氨基酸注射液中胱氨酸、半胱氨酸及其盐的含量测定方法

摘要

本发明涉及一种测定氨基酸注射液中的胱氨酸、半胱氨酸及其盐的含量的方法。该方法包括精密量取被测样品及对照品溶液，加入0.1～1%的焦亚硫酸钠溶液，摇匀，置70～100℃水浴加热10～60分钟，取出，各加甲酸1.5ml及30％过氧化氢溶液1.0ml，摇匀，再于30℃±2℃温度中放置30分钟后加水至刻度，摇匀，取被测样品注入带阳离子交换树脂柱的色谱仪，通过专用流动相A6溶液及专用氢氧化钠再生液进行梯度洗脱与再生平衡，专用衍生试剂茚三酮溶液进行柱后衍生反应，在检测波长为570nm下记录色谱图，按外标法以峰面积计算即得。本发明的有益效果在于：1）分析时间短，节约了检测时间；2）灵敏度高；3）价格低廉，节约了检测成本；4）专属性强。

说明书

技术领域

本发明涉及一种胱氨酸、半胱氨酸及其盐的含量测定方法，尤其涉及一种测定氨基酸注射液中的胱氨酸、半胱氨酸及其盐的含量的方法。

背景技术

胱氨酸是人体内一种非必需氨基酸，它在体内浓度增高被认为是动脉粥样硬化的始动因素，其中，同型半胱氨酸与心血管疾病（冠动脉病变、高血压）、神经系统疾病（脑中风）、糖尿病、肾病、妊娠相关疾病、老年痴呆症等的发生有密切联系。本世纪60年代末期，一些学者注意到患有遗传性高胱氨酸尿症的病人，大多数伴有亚临床心血管病。1976年，Wichen等通过流行病学调查提出同型半胱氨酸是心血管病人一个独立危险因素，但一直未受到人们重视。近年来，通过分子水平研究同型半胱氨酸在心血管发病中的作用已重新引起人们的关注。动物试验表明，应用3％蛋氨酸饮食长期喂养家兔，诱发同型半胱氨酸血症。家兔血中甘油三酯、游离脂肪酸、脂质过氧化物含量均明显升高，病理检查表明主动脉脂肪大量沉积，并发生动脉粥样硬化。Glueck等报道，他们对482例高血脂病人进行分析，18例患者同时伴有血浆同型半胱氨酸含量升高。其中13人患有动脉粥样硬化，发病率为72％，远高于血浆同型半胱氨酸含量正常的高血脂患者。在18例高同型半胱氨酸血症患者的直系亲属中动脉粥样硬化的发病率可达78％。目前关于高同型半胱氨酸血症诱发动脉粥样硬化的机制尚不了解。可能有多方面因素起作用。田学军等报道，同型半胱氨酸可以促进大鼠血管平滑肌细胞增殖，诱导血管平滑肌细胞中新的mRNA生成。另外，同型半胱氨酸可以抑制内皮细胞增殖，促进氧自由基的生成，加速低密度脂蛋白的氧化，并可激活血小板的粘附和聚集。总之，同型半胱氨酸是诱发心血管疾病的一个独立危险因素。

目前，分析氨基酸营养注射液中胱氨酸、半胱氨酸及其盐的含量的方法一般是采用waters衍生法，该方法具有以下不易克服的缺点：1）该方法采用专用的AccQ-FluorTM试剂，由于其处于垄断地位，因此试剂价格比较昂贵；2）在分析时采集胱氨酸、半胱氨酸及其盐的过程中，其他氨基酸也同时被采集，使得分析过程中未知峰较多，被采集的其他物质对胱氨酸、半胱氨酸及其盐的含量分析造成干扰；3）其他被采集的物质同时也影响分析的灵敏度。

