一种杜梨组培快繁方法

摘要

本发明公开了一种杜梨组培快繁方法，包括外植体的消毒、芽的诱导、试管苗增殖、愈伤组织诱导、生根诱导和炼苗移栽，在生根诱导过程中，先诱导愈伤组织，再诱导生根；获得的生根试管苗，先在三角瓶中炼苗，然后转入珍珠岩驯化炼苗，最后移栽。本发明的方法较常规方法生根率和移栽成活率高，繁殖效率高，成本低，便于推广，遗传稳定性好，适用于杜梨组培快繁。

说明书

技术领域

本发明涉及组织培养技术的植物组织快繁，具体涉及一种杜梨组培快繁方法。

背景技术

梨为蔷薇科(Rosaceae)，梨亚科(Pomoideae)之梨属(Pyrus L．)植物。梨是一种重要 的果树，在我国水果产量中，仅次于苹果、柑橘，居第三位。梨在生产中均采用嫁接繁 殖，砧木是果树嫁接的重要基础，与果树的生产密切相关。优良砧木的筛选具有调节树 势，延长结果年限，甚至调节果实品质等。杜梨（Pyrus betulaefolia Bunge.）是梨主要 砧木之一，由于其适生性强，耐旱，根深、发达、耐瘠薄，抗盐碱能力强，在中性土及 盐碱土中性土中均能正常生长，是我国主要梨砧木，生产中广泛应用。

目前，杜梨繁殖以实生播种为主，由于实生苗具有不同基因型，繁育的苗木生长势、 抗病性、亲和力等方面均存在较大差异。此外，在葡萄、苹果、梨上已有研究表明，嫁 接于不同砧木上接穗的生长势、抗病性、果实品质等也存在较大的差异。因而，生产中 有必要选择基因型一致砧木用于苗木快繁。

对砧木进行无性繁殖，可以获得基因型一致的苗木，通常采用压条、扦插、组织培 养等方式进行无性繁殖，组织培养由于不受季节、环境等因素的影响，被认为是效率最 高的快繁方式。然而木本植物组培快繁普遍存在生根困难、移栽成活率低等问题。为解 决试管苗生根，目前常用方法有以下几种：一是筛选合适生根培养基，在生根培养基上 直接培养，常用生长素有NAA和IBA，单独使用或混合使用，同时通过降低培养基无 机盐浓度和调整基本培养基组成来促进生根。二是瓶外生根，先将试管苗的茎段进行激 素处理后，转到蛭石、珍珠岩、泥炭、苔藓等基质中来完成瓶外生根过程。但是瓶外生 根的生根率比瓶内生根率略低。三是瓶内二次转接生根，先将试管苗的茎段激素处理后， 再转到空白培养基上诱导生根。这些方法在不同植物上都有成功的报道，但是不同植物 采用的培养基配方以及培养方式存在极大差异。

有关梨试管苗生根培养，研究认为培养条件显著影响试管苗生根，对砀山酥梨瓶内 直接生根根数的影响程度大小依次为：IBA>间苯三酚>NAA>基本培养基。BA-29试管 苗生根研究表明，IBA和NAA复合处理优于单一处理。不同基因型间，生根条件存在 较大差异。相同培养条件下，西洋梨矮化砧BA-29、山梨最高生根率在81.59%和83%， 黄花梨生根率仅有4-7.1%，南果梨、黄冠梨、中矮一号、砀山酥梨等生根率均在50% 以下。有关杜梨组培快繁研究相对较少，开展研究杜梨组培快繁技术研究，具有极大的 实用性和必要性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、高效的杜梨组培快繁方法，可提高杜 梨试管苗生根率和移栽成活率，为规模化生产的砧木无性繁殖提供优质的组培试管植 株。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种杜梨组培快繁方法，包括外植体的消毒、芽的诱导、愈伤组织诱导、生根诱导、 炼苗移栽；在组培快繁过程中，进行二步法生根诱导，先在添加NAA的1/2MS培养基上， 暗培养诱导愈伤组织，再转入含IBA的1/2MS培养基上，光暗培养诱导生根。移栽过程 也进行二步驯化，先在三角瓶中敞口驯化，再转到栽培基质上驯化。以此实现提高试管 苗生根率和移栽成活率。

