猪小肠复合抗菌肽的制备方法及用途

摘要

本发明公开了一种猪小肠复合抗菌肽的制备方法及用途，本发明先采用绞肉机、胶体磨将猪小肠组织捣碎匀浆、反复冻融，初步破碎细胞。随后进行隔水煮沸热处理，再用乙酸溶液浸提即能获得较多量的抗菌肽。后离心，使杂蛋白的量大大降低，离心所得上清液依次经切向流微滤膜、切向流超滤膜过滤，调节pH值后，再经切向流纳滤膜过滤浓缩和透析除盐，调节渗透压后除菌，即得猪小肠复合抗菌肽。本发明提出的猪小肠复合抗菌肽的用途，运用抗菌肽在粘膜免疫、免疫增强剂、新型抗生素等方面的作用，将抗菌肽用于粘膜免疫起重要功能的猪传染性胃肠炎-流行性腹泻及鸡毒支原体病的防控，及替代传统抗生素，效果显著。

说明书

技术领域

本发明属于畜牧兽医、生物制品、生物制药领域，具体涉及到一种猪小肠 复合抗菌肽的制备方法及用途。

背景技术

抗菌肽是生物机体在抵御病原微生物的防御反应过程中所产生的一类抗 微生物与一些恶性细胞的短肽。有的国际文献中使用“抗微生物肽” （Antimicrobial peptides, AMPs）或“肽抗生素”（peptide antibiotics）。抗菌肽 具有抗菌作用，有些还具有抗原虫、抗真菌、抗病毒和抑制或杀伤肿瘤细胞、 寄生虫等作用。它具有分子量小（3-10 KD）、水溶性好、耐热、无免疫原性等 特点，可成为一种高效、低毒且无残留危害的抗菌、抗病毒和抗癌新药。

目前很多微生物对传统抗生素产生了广泛耐药性，而抗菌肽在经过了几百 万年的进化历程仍保留了其强大的抗菌效力，微生物不易对其产生抗药性。由 于抗菌肽广谱高效的抗菌活性及其独特的抗菌机制，使抗菌肽格外引人关注。

至2003年，意大利Trieste大学抗菌肽数据库收集有28种猪源抗菌肽或者 抗菌肽前体分子，其中来源于猪小肠的抗菌肽或者抗菌肽前体分子有8种：

分子量 抗菌肽种类 具体分子量 3000-8000D 5种 3339D、3910.5D、4720D、5972D、6150D 8000-10000D 3种 8178D、8925D、9341D 10000D以上 1种 19495D

之后陆续又有新的猪小肠抗菌肽被发现，如5972Da猪小肠抗菌肽被马卫 明发现。

由于肠道组织结构复杂，杂蛋白种类繁多，且抗菌肽常常存在于胞浆颗粒 中，其分子量较低，在组织中的含量较低，因而分离和纯化比较困难。以往提 取小分子多肽的方法主要有：有机溶剂抽提法、水浸提法和有机酸抽提法等。 然后离心得到的粗提物含有蛋白质、盐类和其他小分子。下一步分离纯化，方 法包括：过滤层析（介质有Sephadex、Biogel、Sephacryl）、离子交换层析、疏 水交换层析、凝胶电泳以及反相高压液相色谱等。如：有人采用隔水煮沸后酸 提取，离心得到粗提物，依次经Sephadex G-100凝胶柱、Sephadex G-25或Biogel  P10凝胶柱过滤层析，分别将分子大小不等的蛋白质和盐类分开。初步纯化所 得猪小肠抗菌肽粗制品，经10kD超滤离心管除热源，再经3-5KD超滤离心 管做进一步纯化。这些方法操作复杂，要经过多次的分离纯化才能得到抗菌肽， 浪费成本，收率不高，且往往得到的是单一分子量的猪小肠抗菌肽，很难得到 复合抗菌肽。

在膜分离技术中，通常有两种类型的过滤：常规垂直过滤（Normal Flow  Filtration,NFF）和切向流过滤（Tangential Flow Filtration,TFF）。在常规垂直过 滤中，所有的流体直接通过滤膜，被截留的物质堆积膜表面。由于这些物质的 堆积，通过滤膜的流量迅速下降直至完全停止，如图1；而在切向流过滤中， 流体如图2、图3所示十字地流过滤膜。

