRNA、探针-靶基因mRNA-miRNP、探针-靶 基因mRNA-mRNA结合蛋白等。

可采用本领域中常规方法回收细胞内的这些包含探针-靶基因mRNA的结 合物。例如，可破碎细胞(如采用细胞裂解液裂解、超声波破碎、研磨破碎等方 式)，并依靠探针上的标记物对结合物进行亲和分离(如针对探针上的生物素标记 物，用亲和素标记的磁珠来进行分离结合物)。

D.结合物的解交联及miRNA的分离和鉴定

如本文所用，术语“解交联”是指使得包含探针-靶基因mRNA的结合物中 的miRNA从结合物中释放出来的方法和过程。可采用本领域中的常规方法或已 知方法对回收得到的包含探针-靶基因mRNA的结合物进行解交联，以从中释放 出miRNA。可采用例如：用裂解液和蛋白酶K处理、高温等方法进行解交联。

通过回收解交联产物中的RNA，可获得包含非结合状态的靶基因RNA和 miRNA的混合物。可采用本领域中分离和分离miRNA的常规方法对混合物中 的miRNA进行分离和鉴定。

可用于本发明方法中的miRNA分离和/或鉴定方式包括但不限于：(1) miRNA芯片检测；(2)miRNA定量PCR检测；(3)miRNA定量PCR芯片检测； (4)miRNA大规模测序等等。

通过本发明的方法可同时得到在生理状态下可结合和作用于同一靶基因 mRNA的多种miRNA。本领域普通技术人员可根据需要，采用本领域中的常规 方法对所得的miRNA进行进一步研究和开发。

本发明的优点

本发明的优点主要在于：

(a)本发明揭示了一种新型的研究miRNA靶基因的技术及其应用，尤其是 研究动物细胞中miRNA靶基因的应用；

(b)本发明可以研究体内靶基因结合的miRNA的真实情况，通过该技术可 以研究同一靶基因结合的多种miRNA；

(c)本发明可以得到预测软件通常预测不到的靶基因结合miRNA，为 miRNA研究打开了一扇全新的大门。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的 修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法， 例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA 的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使 用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与 所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较 佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：用标记的探针特异性回收互补基因mRNA

肝癌细胞株HepG2、前列腺癌细胞株PC-3购自中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)。

将1×10³-1×10⁸(优选5×10⁶，本试验中如此使用)个HepG2细胞铺入含20 ml完全培养基(RPMI1640培养基+10%胎牛血清，均购自PAA公司)的10cm板中 并培养过夜，次日采用转染试剂INTERFERin(Polyplus公司)分别转染用生物素 标记的p21探针和对照探针，探针序列如下：P21探针：

生物素-5'-AGAGAGGAAAAGGAGAACACGGGATGAGGAGGCTTTAAA  TAGTATTTCAT-3'(SEQ ID NO:1)

对照探针：

生物素-5'-GCTATGAAGAGATACATTAAGGCTATGAAGAGATACAT  TAAGGCTATGAA-3'(SEQ ID NO:2)

将1×10³-1×10⁸(优选5×10⁶，本试验中如此使用)个PC-3细胞铺入含20ml 完全培养基(RPMI1640培养基+10%胎牛血清，均购自PAA公司)的10cm板中培 养过夜，次日采用转染试剂INTERFERin(Polyplus公司)分别转染生物素标记的 p21探针和对照探针，探针序列如下：

P21探针：

生物素-5'-AGAGAGGAAAAGGAGAACACGGGATGAGGAGGCTTTAAA  TAGTATTTCAT-3'(SEQ ID NO:1)

对照探针：

生物素-5'-GCTATGAAGAGATACATTAAGGCTATGAAGAGATACATTA  AGGCTATGAA-3'(SEQ ID NO:2)

将1×10³-1×10⁸(优选5×10⁶，本试验中如此使用)个HepG2细胞铺入含20 ml完全培养基(RPMI1640培养基+10%胎牛血清，均购自PAA公司)的10cm板 中培养过夜，次日采用转染试剂INTERFERin(Polyplus公司)分别转染生物素标 记的STAT3探针和对照探针，探针序列如下：