该方法具体包括如下步骤：

（1）外植体的消毒：将杜梨带腋芽的幼茎作为外植体，切段，消毒，无菌水冲洗；

（2）芽的诱导：将经上述处理的外植体切成单芽茎段，接种于不含任何外源植物 激素的MS启动培养基，光照培养25～35d得到无根苗；

（3）试管苗增殖：将无根苗接种于MS增殖培养基上，光照培养25～35d得到试管 丛生苗；

（4）生根诱导：

（4a）愈伤组织诱导：选取健壮的1～3cm高的试管丛生苗切分后转入愈伤组织诱 导培养基中，暗培养7d，诱导产生愈伤组织；

（4b）诱导生根：将上述获得的具有愈伤组织的试管苗，转入生根诱导培养基中， 光照培养25～35d获得生根的试管植株；

（5）炼苗移栽：

将生根的试管植株加水5～10ml，敞口炼苗2～3天，取出组培苗，洗净培养基，每 株留叶2～3片，移入泥炭和珍珠岩基质中，加盖遮阳网，继续炼苗20～25d，然后移栽 定植。

步骤（1）中，对杜梨带腋芽的幼茎用流水冲洗1～2h，剪取3～4cm带芽茎段，在 超净工作台上先以75(v/v)％酒精消毒30s，再用0.1wt％升汞消毒5min，无菌水漂洗4～5 次。

步骤（1）中，所述的幼茎为春季萌发的新梢幼茎。

步骤（2）和（3）中，光照培养条件为：25±2℃、50～60μmol·m^–2·s^–1、12～14h/d。

步骤（4a）中，暗培养条件为：白天温度为25±2℃，夜间温度为20±2℃。

步骤（4b）中，光照培养条件为：白天温度为25±2℃，夜间温度为20±2℃，光照 强度为50～60μmol·m^–2·s^–1，每天光照12～14h。

步骤（2）中，所述的不含任何外源植物激素的MS启动培养基为：MS培养基+25～35 g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉。

步骤（3）中，所述的MS增殖培养基为：MS培养基+0.3～0.6mg/l6-BA+0.1～0.6mg/l NAA+25-35g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉，pH5.8。

步骤（4a）中，所述的愈伤组织诱导培养基为：1/2MS培养基+0.5～2.0mg/l NAA+ 15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉，pH5.8。

步骤（4b）中，生根诱导培养基为：1/2MS培养基+0.5～2.0mg/l IBA+15g/l蔗糖+ 5.0g/L琼脂粉，pH5.8。

步骤（5）中，生根的试管植株生在三角瓶中，加水5～10ml，去除封口膜，先进行 2～3d的敞口炼苗即一次炼苗，取出组培苗，洗净培养基，每株留叶2～3片，移入泥炭 和珍珠岩基质中，加盖遮阳网进行二次炼苗20～25d，然后移栽定植。

步骤（5）中，泥炭和珍珠岩基质中，泥炭和珍珠岩的质量比为4：1。

有益效果：本发明的优点在于：

（1）提高了杜梨试管苗快繁效率。本发明较常规方法处理，大幅提高杜梨试管苗 生根率和移栽成活率。杜梨采用普通方法诱导生根率低，本发明的生根率较常规处理生 根率提高50%。此外，杜梨采用常规方法，进行单次驯化移栽，成活率低，本发明的移 栽成活率达到90%，较常规方法提高了40%。

（2）降低了试管苗繁育成本。本发明提高了杜梨试管苗育苗效率，相应降低了培 养过程中产生的人工及试剂耗材成本。

（3）扩大了繁殖系数，加快了育苗进程。本发明的繁殖速度快，苗生长整齐。

（4）缩短了杜梨选优育苗的周期。目前南方主产区梨主要采用杜梨品种为砧木， 都是采用实生播种后，2年后再进行根接。由于种子后代基因具有高度杂合性，很难对 筛选出优质抗生单株进行大规模生产。本发明可以大大缩短杜梨育苗周期，并且可以选 择优良单株或类型进行大规模工厂化生产。

（3）以茎段作为外植体，通过芽的增殖进行快速繁殖，保证了遗传的稳定性，并 且取材容易，更新方便。

（4）具有普遍的适用性。本发明的技术方案在蔷薇科植物的快繁育苗中均能适用。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的 本发明。