切向流过滤与常规垂直过滤不同，液体切向流过膜表面，流体产生的跨膜 压力将部分溶液压过滤膜，截留部分则在系统中循环回流。整个过程中液体以 一定速度连续流过滤膜表面，过滤的同时也对滤膜表面进行冲刷，使膜表面不 形成凝胶层，从而使料液中的颗粒不会很快堵塞滤膜，保持了稳定的过滤速度。

微生物对所处的渗透压要求等渗，等渗溶液的渗透压值为280-320 mosm/kg。渗透压值低于此值的溶液称低渗溶液，如蒸馏水等；渗透压值高于 此值的溶液称高渗溶液，如10%的葡萄糖液或50%的葡萄糖液等。微生物处于 高渗溶液中，易发生质壁分离皱缩死亡；相反若处于低渗溶液中，易吸水膨胀 破裂死亡。

申请号为201210305972.2的专利公开了一种猪小肠抗菌肽PR39的制备方 法，其采用超声裂解释放肠粘膜中的蛋白，采用分离柱层析去除大多数的杂蛋 白，获得抗菌肽，该方法从肠粘膜中提取了单一性的PR39抗菌肽，工艺复杂、 收率不高、不适合大规模生产，且所得猪小肠抗菌肽PR39浓度不高。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种猪小肠复合抗菌肽的制备方 法，该方法包括如下步骤：

（1）将新鲜猪小肠用去离子水冲洗干净，去内容物、去浆膜和去脂后用 注射用水彻底冲洗，然后冷冻剪碎，绞肉机初绞1-3次，再用胶体磨匀浆，制 成匀浆液；

本发明所述猪小肠指猪十二指肠、空肠或回肠的任一段或几段；

（2）将所述匀浆液反复冻融3-6次后，100℃隔水煮沸15-25min，然后迅 速冷却后冷藏，冷藏温度为1-4℃，冷藏时间为0-5小时；

（3）在匀浆液中加入浓度为5.00%的乙酸溶液，搅拌浸提，4℃条件进行 第一次离心，将第一次离心的上清液冷冻保存，所述浓度为5.00%的乙酸溶液 用注射用水配制，所述乙酸溶液与匀浆液的体积比为1:1；

（4）在第一次离心的沉淀物中加入浓度为6.67%-5.00%的乙酸溶液，搅拌 浸提，4℃条件进行第二次离心，将第二次离心的上清液冷冻保存，所述浓度 为6.67%-5.00%的乙酸溶液用注射用水配制；

（5）在第二次离心的沉淀物中再加入浓度为8.75%-5.63%的乙酸溶液，搅 拌浸提，4℃条件进行第三次离心，得到第三次离心的上清液，所述浓度为 8.75%-5.63%的乙酸溶液用注射用水配制；

（6）合并上述三次上清液，将合并的上清液经0.1、0.22或0.45um切向 流微滤膜过滤，收集微滤透过物，得到澄清液；澄清液经8或10KD切向流超 滤膜过滤，收集超滤透过物，得到超滤液；调节超滤液pH值至6.5-7.5，得到 猪小肠复合抗菌肽粗制品；

（7）将猪小肠复合抗菌肽粗制品经1或3KD切向流纳滤膜过滤浓缩和透 析除盐，收集纳滤截留物；调节渗透压至280-320mosm/kg，再经0.1um的除 菌过滤器除菌，即得猪小肠复合抗菌肽。

进一步地，步骤（3）、（4）所述冷冻温度为-20℃以下，冷冻时间不超过 30天；步骤（3）、（4）、（5）所述搅拌浸提为搅拌8-14小时，温度为1-6℃； 步骤（3）、（4）、（5）所述离心时间均为15-25min，离心机转速为6000-8000rpm。

进一步地，所述第一次离心沉淀物与乙酸溶液的重量/体积（W:V）为1Kg： 0.6-1L。

进一步地，所述第二次离心沉淀物与乙酸溶液的重量/体积（W:V）为1Kg： 0.4-0.8L。

本发明还要保护采用本制备方法得到的猪小肠复合抗菌肽。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种猪小肠复合抗菌肽的用途，所 述猪小肠复合抗菌肽作为畜禽新型抗生素、免疫增强剂及免疫佐剂使用。