STAT3探针：

生物素-5'-AATGCAGGTAGGCGCCTCAGTCGTATCTTTCTGCAGCTT  CCGTTCTCAGC-3'(SEQ ID NO:3)

对照探针：

生物素-5'-GCTATGAAGAGATACATTAAGGCTATGAAGAGATACATTA  AGGCTATGAA-3'(SEQ ID NO:2)

将1×10³-1×10⁸优选5×10⁶，本试验中如此使用个HepG2细胞铺入含20ml 完全培养基(RPMI1640培养基+10%胎牛血清，均购自PAA公司)的10cm板中培 养过夜，次日采用转染试剂INTERFERin(Polyplus公司)分别转染生物素标记的 Smad3探针和对照探针，探针序列如下：

Smad3探针：

生物素-5'-ATGCAACTGACTACATAAACCAATATAGCCGTATGCATCA  GAATCTGGAG-3'(SEQ ID NO:27)

对照探针：

生物素-5'-GCTATGAAGAGATACATTAAGGCTATGAAGAGATACATTA  AGGCTATGAA-3'(SEQ ID NO:2)

转染24小时后收集细胞，按如下步骤回收RNA：

(1)用0.1-10%(优选0.5-5%,本实验中1%)多聚甲醛(formaldehyde)室温固 定细胞1-60(优选5-30分钟,本次实验中10分钟)；

(2)用甘氨酸(glycine)在室温下平衡5分钟；

(3)用预冷的10ml PBS洗三次；

(4)加入0.5-5ml(优选1ml，如该实验)裂解液A(1-100mM，优选10-50 mM,本试验20mM)Tris,pH7.0～9.0,1-5000mM(优选100-1000mM,本试验 500mM)NaCl,1-100mM(优选1-10mM,本试验2.5mM)MgCl₂,0.1-10%(优选 0.5-5%,本试验1%)SDS,Superase-In(Ambion公司)，蛋白酶抑制剂(Roche公 司)，刮下细胞，室温放置1分钟；

(5)按下列模式超声破碎细胞(VCX130,SONICS&MATERIALS公司)： 1-60秒(优选如本试验30秒)间隙；1-60秒(优选如本试验30秒)超声；1-100%(优 选如本试验50%)总功率；超声时间总共1-60分钟（优选如本试验10分钟）；

(6)以10000g在室温下离心10分钟，取上清，取50μl上清作为输入(Input) 对照；

(7)加入链霉亲和素交联的磁珠M-280(Invitogen公司)，4-75℃(优选如本 试验30℃)滚动结合2小时；

(8)去上清，用清洗缓冲液B(1-100mM(优选5-50mM,如本试验中的10 mM)Tris,pH7.0～9.0,1-5000mM(优选100-2000mM,如本试验中的1000mM) NaCl,1-1000mM(优选10-500mM,如本试验中的40mM)EDTA,Superase-In (Ambion公司),蛋白酶抑制剂(Roche公司)洗两次，每次0.5-10ml(优选本试验中 的2ml)；

(9)用清洗缓冲液C(1-100mM(优选5-50mM,如本试验中的10mM)Tris, pH7.0～9.0,1-5000mM(优选10-1000mM,如本试验中的150mM)NaCl, 1-1000mM(优选10-500mM,如本试验中的40mM)EDTA,0.1-10%(优选 0.5-5%,如本试验中的1%)SDS,Superase-In(Ambion公司),蛋白酶抑制剂 (Roche公司)洗两次，每次0.5-10ml(优选本试验中的2ml)；

(10)去上清，加入10-5000μl（优选本试验中的200μl）裂解液A，再加入 1-1000μl(优选本试验中的10μl)蛋白酶K(20mg/ml)，输入对照上清加入 10-5000μl（优选本试验中的150μl）裂解液A，再加入1-1000μl(优选本试验中的 10μl)蛋白酶K(20mg/ml)，10-90℃(优选本试验中的65℃)解交联0.1-10小时(优选 本试验中的1小时)；