实施例1：不同生长素对杜梨茎段愈伤组织诱导效果的影响。

本实施例基于MS增殖培养基培养25-35d获得的健壮试管丛生苗茎段，试管丛生苗 的苗高1cm～3cm。

愈伤组织诱导培养配方如下：

处理1：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+0.5mg/L NAA

处理2：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.0mg/L NAA

处理3：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.5mg/L NAA

处理4：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+2.0mg/L NAA

处理5：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+0.5mg/L IBA

处理6：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.0mg/L IBA

处理7：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.5mg/L IBA

处理8：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+2.0mg/L IBA

试验方法

将所述的健壮试管丛生苗茎段分成8组，分别在1/2MS+1.5%蔗糖+5.0g/L琼脂 粉并附加不同浓度的IBA和NAA的生根培养基中进行平行试验，具体是：试管苗茎段 接种到培养中后，暗培养7d。各组愈伤组织诱导效果见表1。

表1

由表1可见，IBA和NAA均可以诱导杜梨茎段产生愈伤组织，且承着浓度的升高 愈伤组织诱导率越高。但从作用效果来看，NAA诱导效果更好，0.5mg/L的NAA处理 可以得到98.5%的愈伤组织诱导率，而相同浓度下IBA愈伤组织诱导率仅有55.3%。 1.0～2.0mg/L的NAA处理，愈伤组织诱导率均可达到100%。IBA处理下，2.0mg/L处 理下诱导率最高也仅有76.4%的茎段产生诱伤组织。可见，NAA对杜梨试管苗茎段愈伤 组织诱导效果优于IBA。

实施例2：不同配方的生根培养基对生根效果的影响。

本实施例基于MS增殖培养基培养25-35d获得的健壮试管丛生苗茎段，试管丛生苗 的苗高1cm～3cm。

生根培养基配方如下：

处理1：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+0.5mg/L NAA

处理2：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.0mg/L NAA

处理3：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.5mg/L NAA

处理4：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+2.0mg/L NAA

处理5：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+0.5mg/L IBA

处理6：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.0mg/L IBA

处理7：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.5mg/L IBA

处理8：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+2.0mg/L IBA

处理9：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.5mg/L NAA+1.5mg/L IBA

处理10：1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+2.0mg/L NAA+2.0mg/L IBA

试验方法

将所述的健壮试管丛生苗茎段分成10组，分别在1/2MS+1.5%蔗糖+5.0g/L琼脂 粉并附加不同浓度的IBA和NAA的生根培养基中进行平行试验，具体是：先暗培养7d 后，再转入到50～60μmol·m^–2·s^–1，12～14h/d进行光照培养30d。各组生根效果见表2。

表2

由表2可见，随着IBA和NAA浓度的提高，杜梨试管苗生根率逐步升高，且在 2.0mg/L时达到最高，该浓度下IBA和NAA两种生长素下诱导杜梨生根率分别为34.2% 和15.1%。IBA对杜梨的生根效果优于NAA，0.5mg/L的IBA处理，可以得到4.4%的 生根率，但这一浓度下NAA的诱导生根率为0。2.0mg/L的NAA诱导率仅为相同浓度 IBA诱导率的44.2%。从生根条数来看，1.5mg/L的IBA诱导生根最多，达4.4条，0.5mg/L 的IBA诱导生根最少，仅有2.1条，其他处理生根率介于二者之间。从平均根长来看， NAA诱导的根较短，IBA诱导生根相对较长。

实施例3：NAA与IBA复合处理对杜梨生根的影响。

本实施例基于MS增殖培养基培养25-35d获得的健壮试管丛生苗，试管苗的苗高 1cm～3cm。

愈伤诱导培养基

1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.5mg/L NAA

1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉+2.0mg/L NAA

生根培养基

1/2MS+15g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉+1.5mg/L IBA

1/2MS+15g/L蔗糖+5.0g/L琼脂粉+2.0mg/L IBA

试验方法：

将所述的健壮试管苗分成4组，分别在1/2MS+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉并附加 不同浓度的NAA的愈伤组织诱导培养基上暗培养7d，再转到1/2MS+15g/L蔗糖+5.0 g/L琼脂粉并附加不同浓度IBA的生根培养基中培养25-35d。培养条件为：培养温度， 白天温度25±2℃，晚上20±2℃。光培养阶段，50～60μmol·m^–2·s^–1，12～14h/d。各处理 生根效果见表3。

