环境胁迫下中华绒螯蟹离水回避反应的测试装置与使用方法

摘要

本发明公开的环境胁迫下中华绒螯蟹离水回避反应的测试装置，其包括：箱体；设置在箱体内的回避台，铺设在箱体的箱底面上兼具注气、注药和注水功能的注入装置；该注入装置通过管道和阀门与气泵、储水罐、储药罐连接；在箱体上方悬挂有一摄像装置，摄像装置通过视频线与电脑连接。本发明还公开了该测试装置的使用方法。本发明采用气流注药技术，整个注药过程是在箱体外通过气流走向调控药物注入过程，可避免因人为直接往箱体内灌药引起蟹类应激反应（人为干扰使蟹受到惊吓而四处逃窜），导致无法准确判断蟹是因应激反应还是正常避毒策略所致的离水上岸，而且药物能通过管道快速的、均匀的、完全的溶解于水体内，确保测试的精确性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种环境胁迫下中华绒螯蟹离水回避反应的测试装置与使用 方法，具体涉及在重金属、农药等环境污染物以及其它水质因子（包括亚硝 酸盐、氨氮、盐度、PH等）的胁迫下，中华绒螯蟹离水回避反应的测试装置 和使用方法，不仅直接应用于中华绒螯蟹在环境胁迫下的行为反应研究领域， 也是评价有害物质对中华绒螯蟹急慢性毒性效应，探索中华绒螯蟹对不良水 质的承受能力和保护行为，制定中华绒螯蟹养殖用水水质标准不可或缺的工 具。

背景技术

重金属、农药等环境污染物的存在以及其它水质因子（包括亚硝酸盐、 氨氮、盐度、PH等）的高低直接关系到水生生物的生长发育和生存，当这些 环境因子作用于水生生物的感觉系统，可使水生生物产生相应的行为回避反 应。水生动物的的回避行为,是水生动物对外界环境变化产生的一种极其敏 感的保护性反应。人们常利用水生生物的这一特性，借以测试水生生物对不 良环境的回避能力及其初次发生回避的最低浓度（又称回避阈值），应用于渔 业生产水质安全监测与预警和制定渔业用水的水质标准。

基于鱼类在遇到不良水域时，会向安全水域回避这一原理，国内外已研 制出许多鱼类的回避实验装置，Jones（1947）设计了一种管道型鱼类回避装 置；Hogland等（1973）和Wildish等（1977）设计了一种”Y”型分叉鱼类 回避槽装置；Sprague等（1969）设计了一种直式型回避槽；中国水产科学院 长江水产研究所在1977年试制了一种P-T环型回避实验装置。

借助以上回避装置，研究人员已对多种鱼类和虾类在毒性胁迫下的回避 行为反应进行了的研究（Sprague，1965;Warner，1966；侯兰英等，1993； 赵前，1997；陈民山，1999；），同时，王子健（2006）还发明了一种基于水 生生物回避行为的水质在线安全预警系统和方法（已授权专利）。

中华绒螯蟹是我国淡水养殖蟹类的主打品种，有关中华绒螯蟹应对重金 属和农药以及其它不良水质理化因子胁迫的行为、生理生化对策已受到国内 学者的广泛关注。但是，研究发现：与鱼类等水生生物不同，中华绒螯蟹（自 幼蟹起)应对环境胁迫的回避行为不是单一的从污染水域向清洁水域回避，尤 其是在池塘养殖条件下，一旦池塘水域发生恶化，中华绒螯蟹会表现出独特 的回避行为，即离开池水，爬到池岸进行回避。所以，目前国内外所研制的 鱼类回避反应测试装置均不能应用于中华绒螯蟹回避反应的研究。

为此，迫切需要研制一种适用于中华绒螯蟹应对环境胁迫时的回避反应 测试装置。另外，非常值得关注的是，当前关于中华绒螯蟹的毒理（包括重 金属、农药、亚硝酸盐、氨氮等）研究方法均效仿于其它鱼虾蟹等水生生物, 这些研究方法存有明显的不足：在各种环境有害物质对中华绒螯蟹急性毒性、 慢性毒性实验中，将参试的蟹“强行的”（试验蟹不能做出自然回避）置于盛 有试验药物溶液的普通容器中，根据蟹的存活、生长发育及其它生理生态指 标来评估有害物质对中华绒螯蟹的毒性效应，计算相应的半致死浓度（LC₅₀）， 获取有害物质对中华绒螯蟹的安全浓度(SC₅₀)，并以此安全浓度或致毒后中华 绒螯蟹的生理生态变化来作为水域环境监测、预警的指标或直接指导池塘养 殖的用药方案。而事实上，当有害物质达到中华绒螯蟹的“感知”浓度时， 其便会试图回避，离开水体而上岸。所以，研究人员“强行的”将蟹置于药 物溶液中，这溶液很有可能已经达到蟹的“感知”浓度，甚至远远高于蟹的 “感知”浓度，换句话说，在实际的养殖水域或池塘中，中华绒螯蟹在这试 验浓度或低于这试验浓度时就已经离开不良水体上岸进行回避，可见“强行 的”将蟹置于有试验溶液中，不能真正的反应有害物质对中华绒螯蟹的毒性 效应，包括中毒后中华绒螯蟹的行为、死亡及其它生理生态变化，所得的安 全浓度也不能指导于生产。所以，水体中有害物质对中华绒螯蟹的急慢性毒 理研究必须建立在回避反应的研究基础之上。回避反应作为一种基础性的研 究，对完善有害物质对中华绒螯蟹毒性评价方法起到关键作用。

