一种以透明质酸钠为原料制备可用作栓塞剂的交联透明质酸钠微球的工艺

摘要

本发明提供了一种以透明质酸钠为原料制备可用作栓塞剂的交联透明质酸钠微球的工艺。包括以下步骤：配制浓度为10%~30%g/ml的透明质酸钠碱液凝胶；将透明质酸钠碱液凝胶加到含乳化剂的油相中，再经剪切机高速乳化，乳化速度为500rpm~2000rpm，时间为10~20分钟；加入一定量的交联剂，其中交联剂在油相中质量百分比为0.2~2%，室温下搅拌4~6h进行交联反应，完成后静置过夜；使用水溶性有机溶剂洗涤以除去微球表面残留的油相，最后烘干获得交联透明质酸钠微球。本发明制备工艺简单，所得微球颗粒大小适合常规的血管栓塞，且粒径可控、微球形态完好、易筛分，有一定的弹性和膨胀性，对人体无毒害副作用，具有良好的生物相容性和可降解性，临床安全得到了保证。

说明书

技术领域     

本发明属于介入医学领域，具体地指一种以透明质酸钠为原料制备交联透明质酸钠微球栓塞剂的工艺。

背景技术

目前介入治疗广泛应用于多种疾病的治疗中，涉及到消化、神经、心血管、呼吸、骨科、泌尿、妇科等多个系统疾病的诊断和治疗，尤其恶性肿瘤等常规医疗手段难以治疗的疾病。介入治疗可分为介入化疗、介入热疗、介入冷冻、介入腔内隔离术、血管栓塞等。其中血管栓塞治疗肿瘤疾病是介入治疗的常见手法，其原理是借助高清晰度的医学影像仪引导，经小切口将导管置入人体内的病灶部位，再通过供血动脉灌注抗肿瘤药物或血管栓塞剂来阻断肿瘤组织的供血，使肿瘤在短时间内坏死、萎缩，从而达到治疗的目的，具有操作简单、手术创伤小、合并症少、安全等特点。血管栓塞治疗的关键技术在于选择合适的用于阻断肿瘤组织的供血的栓塞剂。 

透明质酸（Hyaluronic acid、简称HA）最早是从牛眼玻璃体中发现的，随后从人和动物的软结缔组织中以及一些微生物发酵中提取到，HA具有高度粘弹性、可塑性以及良好的生物相容性，是一种生物可吸收材料，且无任何副作用，是在当今医学界深受欢迎的新型生物医学材料，具有很高的医用价值。HA经交联剂化学修饰改性后在分子量增大和抗降解性提高的同时也保留了天然透明质酸原本特有的性质。 

目前应用于临床的栓塞材料较多，常见的如明胶海绵栓塞剂和聚乙烯醇栓塞剂。对现有技术的文献检索发现，目前没有利用乳化聚合的方法制备交联透明质酸钠微球颗粒用于介入栓塞治疗当中。专利WO 2008/100044描述了一种乳液聚合制备交联透明质酸钠水凝胶纳米颗粒的方法，该方法包括油相与水相混合形成油包水型乳液，所述油相含有溶解于其中的表面活性剂，所述的水相含有溶解于碱性水溶液中的透明质酸和水溶性交联剂，以及使所述透明质酸在所述油包水型乳液中交联。该方法采用水相中透明质酸和交联剂混合在碱液中进行初步的交联反应，再与油相混合形成乳液聚合体，在搅拌下进行最后的交联反应。虽然制备出的透明质酸颗粒粒径分布均匀，具有较高的水溶胀比，但颗粒大多分布在纳米级，适合用于改善皮肤组织吸收能力，不适用于介入栓塞治疗；且在水相中初步交联反应时交联剂未能均匀的分散于透明质酸分子间，存在整体交联程度不均一的问题。 

专利EP 2225281描述了一种乳液中交联透明质酸微珠的制备方法，该方法包括（a）提供包含透明质酸或其盐的碱性水溶液与有机相或油相混合形成具有所期望尺寸的微珠；（b）向乳液中加入包含交联剂的溶液，由此透明质酸与所述交联剂发生反应以提供交联的透明质酸微珠；（c）所获得的含微珠的分散体通过中和调节pH或是加入含活性成分、水溶性的赋形剂和/或防腐剂来获得最终发明产品。该方法获得的微珠形态均一，粒径分布在1nm~1μm之间，但最后获得的交联透明质酸微珠未进行有效的油相残留和交联剂残留控制措施，同样不适用于介入栓塞治疗。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种以透明质酸钠为原料制备可用作栓塞剂的交联透明质酸钠微球的工艺。为此，本发明采用以下技术方案： 

