猪链球菌2型htpsC基因敲除突变株及其应用

摘要

本发明属于基因工程领域，涉及猪链球菌2型htpsC基因敲除突变株及其应用。所述突变株05ZYH33ΔhtpsC，保藏号为CGMCC No.7376。其制备方法为：利用同源重组基因敲除技术将S.suis2野生株05ZYH33染色体上编码组氨酸三聚体蛋白Htp的htpsC基因进行基因敲除，经组合PCR产物电泳、RT-PCR和DNA测序证实，确定所获得的菌株为基因敲除突变株。用本发明所述突变株进行动物实验研究其致病性，其结果是对实验动物的毒力显著降低，可应用于研制猪链球菌2型减毒疫苗。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及猪链球菌2型htpsC基因敲除突变株及其应用。 

背景技术

猪链球菌2型（S.suis2）是一种危害全球的人畜共患病病原菌。该病原菌不仅可致猪脑膜炎、败血症、关节炎、肺炎及心内膜炎等，而且还可感染人,给相关从业者和广大群众的生命安全造成严重威胁。根据其荚膜多糖的抗原性，可分为35个血清型，其中2型（SS2)毒力最强，临床检出率最高。近年我国南方省份的猪群中S.suis2流行日趋严重，时有较大规模暴发，每年造成的经济损失达数十亿元。1998和2005年分别在我国江苏和四川资阳暴发大规模SS2感染人事件，造成了重大生命财产损失，并且病人中出现了高比例的、国内外罕见的中毒性休克综合征，病情凶险，病死率高（60%～80%），引发严重的公共卫生事件。上述情况强烈提示引发这两次流行的SS2毒力极强，很可能发生了毒力变异或获得了毒力相关的遗传物质。近年来国际上关于S.suis感染和致病的报道显著增多，并有报道显示在我国香港已经检测出该菌多重耐药菌株的存在，给S.suis2的预防和控制带来了新的挑战。因此，开展S.suis2致病机制的相关基础和应用研究，对于防控S.suis2感染在人畜中的流行具有重要意义。但是，目前关于S.suis感染宿主并致病的分子机制尚不明确。因此，进一步探索研究新的致病相关基因的功能及其在S.suis与宿主相互作用中发挥的作用，对筛选潜在的疫苗候选分子、揭示其发生发展的精确分子机制，进一步提高我国S.suis预防和治疗水平具有重要意义。 

对于猪链球菌毒力因子的研究一直是一个热点，目前已被确切证实的毒力因子只有荚膜多糖(CPS)一个。其它已知的与S．suis致病性相关的毒力因子包括溶 菌酶释放蛋白(muraminidase released protein，MRP)、胞外因子(extracellular factor，EF)、溶血素(suilysin，Sly)、谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH）、分选酶A(sortase A)、二肽酶Ⅳ（Dipeptidyl Peptidase IV）、烯醇化酶（Enolase）以及猪链球菌组氨酸三聚体蛋白（Histidine triad protein of S.suis，Htps）等。这些毒力因子的发现对理解S.suis的致病过程有一定的帮助。但是众所周知，细菌的致病过程是其与宿主细胞相互作用的复杂过程。细菌接触宿主之后，必须克服宿主机体的防御机制，特别是要干扰或逃避局部的吞噬作用及体液免疫介导的免疫作用，才能建立感染。在长期的进化过程中，细菌形成了多种免疫逃避机制，依靠调控自身表达多种成分通过不同的机制来逃避宿主的免疫系统。 

Htp家族蛋白是在链球菌中新发现的一类蛋白家族。近年的报道显示A、B、C、G群链球菌中都发现了Htp家族蛋白成员，并且对化脓链球菌和无乳链球菌中该家族成员功能的相关研究也已见诸报道，但尚无人对S.suis中该基因功能及其参与细菌致病的分子机制进行研究。本课题组通过对S.suis2人源分离的强毒株05ZYH33的基因组分析，发现了3个组氨酸三聚体蛋白（histidine triad protein，Htp）编码基因，其开放阅读框分别为05SSU0332、05SSU1267、05SSU1577（分别命名为HtpsA、HtpsB、HtpsC），证实了S.suis205ZYH33中Htp家族蛋白的存在，并在国内外率先开展了对S.suis2中该家族蛋白的相关功能研究。据报道在肺炎链球菌中，该Htp家族由四个序列高度相似的成员组成，该菌中编码Pht蛋白的任何一个单基因缺失突变株或者双基因缺失突变株均不能引起菌株毒力明显的改变，只有当编码该蛋白的四个成员的基因全部敲除，菌株毒力才会有明显下降。 