进一步地，所述猪小肠复合抗菌肽单独或与疫苗联合免疫。

进一步地，所述猪小肠复合抗菌肽1-6mL单独或与猪传染性胃肠炎-流行 性腹泻疫苗1-3头份联合免疫每头猪。

进一步地，所述猪小肠复合抗菌肽0.01-0.2mL单独或与鸡毒支原体疫苗 1-3羽份联合免疫每羽鸡。

本发明具有如下有益效果：

本发明先采用绞肉机、胶体磨将猪小肠组织捣碎匀浆、反复冻融，初步破 碎细胞。随后进行隔水煮沸热处理，一方面用热处理方式进一步裂解细胞，使 胞浆中的抗菌肽尽可能多地释放，另一方面使杂蛋白变性，再用乙酸溶液浸提 即能获得较多量的抗菌肽。后离心，使杂蛋白的量大大降低。离心所得上清液 依次经0.1、0.22或0.45um切向流微滤膜、8或10KD切向流超滤膜过滤，即： 采用切向流逐级过滤的方式，工艺简单，生产效率及抗菌肽收率高。调节PH 值后，浓缩及除盐工艺采用1或3KD切向流纳滤膜过滤，比采用旋转蒸发仪 除酸除盐或采用Sephadex G-25、Biogel P10等凝胶柱过滤层析，工艺更高效、 实用，适合规模化生产。随后进行渗透压调节至等渗（280-320mosm/kg），等 渗溶液既有利于减少免疫应激，又有利于所得猪小肠复合抗菌肽与疫苗的联合 免疫。最后经0.1um的除菌过滤器除菌，比采用0.22um的除菌过滤器，更有 利于去除支原体等微生物。

本发明工艺简单高效，所得猪小肠复合抗菌肽浓度高、收率高。

本发明提出的猪小肠复合抗菌肽的用途，运用抗菌肽在粘膜免疫、免疫增 强剂、新型抗生素等方面的作用，将抗菌肽用于粘膜免疫起重要功能的猪传染 性胃肠炎-流行性腹泻及鸡毒支原体病的防控，效果显著。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明

图1为常规垂直过滤示意图；

图2为切向流过滤清扫作用示意图；

图3为切向流过滤示意图。

具体实施方式

实施例1

1、猪小肠复合抗菌肽的制备

（1）将7.5Kg新鲜猪小肠（包括十二指肠、空肠），用去离子水冲洗干净， 去内容物、去浆膜和去脂，用注射用水彻底冲洗干净，冷冻剪碎、绞肉机初绞 2次得到猪小肠胶体；

（2）将上述猪小肠胶体经胶体磨匀浆，制得组织匀浆液3.8L，然后将匀 浆液分装于无热源的瓶子-40℃冷冻，37℃流水解冻，反复冻融3次，将匀浆 液100℃隔水煮沸15min，迅速冷却至4℃；

（3）4℃条件下，将冻融后的3.8L匀浆液与浓度为5.00％的乙酸溶液3.8 L搅拌浸提12小时，搅拌浸提后的混合物于4℃条件8000rpm进行第一次离 心，离心15min，得到第一次上清液4.4L，-20℃保存，所述浓度为5.00%的 乙酸溶液用注射用水配制；

（4）4℃条件下，将第一次离心所得沉淀物3.2Kg与浓度为6.07%的乙酸 溶液2.24L（W:V为1:0.7）搅拌浸提12小时，重复上述离心过程，得到第二 次上清液1.54L，-20℃保存，所述浓度为6.07%的乙酸溶液用注射用水配制；

（5）4℃条件下，将第二次离心所得沉淀物3.9Kg与浓度为7.5%的乙酸 溶液1.95L（W:V为1:0.5）搅拌浸提12小时，再重复上述离心过程，得到第 三次上清液1.32L，所述浓度为7.5%的乙酸溶液用注射用水配制；