(11)加入10-1000μl(优选本试验中的300μl)TRIzol(Invitrogen公司)，提取 RNA；

(12)在37℃下用DNase I(TaKaRa公司)处理30分钟，加入500μl TRIzol (Invitrogen公司)，提取进一步纯化的RNA。

采用反转录PCR(RT-PCR)方法对回收结果进行检测：RT-PCR使用SYBR RT-PCR试剂盒(Takara公司)并在LightCycler(Roche公司)定量PCR仪上完成。

P21基因mRNA的PCR引物：

5'-AAA CTA GGC GGT TGA ATG AG-3'(上游，SEQ ID NO:4)；和

5'-AAA GGA GAA CAC GGG ATG AG-3'(下游，SEQ ID NO:5)。

STAT3基因mRNA的PCR引物为：

5'-CAT GGA GTT GAC CTC GGA GTG-3'(上游，SEQ ID NO:6)；和

5'-TGG CAG AAT GCA GGT AGG C-3'(下游，SEQ ID NO:7)。

Smad3基因mRNA的PCR引物为：

5'-CGT GGG ATG GCA TTT GGT C-3'(上游，SEQ ID NO:27)；和

5'-GCA TCA GAA TCT GGA GCA A-3'(下游，SEQ ID NO:28)。

内参β-肌动蛋白的PCR引物：

5'-CAG CAA GCA GGA GTA TGA CG-3'(上游，SEQ ID NO:8)；和

5'-GAA AGG GTG TAA CGC AAC TAA-3'(下游，SEQ ID NO:9)。

PCR条件为：95℃2分钟；95℃5秒钟，60℃10秒钟，72℃15秒钟，76 ℃荧光检测，40个循环。

PCR结果采用4%琼脂糖凝胶电泳鉴定，HepG2和PC-3细胞中p21探针和对 照探针的回收情况如图2B所示。p21基因mRNA的模式图以及探针的结合位点、 PCR检测位点如图2A所示。STAT3基因mRNA的模式图以及探针的结合位点、 PCR检测位点如图2C所示,HepG2细胞中STAT3探针和对照探针的回收情况如图 2D所示。Smad3基因mRNA的模式图以及探针的结合位点、PCR检测位点如图2E 所示,HepG2细胞中Smad3探针和对照探针的回收情况如图2F所示。

结果显示：p21探针能从HepG2、PC-3细胞中特异性回收p21基因mRNA， 而不会回收β-肌动蛋白基因mRNA，而对照探针则两者都不能回收。HepG2细 胞中，STAT3探针能特异回收STAT3基因mRNA而不能回收β-肌动蛋白基因 mRNA，而对照探针则两者都不能回收。HepG2细胞中，Smad3探针能特异回 收Smad3基因mRNA而不能回收β-肌动蛋白基因mRNA，而对照探针则两者都不 能回收。

实施例2：采用p21探针特异性回收与p21基因mRNA结合的miRNA

采用miRNA定量PCR检测芯片(Exiqon公司)对探针回收的RNA进行检测：

将用P21探针回收的样品和用对照探针回收的样品送上海康成生物工程有 限公司进行miRNA定量PCR芯片检测，使用PCR仪器附带的软件进行初步数据 分析，获得原始的Ct值。

计算每个处理组中的每个通路相关miRNA基因的ΔCt采用如下公式：

ΔCt=平均Ct－外源内参平均Ct；

计算2个处理组PCR芯片中每个基因的ΔΔCt的公式：

ΔΔCt=ΔCt(p21)－ΔCt(对照)。

结果显示：相对于对照探针，p21探针特异性回收了20种miRNA(10倍于对 照探针)，其中有3种miRNA：miR-92a、miR-92b、miR-296-5p倍数大于100倍， 被称为最紧密结合的miRNA(图3A)。