发明内容

针对以上不足，本发明提供一种低廉、快速及灵敏度高的测定氨基酸注射液中的胱氨酸、半胱氨酸及其盐的含量的方法。

本发明通过以下方案达到上述目的：

一种氨基酸注射液中胱氨酸、半胱氨酸及其盐的含量测定方法，该方法包括精密量取被测样品及对照品溶液，加入0.1～1%的焦亚硫酸钠溶液0.2ml，摇匀，置70～100℃水浴加热10～60分钟，取出，各加1.5ml甲酸及30％过氧化氢溶液1.0ml，摇匀，再于30℃±2℃温度中放置30分钟后加水至刻度，摇匀，取被测样品注入带阳离子交换树脂柱的色谱仪，通过专用流动相A6溶液及氢氧化钠再生液进行梯度洗脱与再生平衡，专用衍生试剂茚三酮溶液进行柱后衍生反应，在检测波长为570nm下记录色谱图，按外标法以峰面积计算即得。

其中，专用流动相A6溶液的配制为：取二水合柠檬酸三钠12.0g、氯化钠7.6g、柠檬酸6.0g、硼酸1.0g、甲醇120ml、37%盐酸7.78ml、辛酸0.1ml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，调pH值至2.0～4.0。

专用氢氧化钠再生液的配制为：取氢氧化钠18.0g置1000ml量瓶中，加水定容至刻度。

专用衍生试剂茚三酮溶液的配制为：取茚三酮20g、苯酚2g、甲醇600ml，搅拌溶解，再加入钾钠缓冲液（pH5.51）400ml，混匀。

其中，钾钠缓冲液（pH5.51）：取三水乙酸钠272.0g、醋酸钾196.0g，加入400ml水中，边加边搅拌，同时加入200ml乙酸，使其溶解，最后加水定容至1000ml。

进一步的，一种氨基酸注射液中胱氨酸、半胱氨酸及其盐的含量测定方法，包括步骤为：

1）制备对照品溶液：精密称取对照品，加水制成每1ml中含有1mg的对照品溶液；

2）过甲酸氧化处理被测样品及对照品溶液：精密量取被测样品及对照品溶液各1.0ml分别置100ml量瓶中，加入0.1～1%的焦亚硫酸钠溶液0.2ml，摇匀，置70～100℃水浴加热10～60分钟，取出，各加甲酸1.5ml及30％过氧化氢溶液1.0ml，摇匀，再于30℃±2℃温度下放置30分钟后加水至刻度，摇匀；

3）上样、分离及梯度洗脱：分别将被测样品及对照品溶液注入色谱仪，采用专用的流动相A6溶液及专用氢氧化钠再生液进行梯度洗脱及再生平衡，于高温反应器中采用专用衍生试剂茚三酮溶液进行衍生反应，在检测波长为570nm下记录色谱图，按外标法以峰面积计算即得。

其中，色谱仪的色谱条件为：Na+型阳离子交换树脂专用柱；高温反应器温度：130℃；氨基酸分析柱温：72℃；反应器流量：0.25ml/min；流动相A6溶液的流量：0.45ml/min，检测波长为570nm。

优选的，一种氨基酸注射液中胱氨酸、半胱氨酸及其盐的含量测定方法，包括精密量取被测样品及对照品溶液，加入大于产品处方量体积的0.1%的焦亚硫酸钠溶液，摇匀，置80℃水浴加热30分钟，取出，各加入1.5ml甲酸及30％过氧化氢溶液1.0ml，摇匀，再于30℃±2℃温度中放置30分钟后加水至刻度，摇匀，取被测样品注入带阳离子交换树脂柱的色谱仪，通过专用流动相A6溶液及氢氧化钠再生液进行梯度洗脱与再生平衡，以及专用衍生试剂茚三酮溶液进行柱后衍生反应，在检测波长为570nm下记录色谱图，按外标法以峰面积计算即得。其中，专用流动相A6溶液的配制为：取二水合柠檬酸三钠12.0g、氯化钠7.6g、柠檬酸6.0g、硼酸1.0g、甲醇120ml、37%盐酸7.78ml、辛酸0.1ml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，调pH值至2.7。其余溶液（专用氢氧化钠再生液、专用衍生试剂茚三酮溶液及钾钠缓冲液）的配制方法与前述方法相同。