（6）合并上述三次离心所得7.26L上清液，将上清液经0.45um微滤膜 过滤、8KD超滤膜过滤，收集超滤透过物，得到超滤液；调节超滤液pH值至 7.0，得到猪小肠复合抗菌肽粗制品；

其中，a.0.45um微滤是将7.26L上清液，经0.45um盒式膜切向流系统 （Millipore公司Pellicon2Durapore0.45um1.0m²膜包）微滤澄清（5倍浓缩）， 得到微滤澄清液5.81L，微滤截留物1.45L再做3倍等体积透析又得到澄清液 4.35L，共得到10.16L澄清液。

0.45um盒式膜切向流系统平均参数如下：

b.8KD超滤是将微滤澄清液10.16L，经8KD盒式膜切向流系统（Millipore 公司Pellicon2Biomax8KD0.5m²膜包）超滤（15倍浓缩），超滤得超滤液 9.48L，超滤截留物0.68L再做3倍等体积透析又得到超滤液2.04L，共得到 11.52L超滤液，调节超滤液pH值至7.0，即为猪小肠复合抗菌肽粗制品。

8KD盒式膜切向流系统平均参数如下：

（7）将猪小肠复合抗菌肽粗制品经1KD纳滤膜过滤浓缩和透析除盐，收 集纳滤截留物；将收集的纳滤截留物的渗透压调节至280mosm/kg后，经0.1um 的除菌过滤器除菌，即得猪小肠复合抗菌肽8.1L。

其中，a.1KD纳滤浓缩和透析除盐是将猪小肠复合抗菌肽粗制品，经1KD 盒式膜切向流系统（Millipore公司Pellicon2PLAC1KD2.0m²膜包）纳滤浓 缩（1.3倍浓缩），收集纳滤截留物8.86L，再以17.72L注射用水为透析液做2 倍等体积透析，共得到8.86L纳滤浓缩透析液，将收集的纳滤浓缩透析液的渗 透压调节至280mosm/kg；

1KD盒式膜切向流系统平均参数如下：

b.0.1um的除菌过滤器除菌是将8.86L纳滤浓缩透析液，经0.1um除菌 过滤器除菌，得猪小肠复合抗菌肽8.1L，质量检验合格。

将实施例1制备的猪小肠复合抗菌肽作为畜禽新型抗生素、免疫增强剂及 免疫佐剂，猪小肠复合抗菌肽0.02mL单独免疫每羽鸡。

2、猪小肠复合抗菌肽的质量检验方法

（1）性状本品为微黄色或淡黄色透明液体；

（2）无菌检验本品按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长；

（3）pH值及渗透压测定本品按现行《中国兽药典》附录进行检验，pH 值应为6.5-7.5，渗透压值应为280-320mosm/kg；

（4）蛋白质定性测定将20%磺基水杨酸2ml与样品2ml混匀，反应后 无浑浊沉淀，反应为阴性；

（5）多肽含量测定本品按福林酚法进行测定，每毫升多肽含量应不低 于2.0mg；

其中福林酚法

试剂

碱性铜溶液溶液Ⅰ进行5倍稀释后与溶液Ⅱ，以50:1的比例混合，混合 后即为碱性铜溶液，此试剂只能用1天，过期失效。

酚溶液

操作法

①、对照品溶液的制备取牛血清白蛋白对照品，加水制成每毫升中含250 ug的溶液。

②、供试品溶液的制备取本品适量，用水进行适当稀释作为供试品溶液。

③、标准曲线的制备取7支试管，精密量取对照品溶液0.0、0.1、0.2、 0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置带塞刻度试管中，各加水至1.0ml，再分别加 入碱性铜溶液5.0ml，摇匀，于室温下放置10min，各加入酚溶液0.5ml，立 即混匀，置室温放置30min，然后于500nm的波长处测定吸收度；同时以不 加标准蛋白试管（0管）中的溶液作为空白对照，以对照品溶液浓度为横坐标， 吸收度为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，相关系数不低于0.99。

④、测定法精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线的制备项下的方法， 自“再分别加入碱性铜溶液”起，以标准曲线中的0管为空白，依法测定吸收 度。根据吸收度从回归方程中求得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数，求出 供试品多肽含量。

