一种杉木林地优势内生菌根菌的扩繁方法

摘要

本发明公开了一种杉木林地优势内生菌根菌的扩繁方法，属于森林保护技术领域。采用盆栽法对杉木林地优势内生菌根菌进行繁殖，宿主植物为高粱；培养基质为沙：蛭石：土的体积比比例为2：1：1；栽培密度为20株/5L盆，装2.5kg含有杉木林地优势内生菌根菌孢子的基质；施用浓度为30%的Hoagland’s营养液，从出苗起每周灌施一次，每次每盆100mL，第8周起每次每盆200mL，至12周停止灌施。所述的方法能有效繁殖出杉木林地优势内生菌根菌的繁殖体。

说明书

技术领域

本发明属于森林保护领域，尤其涉及一种杉木林地优势内生菌根菌的扩繁 方法。

背景技术

我国人工林面积占全球人工林总面积的近三分之一，居世界首位。但是，我 国人工林目前存在许多重大问题，如病虫为害日益加剧，地力衰退严重，生产 力下降等，严重威胁人工林的建设和森林的可持续经营。为实现我国人工林， 特别是用材林基地的可持续经营，保持森林的生产力和长久健康，亟待开展人 工林森林生态系统中植物、动物、微生物间的相互共生关系，特别是菌根菌类 微生物在森林生态系统的功能，以及利用菌根菌类微生物培育森林树木新方法 的研究。

近百年来，由于化肥具有使用方便、肥效快等优点，化肥的施用对林业生产 作出了巨大的贡献。但化肥作为一种高耗能产品，在使用后造成林业用地严重 衰退，生态环境遭到严重破坏，危及人类健康。菌根菌肥作为一种高效无毒、 绿色无污染的新型生物菌剂，能促进植物对养分、水分的吸收与利用、增强植 物抗病抗逆性、改良土壤、促进生长、提高产量和改善品质。菌根菌一旦与植 物形成共生，在适合条件下长期有效，可以抵抗人工林地力的衰退，促进人工 林健康持续发展。大量研究表明，菌根真菌能促进宿主对土壤中矿质元素P、N、 K、Cu、Zn等元素的吸收，提高宿主根系对根部病菌的抵抗力、增强植物对干 旱、高温和重金属的抗逆性。

目前，许多发达国家，特别是美国和加拿大，已生产出适合不同树木、不 同土壤条件的高效复合菌根菌肥系列产品。美国华盛顿州授权的组织Fungi  Perfecti^R有多种菌根菌剂产品，其中Plant Success^TM Tabs是12种内生和外生菌 根真菌的混合物，该菌剂广泛应用于马尾松、湿地松、桉树、杨树等人工林， 促进树木和根系生长，增强植物抗病抗逆性，提高养分和水分吸收，提高林木 生长量约40%。近年来，我国菌根菌肥生产开发的主要是松树外生菌根真菌 Psolithus tinctorius（Pt）菌剂，由于外生菌根真菌菌剂可以工厂化生产，该类微 生物肥料在我国已成功应用于经济林木育苗、荒山造林等方面。与外生菌根真 菌菌剂相比，我国内生菌根菌(AM)菌剂的生产较困难，生产成本高，在实际生 产中的应用一直受到限制。

菌根菌制剂就是利用菌根真菌的繁殖体，经过人工繁殖，加工配置，形成 一定形状及特性的商业化产品。我国研制的菌根菌剂目前主要是外生菌根菌剂， 有些试验产品在生产上也取得了较好的效果，但内生菌根菌的繁殖、复合菌根 菌剂的研制仍未获得突破性的成果。