总之，设计一种适用于中华绒螯蟹应对不良环境因子的回避反应测试装 置，不仅直接应用于中华绒螯蟹在环境胁迫下的行为反应研究领域，也是研 究有害物质对中华绒螯蟹急慢性毒性效应，探索中华绒螯蟹对不良水质的承 受能力和保护行为，制定中华绒螯蟹养殖用水水质标准不可或缺的工具。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，针对当前国内缺乏研究中华绒螯蟹回 避行为反应的合适装置以及相应的毒理研究方法和手段不科学等问题，提供 一种能准确测试中华绒螯蟹在不良水质环境下的回避能力和回避阈值的试验 装置和使用方法。本发明具有测试灵敏度高，能达到各项实验指标的要求， 性能良好,且成本低，操作方便适用，易于推广。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

环境胁迫下中华绒螯蟹离水回避反应的测试装置，包括：

一箱体；

设置在所述箱体内的回避台，所述回避台距离所述箱体的箱底面有一定 的高度；

铺设在所述箱体的箱底面上兼具注气、注药和注水功能的注入装置；

一通过第一管道与所述注入装置连接的气泵；在所述第一管道上串接有 第一阀门、第二阀门和第三阀门，在所述第一阀门与第二阀门之间串接一四 通接头，其中第一阀门和第二阀门分别于所述四通接头的第一接口和第二接 口连接，第三阀门与第二阀门之间串接；

一储水罐，所述储水罐上设置有注气口和出水口，所述注气口通过串接 的第二管道和第四阀门连接在所述气泵与第一阀门之间的第一管道上，所述 出水口通过串接的第三管道和第五阀门连接在所述四通接头的第三接口上；

一储药罐，所述储药罐上设置有入气口和出药口，所述入气口通过串接 的第四管道和第六阀门连接在所述四通接头的第四接口上；所述出药口通过 串接的第五管道和第七阀门连接在所述第三阀门与注入装置之间的第一管道 上；

一悬挂在所述箱体上方且对所述箱体内的情况进行观察的摄像装置；

一电脑，所述电脑中的视频信号输入端与所述摄像装置连接。

在本发明的一个优选实施例中，所述摄像装置通过一支撑杆支撑在所述 箱体上方，所述支撑杆固定在所述箱体上。

在本发明的一个优选实施例中，所述回避台为梯形回避台，安装在所述 箱体的箱底面上，该梯形回避台的顶面为平面。

在本发明的一个优选实施例中，所述注入装置由成井字形排列并相互贯 通的PVC管构成，在所述PVC管上开设有若干小孔。

在本发明的一个优选实施例中，所述储水罐上开设有注水口；所述储药 罐上开设有注药口。

在本发明的一个优选实施例中，所述箱体的底部开设有出水口。

所述环境胁迫下中华绒螯蟹离水回避反应的测试装置的使用方法的具体 步骤如下：

（1）在所述箱体内注入一定量的纯净水，使水位不超过所述回避台的顶 面即可；

（2）关闭第四阀门至第七阀门，打开第一阀门至第三阀门，此时气泵产 生的气流经过第一管道并途径第一阀门、第二阀门和第三阀门到达所述箱体 的箱底部的注入装置中，并由注入装置注入到所述箱体内的水体中，空气注 入过程微微搅动所述箱体内的水体；