（6）核糖含量测定本品按核糖含量测定法进行测定，每毫升核糖含量 不应低于85μg；

核糖含量测定法

试剂

①、5.00%三氯醋酸称取三氯醋酸5g，加蒸馏水溶解成100ml。

②、0.1%三氯化铁—盐酸溶液称取三氯化铁（FeCl₃·6H₂O）0.5g，加 浓盐酸溶解成500ml，可长期使用。

③、1%3,5-二羟基甲苯（苔黑酚）称取3,5-二羟基甲苯1g，溶于100ml 0.1%三氯化铁—盐酸溶液中，临用新配。

操作方法

对照品溶液的制备精密称取D核糖对照品适量，用5.00%三氯醋酸制成 每毫升含核糖20ug的溶液，摇匀。

供试品溶液的制备取本品适量，用5.00%三氯醋酸进行适当稀释作为供 试品溶液。

标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，分别置带塞刻度试管中，各加入5.00%三氯醋酸溶液至2.0ml，再分别加 入1%3,5-二羟基甲苯溶液2.0ml，摇匀，置沸水浴中准确加热30min，迅速冷 却至室温，以0号管为空白，照分光光度法（见现行《中国药典》附录），在 650nm的波长处测定吸收度，以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲 线并进行线性回归，相关系数不低于0.995。

测定法精密量取供试品溶液2.0ml，照标准曲线的制备方法，自“再分 别加入1%3,5-二羟基甲苯溶液2.0ml”起，依法测定吸收度。根据吸收度从回 归方程中求得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数，求出供试品核糖含量。

（7）细菌内毒素测定本品按细菌内毒素检测法进行测定，每毫升内毒 素含量应不超过10EU；

细菌内毒素检测法

采用细菌内毒素检测试剂盒检测。

在37℃温箱中预热所用器具。

将供试品用氯化钠注射液（内毒素＜0.125EU/ml）作10倍稀释，待测。

取稀释后的供试品0.5ml小心加入样品检测管（SPL），并轻轻摇匀。

用无热原的吸管小心地从样品检测管中吸取0.25ml的供试品加入样品阳 性检测管（PPC）轻轻混合60秒，即可。

将完全混匀后的样品检测管和样品阳性检测管放置于37℃培养30min。

倒置样品检测管和样品阳性检测管，观察有无凝集。

当阳性对照检测管（PPC）完全凝集判试验成立。

若样品检测管有凝集反应，说明该稀释度的供试品中内毒素的含量不低于 1.0EU/ml；若样品检测管中无凝集反应，说明该稀释度的供试品中内毒素含量 低于1.0EU/ml。根据稀释度计算原供试品中内毒素含量。

（8）安全检验

热原质检验采用体重1.7-3.0Kg健康家兔（雌兔应无孕）3只，单独饲 养2日，无异常。每隔30min测体温一次，测两次，两次温差不超过0.2℃， 以此两次的体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔，正常体温在 38.0-39.6℃的范围内，且各兔间正常体温之差不超过1℃。试验用的注射器、 针头及一切与本品接触的器皿，应灭热原。家兔在测定其正常体温15min内， 自耳静脉缓缓注入规定剂量（注射量为每公斤体重0.5ml）温热至约38℃的本 品，然后每隔30min测温一次，共测6次，以6次体温中最高的一次减去正常 体温，即为该兔升高的体温（当家兔升温为负值时，均以0℃计）。3只家兔体 温升高的温度均应低于0.6℃，且3只家兔体温升高总和应低于1.4℃。

用鸡检验用1日龄SPF雏鸡10只，将本品用无菌生理盐水稀释10倍后， 每只鸡口服1ml，24小时重复口服一次，观察5日。雏鸡应全部健活，且精神、 采食、饮水、羽毛、粪便应均无异常。

异常毒性检验用体重18-22g健康豚鼠5只，每只小鼠腹腔注射本品0.5 ml，观察7日。小鼠应全部健活，且精神、采食、饮水、羽毛、粪便应均无异 常。

动物过敏检验用体重250-350g健康豚鼠6只，隔日每只每次腹腔注射 本品1.0ml，共三次，进行致敏。然后将其均分为2组，每组3只，分别在首 次注射后第14日和第21日，由肌肉注射本品1.0ml进行攻击。每日观察每只 动物的行为和体征。观察攻击后30min内，动物无竖毛、呼吸困难、抽搐等过 敏反应症状。肌肉注射本品2小时内，不得出现过敏反应。如有竖毛、喷嚏、 干呕、连续咳嗽3声和呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现抽搐、休 克、死亡现象之一者，判本品不符合规定。