它包括以下步骤：

（1）配制浓度为10%~30% g/ml的透明质酸钠碱液凝胶；

（2）将步骤（1）制备的透明质酸钠碱液凝胶加到含乳化剂的油相中，再经剪切机高速乳化，乳化速度为500rpm~2000rpm，时间为10~20分钟；

（3）待步骤（2）乳化完成后加入一定量的交联剂，其中交联剂在油相中质量百分比为0.2~2%，室温下搅拌4~6h进行交联反应，完成后静置过夜，使形成的微球沉降；

（4）去除油相层，使用水溶性有机溶剂洗涤以除去微球表面残留的油相，最后烘干获得交联透明质酸钠微球。

在采用上述技术方案的基础上，本发明还可采用以下进一步的技术方案： 

在本发明中，所使用的透明质酸钠为透明质酸的钠盐形式，其基本结构是由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。透明质酸钠的分子量对所形成的w/o型乳液的粘度有一定的影响，为降低抗原性，步骤（1）中所述的透明质酸钠优选用细菌发酵法生产的透明质酸钠，分子量为50万~200万道尔顿，优选为90万~170万道尔顿。

步骤（2）中所述的油相可以为植物油、矿物油、硅油或合成油中的一种，优选为液体石蜡或十二烷；所使用的乳化剂能阻止分散相的小液滴互相凝结，使形成的w/o型乳液比较稳定，可选自亲水疏水平衡值（HLB值）为3-9的乳化剂，优选HLB值为4~6的乳化剂。这些乳化剂可为失水三梨醇单油酸酯（Span80）、失水三梨醇单硬脂酸酯（Span60）、失水山梨醇单油酸酯（Arlacel80）、或二乙二醇单油酸酯（AtlasG-2139）等。 

步骤（2）中所述的油相中乳化剂质量百分比为0.5~10%，优选为0.5~8%；所述的透明质酸钠碱液凝胶与油相的重量比为1:1~1:20，优选为1:1~1:10。 

在本发明中，步骤（3）中所述的交联剂可选自二乙烯基砜、1,4—丁二醇二缩水甘油醚和环氧化物，优选为1,4—丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）。使用BDDE交联制备的透明质酸钠微球在水溶液中能表现出较高的溶胀比，且BDDE毒性相对较小，市场易采购。 

本发明可通过控制水相中透明质酸钠碱液浓度、水相/油相重量比、乳化速度及交联剂用量来制备不同粒径和不同降解周期的交联透明质酸钠微球。提高透明质酸钠碱液浓度或水相/油相重量比例，使所获得的微球粒径增大；增大乳化速度使微球粒径减小；增加交联剂用量可提高微球在血管内的降解时间。所述的不同粒径可为80~2000μm之间，如150~350μm、350~700μm或更大的如1000~2000μm；所述的不同降解周期可为3d~180d；所述的交联透明质酸钠微球分散于水溶液中时，微球颗粒吸水溶胀，从而使颗粒粒径大小在短时间内增加。 

在本发明中，制备交联透明质酸钠微球是采用先乳化后交联的方法。待步骤（2）中油水相乳化完成后，形成均匀而稳定的含透明质酸钠微球的w/o型乳液。步骤（3）中加入的交联剂可与乳液中的透明质酸钠微球进行交联反应，优选在室温下搅拌反应4h~6h，达到透明质酸钠微球均匀反应。 

在本发明中，步骤（4）获得的交联透明质酸钠微球需进行洗涤以除去残留的油相，优选的水溶性有机溶剂可为热乙醇、乙醚、丙酮或乙酸乙酯。 

本发明还提供了采用上述工艺制得的交联透明质酸钠微球在制备介入栓塞剂中的应用。 

由于采用本发明的技术方案，本发明采用高浓度透明质酸钠凝胶先乳化后交联的制备工艺，加入的交联剂可与乳液中均匀分布的w/o微球进行交联反应，制备工艺简单，所得的微球颗粒大小适合常规的血管栓塞，且粒径可控、微球形态完好、易筛分，具有一定的弹性和膨胀性，可通过控制水相中透明质酸钠碱液浓度、水相/油相重量比、乳化速度及交联剂用量来制备不同粒径和不同降解周期的交联透明质酸钠微球，提高了临床的选择性和可控性。且交联透明质酸钠对人体无毒害副作用，具有良好的生物相容性和可降解性，临床安全得到了保证。 