我国从20世纪80年代开始开发菌根生物菌剂，进入90年代后发展较快， 主要研制的外生菌根菌纯培养菌丝体Pt菌剂，在林业上应用于松树育苗造林取 得了一定成果，外生菌根菌剂生产应用已初具规模。然而，内生菌根真菌(AM) 尚不能纯培养,其菌剂生产多沿用30年前毛氏纯盆培养法。由于此法费时费工, 效率低,近十几年来人们又相继研究了静止液培法、流动液培法、喷雾液培法等 来生产内生真菌菌剂，但成本很高，限制了其大面积的应用。内生菌根菌的繁 殖成为我国复合菌根菌剂开发的制约因素。

发达国家已对内生菌根菌的繁殖进行了大量的研究，已有多种内生菌根菌 剂产品推向市场。几十年来，他们研究了气雾法培养植物商业生产内生菌根菌 剂，隔离室法培养出高纯度的内生菌根试验材料和接种剂，环流营养液培养植 物法获得感染根、菌丝和孢子的混合物。目前内生菌根菌繁殖主要沿用活植物 根系法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的空白，提供一种有效扩繁杉木林地优势内 生菌根菌的方法，对杉木人工林持续健康经营具有重要意义。

一种杉木林地优势内生菌根菌的扩繁方法，采用盆栽法对杉木林地优势内 生菌根菌进行繁殖，宿主植物为高粱；培养基质为沙：蛭石：土的体积比比例 为2：1：1；栽培密度为20株/5L盆，装2.5kg含有杉木林地优势内生菌根菌 孢子的基质；施用浓度为30%的Hoagland’s营养液，从出苗起每周灌施一次， 每次每盆100mL，第8周起每次每盆200mL，至12周停止灌施。

所述的杉木林地优势内生菌根菌包括：采自杉木林地的优势内生菌根真菌 摩西球囊霉(Glomus mosseae)、根内球囊霉(Glomus intraradices)和光壁无梗囊 霉(Acaulospora laevis)中的一种或几种。

培养后培养基质中摩摩西球囊霉、根内球囊霉、光壁无梗囊霉孢子密度分 别至少达到103个/ml、97个/ml、89个/ml。

采用本发明的繁殖方法能生产出高质量菌剂，对开发杉木的生物菌肥具有 重要意义。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1

宿主植物的筛选

接种前将沙土基质（体积比为1:1）100℃间歇灭菌2次。采用容积为5L塑 料盆作为培养容器，接种前用高锰酸钾消毒。种子用10%（体积分数）的H₂O₂消毒，28℃催芽，70%种子露白即播种。播种时，每盆分别先装2.5kg含有摩西 球囊霉孢子的基质。每种宿主植物设3次重复，共12盆。出苗后1周定苗，每 盆玉米、高粱15株，葱、和三叶草均为20株，试验期间根据需要浇水及Hoagland’s 营养液，三个月后收获，取样用于相关指标测定。

供试的4种宿主植物均能与摩西球囊霉正常共生。但不同的宿主植物对摩 西球囊霉生长的影响差异显著（见表1）。

表1不同宿主植物对摩西球囊霉生长的影响

注：表中数据为平均值；同列数据后不同字母表示经Duncan’s法于P<0.05 水平上的差异显著。

由表1可知，与高粱共生培养后，其孢子密度达到84个·mL^-1，菌丝含量达 到75.7%，侵染率高达86.9%，与其他三种宿主植物相比具有显著性差异。这表 明：高粱对摩西球囊霉的扩繁较为有利。

4种不同宿主植物的生长发育影响不同，其地上部干重、地下部干重、菌根 长和根冠比四个指标均有显著性差异（见表2）。

表2摩西球囊霉对不同宿主植物生物量的影响

注：表中数据为平均值，同列数据后不同字母表示经Duncan’s法于P<0.05 水平上的差异显著。

摩西球囊霉对不同的宿主植物的生长影响各不相同（表2）。高粱处理组的 地上部及地下部生物量都显著高于其他3种宿主植物，玉米组次之，三叶草、 葱较差。由于不同宿主植物地上部和地下部生物量未表现出一致性，导致根冠 比不同。根冠比大小顺序依次为高粱>三叶草=玉米>葱，说明本试验条件下，玉 米、三叶草和葱的生长状况好于高粱。菌根长测定结果表明：各处理组存在差 异，高粱处理组菌根长度显著高于其他3种宿主植物。