实施例2

（1）将150Kg新鲜猪小肠（包括十二指肠、空肠、回肠），用去离子水 冲洗干净，去内容物、去浆膜和去脂，用注射用水彻底冲洗干净，冷冻剪碎、 绞肉机初绞3次得到猪小肠胶体；

（2）将上述猪小肠胶体经胶体磨匀浆，制得组织匀浆液80L，然后将匀 浆液分装于无热源的瓶子-40℃冷冻，37℃流水解冻，反复冻融5次，将匀浆 液100℃隔水煮沸20min，迅速冷却至4℃；

（3）4℃条件下，将冻融后的匀浆液80L与浓度为5.00％的乙酸溶液80L 搅拌浸提10小时，搅拌浸提后的混合物于4℃条件8000rpm进行第一次离心， 离心25min，得到第一次上清液93L，-20℃保存，所述浓度为5.00%的乙酸溶 液用注射用水配制；

（4）4℃条件下，将第一次离心所得沉淀物67Kg与浓度为5.63%的乙酸 溶液53.6L（W:V为1:0.8）搅拌浸提9小时，重复上述离心过程，取得第二次 上清液34L，-20℃保存，所述浓度为5.63%的乙酸溶液用注射用水配制；

（5）4℃条件下，将第二次离心所得沉淀物86Kg与浓度为6.67%的乙酸 溶液52L（W:V为1:0.6）搅拌浸提12小时，重复上述离心过程，得到第三次 上清液32L，所述浓度为6.67%的乙酸溶液用注射用水配制；

（6）合并上述三次离心所得159L上清液；将上清液经0.22um微滤膜过 滤、10KD超滤膜过滤，收集超滤透过物，得到超滤液；调节超滤液pH值至 7.0，制得猪小肠复合抗菌肽粗制品；

其中a.0.22um微滤是将159L上清液，经0.22um盒式膜切向流系统 （Millipore公司CUF-50Durapore0.22um5.0m²膜包）微滤澄清（6倍浓缩）， 得到微滤澄清液133L，微滤截留物26L再做2倍透析又得到澄清液52L，共 得到185L澄清液。

0.22um盒式膜切向流系统平均参数如下：

b.10KD超滤是将微滤澄清液185L，经10KD盒式膜切向流系统 （Millipore公司Pellicon2Biomax10KD2.5m²膜包）超滤（15倍浓缩），超 滤得超滤液173L，超滤截留物12L再做2.5倍等体积透析又得到超滤液30L， 共得到203L超滤液，调节超滤液pH值至7.0，即为猪小肠复合抗菌肽粗制品。

10KD盒式膜切向流系统平均参数如下：

（7）将猪小肠复合抗菌肽粗制品经3KD纳滤膜过滤浓缩和透析除盐，收 集纳滤截留物；将收集的纳滤截留物的渗透压调节至280mosm/kg后，经0.1um 的除菌过滤器除菌，即得猪小肠复合抗菌肽100.3L。

其中，a.3KD纳滤浓缩和透析除盐是将猪小肠复合抗菌肽粗制品，经3KD 盒式膜切向流系统（Millipore公司Pellicon2PLBC3KD2.5m²膜包）纳滤浓 缩（2倍浓缩），收集纳滤截留物101.5L，再以101.5L注射用水为透析液做1 倍等体积透析，共得到101.5L纳滤浓缩透析液，将收集的纳滤浓缩透析液的 渗透压调节至280mosm/kg；