附图说明

图1为实施例1所制得的微球在粒径分析仪下干态的视野图。 

图2为实施例1所制得的微球在粒径分析仪下湿态的视野图。 

图3为实施例6的实验装置。 

具体实施方式

以下给出本发明的实施例，进一步对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。 

实施例1 

（1）称取分子量为130万道尔顿的透明质酸钠干粉3.07g，与1%NaOH溶液配制成质量百分浓度为10% g/ml的透明质酸钠碱液凝胶；

（2）取液体石蜡100.05g和Span80 2.03g混匀获得油相，将步骤（1）的透明质酸钠凝胶体缓慢加入到油相中，经搅拌机高速乳化，乳化速度为1000rpm，时间为10min；

（3）待步骤（2）乳化完成后加入1ml交联剂（BDDE），室温下搅拌4h进行交联反应，完成后静置过夜；

（4）倾倒上层油相，并用乙酸乙酯反复洗涤微球表面残留的油相，再用无水乙醇反复洗涤微球除去乙酸乙酯；

（5）将步骤（4）获得的微球放入真空干燥箱，60℃下干燥24h，以除去残留的无水乙醇，最后过筛除去不在范围内的微球。

将制备所得的微球在粒度分析仪下观察并拍摄照片，从图1可见，微球呈规则的球形，粒径在350~1500μm之间； 

精密称取一定量W₁的微球颗粒浸入生理盐水中，至微球达到吸水饱和状态后再次称量W₂，计算得出微球的吸水倍数W₂/W₁=27.19倍；

取部分微球测量其粒径平均值D₁，再将微球浸入生理盐水中，至微球达到吸水饱和状态后再次测量其粒径平均值D₂，计算得出微球的溶胀比D₂-D₁/D₁×100%=21.21%

实施例2

（1）称取分子量为130万道尔顿的透明质酸钠干粉3.02g，与1%NaOH配制成质量百分浓度为15% g/ml的透明质酸钠碱液凝胶； 

（2）取液体石蜡100.12g和Span80 2.04g混匀获得油相，将步骤（1）的透明质酸钠凝胶体缓慢加入到油相中，经乳化机高速剪切乳化，剪切速度为1000rpm，时间为10min；

（3）待步骤（2）乳化完成后加入1ml交联剂（BDDE），室温下搅拌4h进行交联反应，完成后静置过夜；

（4）倾倒上层油相，并用乙酸乙酯反复洗涤微球表面残留的油相，再用无水乙醇反复洗涤微球除去乙酸乙酯；

（5）将步骤（4）获得的微球放入真空干燥箱，60℃下干燥24h，以除去残留的无水乙醇，最后过筛除去不在范围内的微球。

按照与实施例1图样的方法观察微球的形态，本实施例所得微球的粒径为500~1900μm之间； 

按照与实施例1图样的方法测量微球的吸水倍数为28.12倍；

按照与实施例1图样的方法测量微球的溶胀比为19.89%

由实施例1和实施例2实验结果对比中得出，通过控制水相透明质酸钠碱液凝胶的浓度可制得出不同粒径分布的微球颗粒。透明质酸钠在溶液中的低浓度，使透明质酸钠微珠含水量偏高，加大了在乳液中的分散性，使

获得的微球粒径变小。

实施例3 

（1）称取分子量为130万道尔顿的透明质酸钠干粉3.03g，与1%NaOH配制成质量百分浓度为10% g/ml的透明质酸钠碱液凝胶；

（2）取液体石蜡150.15g和Span80 2.68g混匀获得油相，将步骤（1）的透明质酸钠凝胶体缓慢加入到油相中，经乳化机高速剪切乳化，剪切速度为1000rpm，时间为10min；

（3）待步骤（2）乳化完成后加入1ml交联剂（BDDE），室温下搅拌4h进行交联反应，完成后静置过夜；

（4）倾倒上层油相，并用乙酸乙酯反复洗涤微球表面残留的油相，再用无水乙醇反复洗涤微球除去乙酸乙酯；

（5）将步骤（4）获得的微球放入真空干燥箱，60℃下干燥24h，以除去残留的无水乙醇，最后过筛除去不在范围内的微球。

按照与实例1图样的方法观察微球的形态，从图3可见，本实施例所得微球的粒径为500~1900μm之间； 

按照与实施例1图样的方法测量微球的吸水倍数为26.25倍；

按照与实施例1图样的方法测量微球的溶胀比为20.85%。

由实施例1和实施例3实验结果对比中得出，通过控制水相/油相重量比可制得出不同粒径分布的微球颗粒。水油比例越小越有利于水相分散成较小的液滴；水油比越大，油相的分散能力越小，形成的液滴越大，固化之后得到的微球就越大。 