采用反转录PCR(RT-PCR)方法对最紧密结合的miRNA进行检测：RT-PCR 使用All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit(GeneCopoeia公司)，并在 LightCycler(Roche公司)定量PCR仪上完成。

最紧密结合的miRNA的PCR引物为：

miR-92a：

5'-TAT TGC ACT TGT CCC GGC CTG T-3'(上游，SEQ ID NO:10)；和

通用下游引物(试剂盒自带)；

miR-92b:

5'-TAT TGC ACT CGT CCC GGC CTC C-3'(上游，SEQ ID NO:11)；和

通用下游引物(试剂盒自带)；

miR-296-5p:

5'-AGG GCC CCC CCT CAA TCC TGT-3'(上游，SEQ ID NO:12)；和

通用下游引物(试剂盒自带)。

内参U6小核RNA的PCR引物：

5'-GTG CTC GCT TCG GCA GCA CAT ATA C-3'(上游，SEQ ID NO:13)； 和

5'-AAA AAT ATG GAA CGC TCA CGA ATT TG-3'(下游，SEQ ID NO: 14)。

PCR的条件为：95℃10分钟；95℃5秒钟，58℃10秒钟，72℃15秒钟， 76℃荧光检测，40个循环。

PCR结果采用4%琼脂糖凝胶电泳，检测HepG2细胞中p21探针和对照探针 对miRNA的回收情况(参见图3B)。

结果显示：p21探针能特异回收HepG2细胞中与p21基因mRNA最紧密结合 miRNA，而不能回收U6基因mRNA，而对照探针则两者都不能回收。

实施例3：用p21探针特异性回收的miRNA调控p21基因的表达

分别采用如下序列(由上海吉玛公司合成)在HepG2细胞中使得实施例2中 获得的最紧密结合miRNA(miR-92a、miR-92b、miR-296-5p)高表达或抑制表达：

miR-92a模拟物：UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU(SEQ ID NO:15)；

miR-92b模拟物：UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC(SEQ ID NO:16)；

miR-296-5p模拟物：AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU(SEQ ID NO:17)；

小RNA对照：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(SEQ ID NO:18，3'端加TT 突出是小RNA序列合成中常用的修饰方法，对其功能没有影响，主要是起到稳 定核苷酸的作用【Wilda,M.等，Oncogene.2002;21:5176-5124】)；

miR-92a抑制物：2'-O-Me-ACAGGCCGGGACAAGUGCAAUA(SEQ ID NO: 19)；

miR-92b抑制物：2'-O-Me-GGAGGCCGGGACGAGUGCAAUA(SEQ ID NO: 20)；

miR-296-5p抑制物：2'-O-Me-ACAGGAUUGAGGGGGGGCCCU(SEQ ID  NO:21)；以及

抑制物对照：2'-O-Me-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA(SEQ ID NO: 22)。

根据文献报道，采用INTERFERin转染试剂(Polyplus公司)转染小RNA至 HepG2细胞【Hou,J.等，J Immunol.2009；183：2150-2158】，使得miRNA模 拟物转染的终浓度为50nM，miRNA抑制物转染的终浓度为200nM。

采用荧光报告基因法检测实施例2中所得的最紧密结合miRNA对p21基因3' 非编码区(3'-Untranslated Region，3'UTR)的结合情况：

A.包含p21基因3'UTR区的荧光报告载体的制备

包含p21基因3'UTR区的荧光报告载体制备具体如下(所用的限制性内切 酶、PrimerSTAR HS DNA聚合酶均购自Takara公司)：

含有p21基因3'UTR区用以下两个化学合成的片段(引物)经过PCR反应后获 得:

片段1(SEQ ID NO:23，上游引物)：

5'-GAACTAGTAATCCGCCCACAGG-3'；

片段2(SEQ ID NO:24，下游引物)：

5'-TGAAGCTTCTGAGGTAGAACTAGGG-3'