3KD盒式膜切向流系统平均参数如下：

b.0.1um的除菌过滤器除菌是将101.5L纳滤浓缩透析液，经0.1um除菌 过滤器除菌，得猪小肠复合抗菌肽100.3L，质量检验合格。

将实施例2制备的猪小肠复合抗菌肽作为畜禽新型抗生素、免疫增强剂及 免疫佐剂，猪小肠复合抗菌肽4mL与猪传染性胃肠炎-流行性腹泻疫苗2头份 联合免疫每头种猪。

实施例3

（1）将7.5Kg新鲜猪小肠（包括十二指肠、回肠），用去离子水冲洗干净， 去内容物、去浆膜和去脂，用注射用水彻底冲洗干净，冷冻剪碎、绞肉机初绞 1次得到猪小肠胶体；

（2）将上述猪小肠胶体经胶体磨匀浆，制得组织匀浆液3.8L，然后将匀 浆液分装于无热源的瓶子-40℃冷冻，37℃流水解冻，反复冻融6次，将匀浆 液100℃隔水煮沸25min，迅速冷却至4℃；

（3）1℃条件下，将冻融后的3.8L匀浆液与浓度为5.00％的乙酸溶液3.80 L搅拌浸提8小时，搅拌浸提后的混合物于4℃条件7000rpm进行第一次离心， 离心20min，得到第一次上清液4.4L，-20℃保存，所述浓度为5.00%的乙酸 溶液用注射用水配制；

（4）1℃条件下，将第一次离心所得沉淀物3.2Kg与浓度为6.67％的乙酸 溶液1.92L（W:V为1:0.6）搅拌浸提8小时，重复上述离心过程，得到第二次 上清液1.19L，-20℃保存，所述浓度为6.67%的乙酸溶液用注射用水配制；

（5）1℃条件下，将第二次离心所得沉淀物3.93Kg与浓度为8.75%的乙 酸溶液1.57L（W:V为1:0.4）搅拌浸提14小时，再重复上述离心过程，得到 第三次上清液1.03L，所述浓度为8.75%的乙酸溶液用注射用水配制；

（6）合并上述三次离心所得6.62L上清液，将上清液经0.1um微滤膜过 滤、10KD超滤膜过滤，收集超滤透过物，得到超滤液；调节超滤液pH值至 6.5，制得猪小肠复合抗菌肽粗制品；

其中，a.0.1um微滤是将6.62L上清液，经0.1um盒式膜切向流系统 （Millipore公司Pellicon2Durapore0.1um1.0m²膜包）微滤澄清（5倍浓缩）， 得到微滤澄清液5.30L，微滤截留物1.32L再做3倍透析又得到澄清液3.96L， 共得到9.26L澄清液。

0.1um盒式膜切向流系统平均参数如下：

b.10KD超滤是将微滤澄清液9.26L，经10KD盒式膜切向流系统 （Millipore公司Pellicon2Biomax8KD0.5m²膜包）超滤（15倍浓缩），超滤 得超滤液8.64L，超滤截留物0.62L再做3倍等体积透析又得到超滤液1.86L， 共得到10.5L超滤液，调节超滤液pH值至6.5，即为猪小肠复合抗菌肽粗制 品。

10KD盒式膜切向流系统平均参数如下：

（7）将猪小肠复合抗菌肽粗制品经1KD纳滤膜过滤浓缩和透析除盐，收 集纳滤截留物；将收集的纳滤截留物的渗透压调节至290mosm/kg后，经0.1um 的除菌过滤器除菌，即得猪小肠复合抗菌肽6.82L。

其中，a.1KD纳滤浓缩和透析除盐是将猪小肠复合抗菌肽粗制品，经1KD 盒式膜切向流系统（Millipore公司Pellicon2PLAC1KD2.0m²膜包）纳滤浓 缩（1.5倍浓缩），收集纳滤截留物7.00L，再以7.00L注射用水为透析液做1 倍等体积透析，共得到7.00L纳滤浓缩透析液，将收集的纳滤浓缩透析液的渗 透压调节至290mosm/kg；

1KD盒式膜切向流系统平均参数如下：

b.0.1um的除菌过滤器除菌是将7.00L纳滤浓缩透析液，经0.1um除菌 过滤器除菌，得猪小肠复合抗菌肽6.82L，质量检验合格。

将实施例3制备的猪小肠复合抗菌肽作为畜禽新型抗生素、免疫增强剂及 免疫佐剂，猪小肠复合抗菌肽0.05mL单独或与鸡毒支原体疫苗1羽份联合免 疫每羽鸡。

实施例4

（1）将7.5Kg新鲜猪小肠（包括十二指肠、空肠、回肠），用去离子水冲 洗干净，去内容物、去浆膜和去脂，用注射用水彻底冲洗干净，冷冻剪碎、绞 肉机初绞1次得到猪小肠胶体；