表3

处理 NAA（mg/L） IBA（mg/L） 生根率(%) 1 1.5 1.5 47.6 2 1.5 2.0 53.2 3 2.0 1.5 68.9 4 2.0 2.0 61.3

表3可见，处理3生根率最高，达到68.9%，其次是处理4，达到61.3%，处理1 效果相对较差，达到47.6%。与表1相比，先诱导愈伤再诱导生根，生根率大幅提高， 又以在添加2.0mg/L NAA的愈伤组织培养基上先在诱导愈伤，再诱导生根，效果优于 添加1.5mg/L NAA的效果。在添加1.5mg/LNAA的愈伤诱导培养基上培养7天，再分 别转入添加IBA的生根培养基中培养，IBA浓度升高，生根率稍有升高。而在NAA 2.0mg/L的愈伤组织诱导培养基中培养，再转入生根培养基中培养，随着IBA浓度的提 高，生根率稍有下降。

实施例4：不同驯化方式对杜梨试管苗移栽成活的影响。

本实施例基于生根培养基培养25-35d获得的具根试管苗，试管苗的苗高2cm～5cm， 5-10片叶。

试验方法：

将所述的具根试管苗分成8组，其中4组进行三角瓶内敞口3天炼苗，再移到基质 驯化25d，在基质驯化阶段依据叶片保留数量分为4组，保留叶片数分别为3、4、5和 大于等于6。另外4组直接进行基质移栽驯化，同样依据叶片保留数3、4、5和大于等 于6片分为4组。敞口驯化阶段，每瓶加水10ml，然后取出洗净培养基，移入泥炭土： 珍珠岩=4：1的基质中，扣塑料薄膜，外加盖遮阳网，驯化30d。各处理成活率结果见 表3。

表4

表4可见，试管苗敞口驯化3天后，再进行基质移栽炼苗25天，成活率高于试管 苗直接移栽基质驯化，较直接移栽驯化高出8%-36%，并且基质移栽时叶片留6片以上， 差异更明显。从基质移栽选留叶片数量来看，叶片留4片，移栽成活率最高，而留叶数 量在6片以上，成活率显著降低，较4片叶低10%-14%。

实施例5：

MS启动培养基为：MS培养基+25～35g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉；

MS增殖培养基为：MS+0.3mg/l6-BA+0.1mg/l NAA+30g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉， pH5.8。

愈伤组织诱导培养基：1/2MS培养基+1.5mg/l NAA+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉， pH5.8。

生根培养基为：1/2MS培养基+2.0mg/l IBA+15g/l蔗糖+5.0g/L琼脂粉，pH5.8。

将杜梨新梢的幼茎段作为外植体，流水冲洗2h，剪取3～4cm带芽茎段40段，在 超净工作台上进行外植体消毒，先以75(v/v)％酒精消毒30s，再用0.1wt％升汞消毒5 min，无菌水漂洗5次，切成2～3cm的茎段，接种于不含任何外源植物激素的MS启动 培养基，在25±2℃、50～60μmol·m^–2·s^–1、12～14h/d光照培养30d得到无根苗；

将无根苗接种于MS增殖培养基上，在25±2℃、50μmol·m^–2·s^–1、14h/d光照下培 养，进行芽的诱导与快速增殖，30d得到试管丛生苗；

将增殖培养得到试管丛生苗，切分成1cm～3cm的茎段，转入1/2MS愈伤组织诱 导培养基中，在白天25±2℃，夜间20±2℃的温度下暗培养7d；

经愈伤组织诱导的试管苗茎段，转入生根诱导培养基，在白天25±2℃，夜间20±2℃ 的温度光照强度50μmol·m^–2·s^–1，14h/d光照中培养30d，获得完整的试管植株。

将获得完整植株的试管苗，去除封口膜，敞口炼苗3d，转入栽培基质，浇足水后塑 料薄膜覆盖10d，再加盖一层遮阳网，保湿控温保存，白天据天气情况掀膜通风3-5h， 叶面喷水1-2次，防止失水萎蔫。10d后去除塑料薄膜，保留遮阳网，根据基质干湿情 况适当浇水，20d后可去除遮阳网。

此方法生根率61-69%，试管苗成活率88-91%，培育周期为130d。