开展对该致病菌致病机理及预防和控制的研究已成为国内外相关领域许多学者的共同选择。疫苗作为一种安全有效的病原菌防控手段成为当今应对S.suis2感染的研究热点。减毒活疫苗是传统的疫苗，以全菌体为基础，接种剂量小，免疫效果较好，免疫力教持久。而最近以细菌表面蛋白为靶标的亚单位疫苗由于其安全性高和生产成本低备受研究者青睐。亚单位疫苗具有组分清楚、安全性好、 技术成熟、便于产业化等优点。这类疫苗往往由多个不同的组分组成，各组分由病原菌的不同基因编码，从而可以避免由于单个基因的变异或丢失导致的疫苗失效。因此多价疫苗的研究成为S.suis新型疫苗研发的趋势。更多的保护性抗原的筛选对于多价亚单位疫苗的开发极为重要。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype2）htpsC基因敲除突变株。 

本发明的另一目的是提供该突变株的应用。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype2）htpsC基因敲除突变株05ZYH33ΔhtpsC，该突变株中05ZYH33菌株中的htpsC基因从第1位至1000位之间的编码基因被壮观霉素抗性基因盒SpcR所代替，该突变菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.7376，保藏日期为2013年3月28日。 

其中所述的05ZYH33菌株中的htpsC基因从第1位至1000位之间的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。 

所述的壮观霉素抗性基因盒SpcR序列如SEQ ID NO.3所示。 

构建所述的猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype2）htpsC基因敲除突变株的方法，包含以下步骤： 

⑴根据如SEQ ID NO.2所示的S.suis2野生株05ZYH33基因组htpsC编码基因的上游DNA序列，设计PCR特异引物LA1和LA2；根据如SEQ ID NO.4所示的S.suis2野生株05ZYH33基因组htpsC编码基因的下游DNA序列，设计PCR特异引物RA1和RA2；以pSET2质粒为模板，设计一对特异引物spc-F和spc-R；其中引物LA1序列如SEQ ID NO.5所示，引物LA2序列如SEQ ID NO.6所示，引物RA1序列如SEQ ID NO.7所示，引物RA2序列如SEQ ID NO.8所示，引物 spc-F序列如SEQ ID NO.9所示，引物spc-R序列如SEQ ID NO.10所示； 

⑵以05ZYH33基因组DNA为模板，分别以LA1/LA2和RA1/RA2为引物，扩增得到两端分别含EcoR I/BamH I酶切位点的目的基因htpsC上游DNA序列LA片段和两端分别含Sal I/Sph I酶切位点的目的基因htpsC下游DNA序列RA片段；以pSET2质粒为模板，以spc-F/spc-R为特异引物扩增得到两端分别含BamH I/Sal I酶切位点的壮观霉素抗性基因盒； 

LA1/LA2、RA1/RA2和spc-F/spc-R三对引物扩增所得PCR产物经1%琼脂糖电泳检测分别获得的目的片段大小为1005bp(LA)、960bp(RA)和1130bp。PCR产物回收、纯化，分别用EcoR I/BamH I、Sal I/Sph I和BamH I/Sal I进行双酶切，将双酶切产物回收、纯化，冻存备用。 

(3)基因敲除载体pUC::htpsC的构建：将所述的LA片段-壮观霉素抗性基因盒-RA片段插入pUC19载体的Sph I/Kpn I酶切位点间得基因敲除载体pUC::htpsC；具体包含如下步骤： 

(a)壮观霉素抗性基因SpcR的克隆：将BamH I/Sal I双酶切后的产物与用同样内切酶双酶切处理过的pUC18载体进行连接，16℃过夜后将连接产物转化入DH5a大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素筛选后，挑取LB平板上的克隆培养于LB液体培养基中37℃振荡过夜。次日提取质粒DNA，用BamH I/Sal I进行双酶切鉴定，将有1100bp左右大小DNA片段出现的重组质粒命名为pUC18-Spc。 

(b)RA的克隆：将Sal I/Sph I双酶切后的RA片段与用同样内切酶双酶切处理过的重组质粒pUC18-Spc载体进行连接，16℃过夜后将连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，经盐酸壮观霉素和氨苄青霉素双重筛选后，挑取LB平板上的克隆培养于LB液体培养基中37℃振荡过夜。次日提取质粒DNA，用Sal I/Sph I进行双酶切鉴定，将有960bp左右大小DNA片段出现的重组质粒命名为pUC18-SR。(c)LA的克隆：将EcoR I/BamH I双酶切后的LA片段与用同样内切酶双酶切处理过的重组质粒pUC18-SR进行连接，16℃过夜后将连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，经壮观霉素和氨苄青霉素双重筛选后，挑取LB平板上的克隆培养于LB液体培养基中37℃振荡过夜。次日提取质粒DNA，用EcoR I/BamHI进行双酶切鉴定，筛选出有1000bp左右大小DNA片段出现的阳性质粒；并 分别用LA1/LA2、RA1/RA2、spc-F/spc-R、LA1/spc-R、spc-F/RA2、LA1/RA2六对引物分别做质粒PCR鉴定。得到的阳性重组质粒命名为pUC::htpsC。 