下划线标注处为酶切位点和保护碱基。

所得p21基因3'UTR区共953bp，其序列(SEQ ID NO:25)如下：

AATCCGCCCACAGGAAGCCTGCAGTCCTGGAAGCGCGAGGGCCTCAAAG  GCCCGCTCTACATCTTCTGCCTTAGTCTCAGTTTGTGTGTCTTAATTATTAT  TTGTGTTTTAATTTAAACACCTCCTCATGTACATACCCTGGCCGCCCCCTG  CCCCCCAGCCTCTGGCATTAGAATTATTTAAACAAAAACTAGGCGGTTGA  ATGAGAGGTTCCTAAGAGTGCTGGGCATTTTTATTTTATGAAATACTATTT  AAAGCCTCCTCATCCCGTGTTCTCCTTTTCCTCTCTCCCGGAGGTTGGGTG  GGCCGGCTTCATGCCAGCTACTTCCTCCTCCCCACTTGTCCGCTGGGTGGT  ACCCTCTGGAGGGGTGTGGCTCCTTCCCATCGCTGTCACAGGCGGTTATG  AAATTCACCCCCTTTCCTGGACACTCAGACCTGAATTCTTTTTCATTTGAG  AAGTAAACAGATGGCACTTTGAAGGGGCCTCACCGAGTGGGGGCATCAT  CAAAAACTTTGGAGTCCCCTCACCTCCTCTAAGGTTGGGCAGGGTGACCC  TGAAGTGAGCACAGCCTAGGGCTGAGCTGGGGACCTGGTACCCTCCTGGC  TCTTGATACCCCCCTCTGTCTTGTGAAGGCAGGGGGAAGGTGGGGTCCTG  GAGCAGACCACCCCGCCTGCCCTCATGGCCCCTCTGACCTGCACTGGGGA  GCCCGTCTCAGTGTTGAGCCTTTTCCCTCTTTGGCTCCCCTGTACCTTTTGA  GGAGCCCCAGCTACCCTTTTTCTCCAGCTGGGCTCTGCAATTCCCCTCTGC  TGCTGTCCCTCCCCCTTGTCCTTTCCCTTCAGTACCCTCTCAGCTCCAGGT  GGCTCTGAGGTGCCTGTCCCACCCCCACCCCCAGCTCAATGGACTGGAAG  GGGAAGGGACACACAAGAAGAAGGGCACCCTAGTTCTACCTCAG 

反应体系为：PCR反应体系总体积为25μl，其中5×PrimerSTAR缓冲液5μl, dNTP混合物2μl;模板cDNA0.2μg，PrimerSTAR HS DNA聚合酶0.25μl，上下 游引物各0.5μl，ddH₂O补齐至25μl。

反应参数为：98℃10s，58℃10s，72℃3min，40个循环后72℃延伸10min。 上、下游引物分别引入BamHⅠ和NotⅠ酶切点位。胶回收以上PCR产物、用 BamHⅠ和NotⅠ双酶切之并连入经过同样双酶切的荧光报告载体 pMIR-Report(Ambion公司)中。

B.荧光报告检测

将5×10⁴个HepG2细胞铺入含0.5ml完全培养基(RPMI1640培养基+10%胎 牛血清，均购自PAA公司)的24孔板中培养过夜，次日采用转染试剂JetPRIME (Polyplus公司)共转染100nM终浓度的miRNA模拟物、25ng含p21基因3'UTR区 的荧光报告载体和6ng内参荧光表达载体pRL-TK(Promega公司)；

将2×10⁴个HepG2细胞铺入含0.5ml完全培养基(RPMI1640培养基+10%胎 牛血清，均购自PAA公司)的24孔板中培养过夜，次日采用转染试剂JetPRIME (Polyplus公司)转染200nM终浓度的miRNA抑制物，24小时后用转染试剂 JetPRIME(Polyplus公司)共转染25ng含p21基因3'UTR区的荧光报告载体和6ng 内参荧光表达载体pRL-TK(Promega公司)；