（3）将参试的中华绒螯蟹放入箱体内，开始暂养与驯化，使中华绒螯蟹 适应和熟悉所述箱体内的生活环境，包括熟悉回避台的位置，利于试验期间 蟹能迅速找到回避区域；

（4）暂养与驯化24小时后，根据试验要求配制不同浓度梯度的药物溶液， 并注入储药罐，同时在储水罐内加满蒸馏水；

（5）打开第六阀门和第七阀门，此时，气泵出来的气流一方面途经第一 管道和第一阀门、第二阀门和第三阀门到达所述箱体的箱底部的注入装置中， 对箱体内的水体进行搅拌，另一方面途径第一管道、第一阀门、四通接头、 第四管道和第六阀门压入储药罐中，将储药罐内的药液由出药口、第五管道、 第七阀门以及第三阀门、第一管道冲入注入装置中，并由注入装置注入到所 述箱体内的水体中；当储药罐内的药液完全冲入箱体内的水体中后，马上关 闭第二阀门和第三阀门，并迅速打开第四阀门和第五阀门以及关闭第六阀门， 此时，气泵出来的气流经过第一管道、第四阀门、第二管道而压入储水罐中， 将储水罐内的蒸馏水由出水口、第三管道、第五阀门、第二阀门、第一管道 和第三阀门冲入注入装置中，并由注入装置注入到所述箱体内的水体中，这 一步骤的主要目的是使用蒸馏水冲洗残留在管道内的药物，确保药物均能到 达箱体内并溶解于水体中，经采集箱体内水溶液测试得知，自使用蒸馏水冲 洗后，箱体内的镉离子浓度基本与原设计浓度一致（正负不超过1%）。

（6）在注药后2小时通过摄像装置和电脑在线记录在回避台上中华绒螯 蟹的数量，并进一步的数理统计，比较中华绒螯蟹在不同药物浓度下的回避 率，测试其对不良环境因子的回避能力；

（7）根据研究结果，进一步设计药物浓度，摸索中华绒螯蟹初次做出回 避的药物浓度，即回避的最低浓度，又称回避阈值。

本发明的药液可以为重金属、农药、亚硝酸盐、PH调节液等。

由于采用了如上的技术方案，本发明采用气流注药技术，整个注药过程 是在箱体外通过气流走向调控药物注入过程，可避免因人为直接往箱体内灌 药引起蟹类应激反应（人为干扰使蟹受到惊吓而四处逃窜），导致无法准确判 断蟹是因应激反应还是正常避毒策略所致的离水上岸，而且药物能通过管道 快速的、均匀的、完全的溶解于水体内，确保测试的精确性。

浓度又称回避闽值

附图说明：

图1为本发明环境胁迫下中华绒螯蟹离水回避反应的测试装置的结构示 意图。

图2为注入装置的结构示意图。

具体实施方式

以下参见附图来进一步描述本发明。

参见图1和图2，图中给出的环境胁迫下中华绒螯蟹离水回避反应的测试 装置包括一个箱体，该箱体是以灰色的塑料板为材料制作一水族箱100，水族 箱100的规格为0.6m（长）×0.4m（宽）×0.3m（高），在水族箱100的一 侧面110与底面120交界处开设一出水口130，由一螺旋开关140控制排水。

将直径为0.5厘米的PVC管230连接成井字形形成一个注入装置200，该 注入装置200长为0.58m，宽为0.38m，在该注入装置200其中一平面上即PVC 管230上钻16个孔210，每个孔210的孔径为0.3cm，之后将注入装置200 铺设于水族箱100的箱底，用防水胶加以固定。除注入装置200的PVC管230 所占据的水族箱100底面外，水族箱100底面其余部分铺设白色塑料板220， 白色塑料板220的厚度与PVC管230的直径一致，为0.5cm，使整个水族箱 100的底面基本平整；

以直径为0.5cm的钢筋为支架，焊接成一个梯台310，梯台310底面的长 宽分别为0.4m和0.3m，顶面的长宽分别为0.2m和0.15m，梯台310高为0.25m。 梯台310的6个面均平整地围上纱窗网320，并加以固定，即完成回避台300 的制作。制作好的回避台300放置于水族箱100内，居中。

制备一个储药罐400和一个储水管500，储药罐400的顶部开设有注药孔 410和入气口420，底部开设有出药口430，注药孔410配有孔塞。

储水罐500的顶部开设有注气孔520和注水口510，底部开设有出水口 530，注水孔510配有孔塞。

注入装置200通过一根管道610连接气泵700，并在管道610上串接有阀 门620、630、640和一个四通接头650，其中四通接头650的一个接头连接阀 门620，另一个接头连接阀门630，阀门640串接在阀门630与注入装置200 之间。

储水罐500顶部的注气孔520通过管道660和阀门670连接在气泵700 与阀门620之间的管道610上，储水罐500底部的出水口530通过管道680 和阀门690连接在四通接头650第三个接头上。

储药罐400顶部的注药孔410通过管道710和阀门720连接在四通接头 650第四个接头上，储药罐400底部的出药口430通过管道730和阀门740 连接在阀门640与注入装置200之间的管道610上。

通过一金属支撑杆810将摄像头820悬挂在水族箱100的上方，摄像头 820通过视频线与电脑830的视频信号输入端连接，这样通过摄像头820和电 脑830就可以对水族箱100内的情况进行观察。金属支撑杆810可以直接固 定在水箱箱100的箱壁上，也可以另外固定。