（2）将上述猪小肠胶体经胶体磨匀浆，制得组织匀浆液3.8L，然后将匀 浆液分装于无热源的瓶子-40℃冷冻，37℃流水解冻，反复冻融6次，将匀浆 液100℃隔水煮沸25min，迅速冷却至4℃；

（3）6℃条件下，将冻融后的3.8L匀浆液与浓度为5.00％的乙酸溶液3.8 L搅拌浸提14小时，搅拌浸提后的混合物于4℃条件6000rpm进行第一次离 心，离心25min，得到第一次上清液4.4L，-40℃保存，所述浓度为5.00%的 乙酸溶液用注射用水配制；

（4）6℃条件下，将第一次离心所得沉淀物3.2Kg与浓度为6.67%的乙酸 溶液1.92L（W:V为1:0.6）搅拌浸提8小时，重复上述离心过程，得到第二次 上清液1.25L，-40℃保存，所述浓度为6.67%的乙酸溶液用注射用水配制；

（5）6℃条件下，将第二次离心所得沉淀物3.9Kg与浓度为6.67%的乙酸 溶液2.34L（W:V为1:0.6）搅拌浸提14小时，再重复上述离心过程，得到第 三次上清液1.50L，所述浓度为6.67%的乙酸溶液用注射用水配制；

（6）合并上述三次离心所得7.15L上清液，将上清液经0.22um微滤膜 过滤、8KD超滤膜过滤，收集超滤透过物，得到超滤液；调节超滤液pH值至 7.5，制得猪小肠复合抗菌肽粗制品；

其中，a.0.22um微滤是将7.15L上清液，经0.22um盒式膜切向流系统 （Millipore公司Pellicon2Durapore0.22um1.0m²膜包）微滤澄清（4倍浓缩）， 得到微滤澄清液5.36L，微滤截留物1.79L再做3倍透析又得到澄清液5.37L， 共得到10.73L澄清液。

0.22um盒式膜切向流系统平均参数如下：

b.8KD超滤是将微滤澄清液10.73L，经8KD盒式膜切向流系统（Millipore 公司Pellicon2Biomax8KD0.5m²膜包）超滤（16倍浓缩），超滤得超滤液 10.00L，超滤截留物0.73L再做2倍等体积透析又得到超滤液1.46L，共得到 11.46L超滤液，调节超滤液pH值至7.5，即为猪小肠复合抗菌肽粗制品。

8KD盒式膜切向流系统平均参数如下：

（7）将猪小肠复合抗菌肽粗制品经1KD纳滤膜过滤浓缩和透析除盐，收 集纳滤截留物；将收集的纳滤截留物的渗透压调节至310mosm/kg后，经0.1um 的除菌过滤器除菌，即得猪小肠复合抗菌肽7.5L。

其中，a.1KD纳滤浓缩和透析除盐是将猪小肠复合抗菌肽粗制品，经1KD 盒式膜切向流系统（Millipore公司Pellicon2PLAC1KD2.5m²膜包）纳滤浓 缩（1.5倍浓缩），收集纳滤截留物7.64L，再以15.28L注射用水为透析液做2 倍等体积透析，共得到7.64L纳滤浓缩透析液，将收集的纳滤浓缩透析液的渗 透压调节至310mosm/kg；

1KD盒式膜切向流系统平均参数如下：

b.0.1um的除菌过滤器除菌是将7.64L纳滤浓缩透析液，经0.1um除菌 过滤器除菌，得猪小肠复合抗菌肽7.5L，质量检验合格。

将实施例4制备的猪小肠复合抗菌肽作为畜禽新型抗生素、免疫增强剂及 免疫佐剂，猪小肠复合抗菌肽3mL单独免疫每头猪。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而 并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上 述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实 施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变 动仍处于本发明的保护范围之列。