36小时后采用双荧光报告基因检测系统(Dual-Luciferase Reporter Assay  System(Promega公司))进行检测。

结果如图4A所示。该结果显示：与p21基因mRNA最紧密结合的miRNA能 极为显著地抑制含有p21基因3'UTR区的荧光报告基因的表达，而相应的miRNA 抑制物则能显著或极显著地增强含有p21基因3'UTR区的荧光报告基因的表达。

该结果表明：采用本发明的方法鉴定到的、与p21基因mRNA最紧密结合的 miRNA可以和p21基因3'UTR区结合并发挥表达调节作用。

实施例4：检测实施例2中最紧密结合miRNA对HepG2细胞中p21基因表达的影响

A．对mRNA水平的影响的检测

将2×10⁵个HepG2细胞铺入含2ml完全培养基(RPMI1640培养基+10%胎牛 血清，均购自PAA公司)的6孔板中培养过夜，次日换新鲜培养基，采用 INTERFERin转染试剂(Polyplus公司)分别转染50nM终浓度的miRNA模拟物， 200nM终浓度的miRNA抑制物，48小时后分别收集细胞，使用TRIzol(Invitrogen  公司)抽提组织总RNA，进行qRT-PCR(使用SYBR RT-PCR试剂盒(Takara公司) 在LightCycler(Roche公司)实时定量PCR仪上完成)。

P21基因mRNA的PCR引物为：

5'-AAA CTA GGC GGT TGA ATG AG-3'(上游，SEQ ID NO:4)；和

5'-AAA GGA GAA CAC GGG ATG AG-3'(下游，SEQ ID NO:5)。

内参β-肌动蛋白的PCR引物为：

5'-CAG CAA GCA GGA GTA TGA CG-3'(上游，SEQ ID NO:8)；和

5'-GAA AGG GTG TAA CGC AAC TAA-3'(下游，SEQ ID NO:9)。

PCR条件：95℃2分钟；95℃5秒钟，60℃10秒钟，72℃15秒钟，76℃ 荧光检测，40个循环。

PCR结果采用4%琼脂糖凝胶电泳检验，HepG2细胞中与p21最紧密结合的 miRNA高表达或受抑制对p21基因mRNA水平的影响如图4B下图所示。

B．对蛋白质水平的影响的检测

将2×10⁵个HepG2细胞铺入含2ml完全培养基(RPMI1640培养基+10%胎牛 血清，均购自PAA公司)的6孔板中培养过夜，次日换新鲜培养基，采用 INTERFERin转染试剂(Polyplus公司)分别转染50nM终浓度的miRNA模拟物， 200nM终浓度的miRNA抑制物，48小时后分别收集细胞，采用蛋白质印迹法 (Western blot，参考【Wu，S.等,Oncogene.2010;29:2302-2308】)检测其中的p21 蛋白水平，并用β-肌动蛋白为内参，结果如图4B上图所示。

以上结果显示：与p21基因mRNA最紧密结合的miRNA对HepG2细胞中p21 基因mRNA水平影响不大，而主要影响蛋白质的翻译水平：高表达miRNA引起 p21基因蛋白水平的降低，相反miRNA抑制物引起p21基因蛋白水平的升高。

实施例5.检测实施例2中最紧密结合miRNA对HepG2细胞功能的影响

将2×10³个HepG2细胞铺入含0.2ml完全培养基(RPMI1640培养基+10%胎 牛血清，均购自PAA公司)的96孔板中培养过夜，次日采用INTERFERin转染试 剂(Polyplus公司)分别转染50nM终浓度的miRNA模拟物或200nM终浓度的 miRNA抑制物，分别在转染后一天、两天、三天采用CCK-8分析试剂盒(Dojindo 公司)进行细胞增殖检测，结果如图4C所示。

结果显示：与p21基因mRNA最紧密结合的miRNA高表达可以促进细胞的 增殖，而miRNA抑制物可以抑制细胞的增殖。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。