实施例4 

（1）称取分子量为130万道尔顿的透明质酸钠干粉3.06g，与1%NaOH配制成质量百分浓度为15% g/ml的透明质酸钠碱液凝胶；

（2）取液体石蜡100.23g和Span80 2.02g混匀获得油相，将步骤（1）的透明质酸钠凝胶体缓慢加入到油相中，经乳化机高速剪切乳化，剪切速度为2000rpm，时间为10min；

（3）待步骤（2）乳化完成后加入1ml交联剂（BDDE），室温下搅拌4h进行交联反应，完成后静置过夜；

（4）倾倒上层油相，并用乙酸乙酯反复洗涤微球表面残留的油相，再用无水乙醇反复洗涤微球除去乙酸乙酯；

（5）将步骤（4）获得的微球放入真空干燥箱，60℃下干燥24h，以除去残留的无水乙醇，最后过筛除去不在范围内的微球。

按照与实例1图样的方法观察微球的形态，本实施例所得微球的粒径为100～1500μm之间； 

按照与实施例1图样的方法测量微球的吸水倍数为26.25倍； 

按照与实施例1图样的方法测量微球的溶胀比为22.42%。 

由实施例2和实施例4实验结果对比中得出，通过控制乳化速度可制得出不同粒径分布的微球颗粒。乳化速度是一个物理行为的改变，当乳化速度较大时，水相受到的作用力加大，微球的分散性也变大，粒径就越小，反之亦然。 

实施例5 

（1）称取分子量为130万道尔顿的透明质酸钠干粉3.06g，与1%NaOH配制成质量百分浓度为15% g/ml的透明质酸钠碱液凝胶；

（2）取液体石蜡100.53g和Span80 2.12g混匀获得油相，将步骤（1）的透明质酸钠凝胶体缓慢加入到油相中，经乳化机高速剪切乳化，剪切速度为2000rpm，时间为10min；

（3）待步骤（2）乳化完成后加入1.5ml交联剂（BDDE），室温下搅拌4h进行交联反应，完成后静置过夜；

（4）倾倒上层油相，并用乙酸乙酯反复洗涤微球表面残留的油相，再用无水乙醇反复洗涤微球除去乙酸乙酯；

（5）将步骤（4）获得的微球放入真空干燥箱，60℃下干燥24h，以除去残留的无水乙醇，最后过筛除去不在范围内的微球。

按照与实例1图样的方法观察微球的形态，本实施例所得微球的粒径为110～1500μm之间； 

按照与实施例1图样的方法测量微球的吸水倍数为20.25倍； 

按照与实施例1图样的方法测量微球的溶胀比为16.42%。 

由实施例4和实施例5实验结果对比中得出，通过控制交联剂的用量来制得具有不同降解周期的微球颗粒。交联透明质酸钠的吸水性和溶胀度取决于本身的交联程度，溶剂分子进入聚合物交联成的网络时，将引起三维分子网的伸展而使聚合物交联体系体积的膨胀，所以当交联程度较小时，交联网中交联点间高分子链较长，溶剂分子进去的较多，体系膨胀的就越大；当交联程度较大时，交联网中交联点间高分子链较短且交联点密集，故溶剂分子进去的较少，体系膨胀的就越小。一般的，交联度越小则体内降解的越快，交联度越大则体内降解的越慢。 

实施例6 

交联透明质酸钠微球体外栓塞模拟实验

图3装置中，控制生理盐水的下滴速率为20ml/min，在底端放置一烧杯1，细玻璃柱2的内径为480μm，注射器3把适当规格的栓塞剂推注入1.5F微导管4中，通过阀门5输送到预定靶位，栓塞剂在输送到微导管顶端接触到生理盐水后会沉淀在粗玻璃柱6内，随着栓塞颗粒的下层会逐渐堵塞粗玻璃柱底端的出水口，既表示栓塞成功。

取实施例1~4中规格为400~550μm的交联透明质酸钠微球注射器包装产品，吸入生理盐水，栓塞剂浓度控制在2~5% g/ml之间，经1.5F微导管4注入预定靶位，推挤速度控制在0.1ml/min。观察各组栓塞效果及时间。 

实施例栓塞剂浓度栓塞时间现象观察实施例14.1%61s底端的生理盐水下滴速度缓慢下降，最后停止实施例24.1%80s底端的生理盐水下滴速度缓慢下降，最后停止实施例34.2%81s底端的生理盐水下滴速度缓慢下降，最后停止实施例44.0%87s底端的生理盐水下滴速度缓慢下降，最后停止

从实例1~4中可以看出本发明产品在适宜浓度下，通过控制注射推挤速度可达到临床栓塞的目的。