供制备18个上述环境胁迫下中华绒螯蟹离水回避反应的测试装置用于环 境胁迫下中华绒螯蟹离水回避反应的测试。

中华绒螯蟹回避行为的测试

为介绍回避行为测试装置的使用，本案例将测试中华绒螯蟹幼蟹（体重 2g左右）在不同浓度（0mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L、 1mg/L）镉离子毒性效应下的回避行为，具体测试步骤为：

（1）在18个测试装置的水族箱100内各加50L纯净水，同时各放入健 康的、规格相近（2±0.1g）的中华绒螯蟹幼蟹20只。

（2）关闭18个测试装置中的阀门670、阀门690、阀门720、阀门740， 打开阀门620、阀门630、阀门640，此时18个测试装置的气泵700产生的气 流经过管道610、阀门620、四通接头650、阀门630、阀门640进入到注入 装置200中，并由注入装置200中的PVC管230上的孔210进入水族箱100 内，最终溶解在水族箱100内的水体，整个空气注入过程微微搅动水体。

（3）24小时后，将18个测试装置随机分成6组，每测试浓度3个重复， 分别配制各浓度组的药物浓缩液（6组的浓度分别为0mg/L、25mg/L、125mg/L、 625mg/L、1.25g/L、2.5g/L)，即50L水中应加的药物均溶解于20ml的纯净 水中配置成浓缩药液，并将浓缩药液分别通过18个测试装置中的储药罐400 顶部的注药孔410注入对应测试装置的储药罐400中。同时，通过18个测试 装置中的储水罐500顶部的注水口510往储水罐500内加满蒸馏水（容量为 100ml）。

（4）打开18个测试装置中的阀门720、阀门740，此时，气泵700的气 流一方面通过管道610、阀门620、四通接头650、阀门630、阀门640进入 到18个测试装置中的注入装置200中，并由注入装置200中的PVC管230上 的孔210进入水族箱100内；另一方面通过四通接头650、管道710、阀门720 进入到储药罐400中，将储药罐400中的浓缩药液由储药罐400底部的出药 口430压出，压出的浓缩药液再通过管道730、阀门740、阀门640和管道610 快速地进入到18个测试装置中的注入装置200中，并由注入装置200中的PVC 管230上的孔210进入水族箱100内，均匀的溶解于水族箱100的水体中。 当18个测试装置中的储药罐400中的浓缩药液已基本流完后，马上关闭阀门 630和阀门640，并迅速打开阀门670、阀门690和关闭阀门620，此时气流 经管道610、管道660、阀门670进入到储水罐500中，将储水罐500中的蒸 馏水由储水罐500底部的出水口530压出，压出的蒸馏水通过管道680、阀门 690、四通接头650、阀门720、管道710进入到储药罐400中，再由储药罐 400底部的出药口430、管道730、阀门740、阀门640和管道610快速地进 入到注入装置200中，这一步骤的主要目的是使用纯净水冲洗残留在管道内 的药物，确保药物均能到达水族箱内并溶解于水体中，经测试，自使用纯净 水冲洗后，水族箱内的镉离子基本与原设计浓度一致（正负不超过1%）。

（5）经多次试验确定，注药后2小时内中华绒螯蟹回避反应基本稳定， 所以在2小时后，通过摄像头820拍摄记录的回避台300上蟹的数量，统计 中华绒螯蟹在以上不同浓度镉离子的毒性效应下做出离水回避的百分率，结 果如表1。

表1

（6）获得研究结果：

①采用概率单位—质量浓度对数直线回归法,获得回归方程： y=20.001x+89.057.研究人员可以根据此方程计算不同浓度镉离子下中华绒 螯蟹的回避保护情况。

②运用上述方程，计算得到中华绒螯蟹在重金属镉的胁迫下回避的最低 浓度（即初次发生回避反应的阈值）为0.014mg/L（本实例总共20只蟹参试， 初次出现回避即指回避率为5%时）。

③先前研究人员（李文艳等，2008）在研究镉对中华绒螯蟹急性毒性 试验时所设置的浓度远远高于中华绒螯蟹的“感知”浓度，即所设置的浓度 不能真实反映蟹的存活情况，所获得的安全浓度也失去意义。在此进一步证 实，研究中华绒螯蟹环境耐受能力（存活情况）一定要考虑到其能离水进行 回避这一事实。同时，建议今后可以使用本发明装置进行环境因子对中华绒 螯蟹胁迫研究，更具真实性。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行 业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明 书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下， 本发明还会有各种变化和改进，适用于多种环境因子（包括各种重金属、农 药等环境污染物以及氨氮、亚硝酸盐、PH、盐度等水质因子）胁迫下中华绒 螯蟹的回避能力研究，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本 发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物和等效方法界定。