进一步的，一种氨基酸注射液中胱氨酸、半胱氨酸及其盐的含量测定方法，包括步骤为：

1）制备对照品溶液：精密称取对照品，加水制成每1ml中含有1mg的对照品溶液；

2）过甲酸氧化处理被测样品及对照品溶液：精密量取被测样品及对照品溶液各1.0ml分别置100ml量瓶中，加入0.1%的焦亚硫酸钠溶液0.2ml，摇匀，置80℃水浴加热30分钟，取出，各加甲酸1.5ml及30％过氧化氢溶液1.0ml，摇匀，再于30℃±2℃温度下放置30分钟后加水至刻度，摇匀；

3）上样、分离及梯度洗脱：分别将被测样品及对照品溶液注入色谱仪，采用专用的流动相A6溶液及专用氢氧化钠再生液进行梯度洗脱及再生平衡，于高温反应器中采用专用衍生试剂茚三酮溶液进行衍生反应，在检测波长为570nm下记录色谱图，按外标法以峰面积计算即得。色谱仪的色谱条件与前述条件相同。

进一步的，所述阳离子交换树脂柱为K13Na，4.6×175mmNa+型磺酸基强酸性阳离子交换树脂柱，所述的高温反应器为16米长的高温反应螺管，所述按外标法以峰面积计算的计算公式为供试品标示含量（%）=（供试品溶液峰面积/标准品溶液峰面积）×100%。

本发明通过吸入指定体积的经过前处理的样品，并将样品传送到分离柱中，样品中的氨基酸吸附在分离柱的树脂上，当不同的缓冲液在输液单元的传输下进入分离柱时，因溶液的PH值、离子强度、分离柱温度以及各种氨基酸本身的性质不同而使各种氨基酸得以分离，本发明采用专用流动相A6溶液及专用氢氧化钠再生液，使得胱氨酸、半胱氨酸及其盐最先被分离出来，分离后的氨基酸与反应器试剂泵传输过来的茚三酮试剂在高温反应器中发生衍生反应，生成可以被分光光度计（特定波长570nm）检测的有色物质，通过与对比标准样品即可对被测样品中的氨基酸进行定量检测。

本发明的有益效果在于：1）分析时间短，节约了检测时间：本方法的样品处理时间约需要60分钟，数据采集每针需8分钟，而之前常规waters衍生法的样品处理时间需75分钟，数据采集每针需15分钟；2）灵敏度高：本发明方法的检测限约为0.1ng，而之前常规的waters衍生法的检测限约为3ng；3）价格低廉，节约了检测成本：本发明中采用的试剂均是常规试剂，价格低廉，而waters衍生法采用的是专用的AccQ-FluorTM试剂（试剂包），处于垄断地位，故价格较贵；4）专属性强：采用本方法使得胱氨酸、半胱氨酸及其盐最先被采集，采集结束并停止采集后，其他氨基酸被快速洗脱；而之前的常规方法中胱氨酸、半胱氨酸及其盐并非最先被采集，且其他氨基酸也同时被采集，被采集的其他物质容易对胱氨酸、半胱氨酸及其盐的含量分析造成干扰，同时也影响了分析的灵敏度。

本发明采用专用的阳离子交换树脂色谱柱，与每种氨基酸有不同反应，因而不同的氨基酸有不同的分离时间，采用专用流动相A6溶液及专用氢氧化钠再生液进行梯度洗脱与色谱柱的再生平衡，可以快速分析胱氨酸、半胱氨酸及其盐的含量，分析时间短，且专属性强，为单峰，胱氨酸、半胱氨酸及其盐最先被采集，然后其他氨基酸峰均被快速洗脱而不需收集，灵敏度较高，能分析更低浓度的样品。