实施例2

培养基质的筛选

接种前基质在100℃间歇灭菌两次。将上述实验筛选出的最适宿主植物消毒 后，播种方法同上，每种培养基质设3次重复，共12盆。出苗1周后定苗。试 验期间根据需要浇水及Hoagland’s营养液，三个月后收获，取样用于相关指标 测定。

沙蛭石混合物（1号）：沙：蛭石=3:1（体积比）。沙土混合物（2号）：沙土 体积比为3：1。沙蛭石土混合物（3号）：沙：蛭石：土=2：1：1（体积比）。 不同基质养分含量不同（表3），总体看来各基质的养分都比较贫乏。主要差异 表现在有机质、速效磷和速效钾上。3号培养基质有机质含量较高，1号培养基 质最低。3号培养基质速效磷含量较高，2号基质最低。1号培养基质速效钾含 量较高，2号培养基质最低。3种培养基质的酸碱度相差不大。

表3基质的基本理化性状

不同的培养基对摩西球囊霉生长的影响不同，菌丝含量、泡囊和丛枝等相关 指标差异显著（见表4）。

表4不同培养基质对摩西球囊霉生长发育的影响

注：表中数据为平均值；同列数据后不同字母表示经Duncan’s法于P<0.05 水平上的差异显著。

由表4可以看出，摩西球囊霉的菌丝含量、侵染率和孢子密度明显受到了培 养基质的影响。3号培养基质的菌丝含量、侵染率和孢子密度均达到了最大值， 分别为80.3%、87.4%和88个·mL^-1。

不同培养基对高粱的生长发育影响不同，其地上部干重、地下部干重、菌根 长和根冠比四个指标均有显著性差异（见表5）。

表5不同基质处理对宿主高粱生物量的影响

注：表中数据为平均值；同列数据后不同字母表示经Duncan’s法于P<0.05 水平上的差异显著。

不同培养基质对于摩西球囊霉处理下的宿主高粱的生长状况也表现出一定 的差异（表5）。摩西球囊霉与3号培养基质组合处理下高粱的地上部、地下部 干重和菌根长度均显著高于其他处理，分别为16.19g·盆^-1、2.03g·盆^-1和98.25cm· 盆^-1。由于地上部及地下部生物量不一致,根冠比发生变化,而3号基质处理的高 粱的根冠比最小，说明3号基质最有利于高粱的生长。菌根长度测定结果表明： 3号处理菌根长度显著高于其他处理，1号培养基质最低。

实施例3栽培密度的筛选

以筛选出来的最适宿主植物及培养基质接种，设10株/盆、20株/盆、40株 /盆和60株/盆的播种密度处理，每处理重复3次。播种方法同上，出苗1周后 定苗。试验期间根据需要浇水及Hoagland’s营养液。三个月后收获，取样用于 相关指标测定。

栽培密度能影响摩西球囊霉的生长。不同的栽培密度，其影响效果差异显 著（见表6）。

表6不同栽培密度对摩西球囊霉生长的影响

注：表中数据为平均值；同列数据后不同字母表示经Duncan’s法于P<0.05 水平上的差异显著。

由表6可知，栽培密度能够调节菌丝含量、侵染率和孢子密度。当栽培密 度为20株/盆时，其菌丝含量81.6%、菌根的侵染率为88.3%和孢子密度为90 个·mL^-1，显著高于其他处理组。结果还表明：菌丝含量、侵染率和孢子密度在 一范围内随着栽培密度的增加而增大，超过一定范围，随着栽培密度的增加， 菌丝含量、侵染率和孢子密度反而减小。因此，栽培密度可以作为调控手段来 达到在菌剂生产中获得最大数量的侵染根段、菌丝及孢子等繁殖体的目的。

不同栽培密度对宿主高粱的生长影响不同，其地上部干重、地下部干重、 菌根长和根冠比四个指标均有显著性差异（见表7）。

表7不同栽培密度对宿主高粱生物量的影响

注：表中数据为平均值；同列数据后不同字母表示经Duncan’s法于P<0.05 水平上的差异显著。

由表7可知：高粱地上部干重和地下部分干重与栽培密度成正比的关系。 研究表明，植物中同化产物的分配情况和植物的生长状况可以通过根冠比反映 出来，一般情况下根冠比越大，植物生长受到抑制的程度越强。高粱根冠比随 栽培密度的增加而增大，当栽培密度为60株/盆时，根冠比达到了最大值。这表 明：随栽培密度不断增加，物质更多地向根中分配，植物受抑制的程度越明显。

菌根长度测定结果表明：不同栽培密度的高粱菌根长度存在一定差异，当 栽培密度为20株/盆时，菌根最长，达到了98.92cm·盆^-1。同时还表明：菌根长 度起初随栽培密度的增加而增大，当到达一定栽培密度之后，又随之增大而减 少。

实施例4营养液浓度的筛选

对摩西球囊霉筛选出以上最适培养条件后，按同样的方法消毒播种，出苗1 周后定苗。分别设浓度为10%、20%、30%、50%、100%Hoagland‘s营养液共5 个处理，从出苗起每周用不同处理的营养液灌施一次，每次每盆100mL，第8 周起每次每盆200mL，至12周停止灌施，每处理3次重复。试验期间根据需要 浇水。三个月后收获，取样用于相关指标测定。

不同的营养液浓度对影响摩西球囊霉的生长影响不同。菌丝含量、泡囊和丛 枝等相关指标差异显著（见表8）。

表8不同营养液浓度对摩西球囊霉生长的影响

根据表8，菌丝含量、泡囊含量、丛枝含量、菌根侵染率和孢子密度明显受 到施用不同浓度营养液处理的影响，且均表现出基本一致的规律，即低浓度时随 营养液浓度的增加而增加，达到一定水平后又随着营养液浓度的增加开始下降。 在本试验条件下，追施30%浓度的营养液最有利于摩西球囊霉的生产、繁殖。这 表明通过人工调控的方法可以改善菌根共生体中真菌的生长状况和繁殖体数量。

不同营养液对宿主高粱的生长发育影响不同，其地上部干重、地下部干重、 菌根长和根冠比四个指标均有显著性差异（见表9）。

表9不同营养液浓度对宿主高粱生物量的影响

注：表中数据为平均值；同列数据后不同字母表示经Duncan’s法于P<0.05 水平上的差异显著。

由表9结果表明：不同的营养液浓度一定程度上影响了高粱各部分生物量， 随着浓度的增大，地上部和地下部干重也随之增大，在浓度由30%增加到100%， 地上部和地下部急速增加。高粱根冠比则表现出与营养液浓度呈反比的关系，根 冠比最小的是100%浓度营养液处理组。实验结果表明：在养分胁迫的条件下， 高粱的生长状况随着施用营养液强度的增加而逐步得到改善，其生长受抑制的程 度也相应地逐步得到缓解。

菌根长度测定结果表明：追施浓度为30%的营养液菌根长度最长，追施100% 的浓度菌根长度最短。这表明，根系的生长发育受到宿主植物的营养状况的影响。 因此，通过调节营养液的强度，可以调控宿主植物根系的生长。

采用本发明的方法繁殖出的摩西球囊霉菌剂，与传统的方法相比，菌丝含 量、侵染率和孢子密度等指标均提高30%以上。

采用本发明的方法繁殖根内球囊霉(Glomus intraradices)，光壁无梗囊霉 (Acaulospora laevis)，与传统的方法相比，菌丝含量、侵染率和孢子密度等指标 也均提高30%以上。