附图说明

图1-图3是实施例中三次重复测定对照品盐酸半胱氨酸的色谱图。

图4是实施例中测定待测氨基酸注射液中盐酸半胱氨酸及其盐的色谱图。

图5-图7是实施例中三次重复测定对照品胱氨酸的色谱图。

图8是实施例中测定待测氨基酸注射液中胱氨酸及其盐的色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

测定氨基酸注射液中盐酸半胱氨酸及其盐、胱氨酸及其盐的含量

1、配制所需溶液：

配制专用流动相A6溶液：取二水合柠檬酸三钠12.0g、氯化钠7.6g、柠檬酸6.0g、硼酸1.0g、甲醇120ml、37%盐酸7.78ml、辛酸0.1ml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，调pH值至2.7；

配制专用氢氧化钠再生液：取氢氧化钠18.0g置1000ml量瓶中，加水定容至刻度； 

配制钾钠缓冲液（pH5.51）：取三水乙酸钠272.0g、醋酸钾196.0g，加入400ml水中，边加边搅拌，同时加入200ml乙酸，使其溶解，最后加水定容至1000ml；

配制专用衍生试剂茚三酮溶液：取茚三酮20g、苯酚2g、甲醇600ml，搅拌溶解，再加入钾钠缓冲液（pH5.51）400ml，混匀；

2、制备对照品溶液：精密称取对照品，加水制成每1ml中含有1mg的对照品盐酸半胱氨酸溶液及对照品胱氨酸溶液；

3、过甲酸氧化处理待测氨基酸注射液及对照品溶液：精密量取待测氨基酸注射液及两个对照品溶液各1.0ml分别置100ml量瓶中，加入0.1%的焦亚硫酸钠溶液0.2ml，摇匀，置80℃水浴加热30分钟，取出，各加甲酸1.5ml及30％过氧化氢溶液1.0ml，摇匀，再于30℃±2℃温度中放置30分钟后加水至刻度，摇匀；

4、上样、分离及梯度洗脱样品溶液：取20μl样品溶液注入色谱仪，色谱仪的色谱条件为K13Na，4.6×175mmNa+型磺酸基强酸性阳离子交换树脂柱，高温反应器温度：130℃，氨基酸分析柱温：72℃，反应器流量：0.25ml/min，流动相A6溶液：0.45ml/min；氢氧化钠再生液的流速：0.45ml/min；检测波长为570nm，采用之前配制的专用的流动相A6溶液（A管道）及专用氢氧化钠再生液（D管道）进行梯度洗脱及再生平衡，梯度洗脱与再生平衡程序如表1，于16米长的高温反应螺管中采用专用衍生试剂茚三酮溶液进行衍生反应，在检测波长为570nm下记录色谱图，如图4、图8所示；

5、上样、分离及梯度洗脱对照品溶液：分别取20μl对照品盐酸半胱氨酸溶液及对照品胱氨酸溶液注入色谱仪，同步骤4的方法测定，重复三次，在检测波长为570nm下记录色谱图，如图1-图3，图5-7所示。

按外标法以峰面积计算待测氨基酸注射液中胱氨酸及其盐、半胱氨酸及其盐的含量，公式为：供试品标示含量（%）=供试品溶液峰面积/标准品溶液峰面积。

从图1-4可得出，本待测待测氨基酸注射液中盐酸半胱氨酸及其盐的含量为：

644/（(646+645+643)/3）×100%=99.9%。

从图5-8可得出，本待测待测氨基酸注射液中胱氨酸及其盐的含量为：

1210/（(1193+1167+1196)/3）×100%=102.1%。

表1 梯度洗脱与再生平衡程序表

序号时间A%B%C%D%流量（ml / min）1初始100.00000.4522.0100.00000.4532.100.0001000.4546.100.0001000.4556.20100.00000.45619.20100.00000.45719.30100.00000819.50100.00000

（其中，A、B、C、D分别代表分析系统液路的四个管道，流动相A6溶液位于A管道，再生液氢氧化钠位于D管道， B、C两个管道空置。）

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。