(4)基因敲除载体pUC::htpsC的鉴定：将得到的阳性重组基因敲除载体pUC::htpsC进行测序（华大基因科技股份有限公司），测序结果表明在SpcR基因两侧具有同源序列的htpsC目的基因，基因敲除载体pUC::htpsC的构建完全正确。 

（5）基因敲除载体pUC::htpsC电转化入05ZYH33感受态 

①S.suis2野生株05ZYH33感受态细胞的制备：挑取05ZYH33单菌落接种与3mlTHB培养基，37℃摇床震荡培养过夜，次日1：50转接到含有DL-苏氨酸的THY中37℃摇床震荡培养至OD₆₀₀为0.3-0.4左右，4℃离心低速收菌，并用预冷的10%甘油洗菌4次，每次不少于25ml，最后用0.5ml含有15%甘油的0.3M蔗糖重悬细菌沉淀，并分装50μl/管，保存于-80℃备用。 

②电转化：在50μl按上述方法制备的感受态中加入10ul的pUC::htpsC质粒后加入电转杯中（冰上操作），22.5kV/cm、200Ω和25μF电转后，加入0.3M蔗糖的THB(37℃预热)培养基940ul，37℃,160rpm震荡培养2h后涂布于含有壮观霉素抗性的THB平板上，37℃培养24-48h，挑取单菌落进行鉴定； 

（6）05ZYH33△htpsC突变株的初步筛选：从壮观霉素THB平板上挑选猪链球菌菌落，分别培养于2ml液体THB(100mg/ml spc^r)培养基。取菌液作为模板，用引物checkin1（序列如SEQ ID NO.11所示）和checkin2（位于htpsC基因内部，序列如SEQ ID NO.12所示）进行PCR初步筛选。 

如果htpsC基因被敲除，PCR扩增将会得到阴性结果，如果仍能扩增出预期大小(521bp)的产物，说明htpsC基因未被敲除。通过这种方法，初步筛选获得htpsC基因敲除突变株，将其命名为05ZYH33ΔhtpsC。 

(7)05ZYH33△htpsC突变株的鉴定： 

①组合PCR鉴定：在htpsC敲除目的基因上下游同源序列的LA和RA的两外侧再设计一对引物OUt1/OUt2,序列如SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14所示;基因敲除载体pUC::htpsC与细菌的染色体若发生重组，将会出现3种情况出现：a.双交换同源重组事件(double cross-over)，即等位基因置换，此时spc^R基因 取代htpsC基因；b.3′端单交换重组事件(3′single cross-over)，此时整个载体DNA序列随着3′端同源序列而整合到细菌的染色体上；c.5′端单交换重组事件(5′single cross-over)，此时载体序列随着5′端同源序列而整合到细菌染色体上。若发生等位基因置换，用引物OUt1/Spc2进行PCR能够扩增出2233p的片段，用引物Spc1/Out2进行PCR能扩增出2187bp的片段，用引物Spc1/Spc2进行PCR能扩增出spc^R基因，而在05ZYH33中，用以上引物进行PCR都应得到阴性结果。而以05ZYH33基因组为模板，用引物checkin1/2能扩增出的521bp的目的片段，结果各PCR产物的大小与理论值相符，并经DNA测序验证（英俊测序），在基因水平证实05ZYH33ΔhtpsC突变株构建成功。 

②RT-PCR鉴定：为了进一步对05ZYH33ΔhtpsC突变株进行验证，利用checkin1/2引物分别对突变株和野毒株反转录得到的cDNA进行PCR扩增。野生株05ZYH33中结果为阳性，说明htpsC正常转录；而在突变株05ZYH33ΔhtpsC中为阴性。经过转录水平的鉴定，成功获得htpsC基因敲除突变株，命名为05ZYH33ΔhtpsC。有益效果： 

1.本发明运用同源重组的原理，构建中间为壮观霉素抗性基因，两侧为htpsC基因上下游同源序列的基因敲除载体pUC::htpsC，将构建的pUC::htpsC基因敲除质粒电转化入猪链球菌2型强致病株05ZYH33感受态细胞，通过体内同源重组，经基因水平、转录水平和DNA测序筛选和鉴定，成功获得突变株，命名为05ZYH33ΔhtpsC突变株。 

2.本发明对htpsC基因敲除突变株的相关生物学特性和致病性进行了分析，明确了htpsC基因与S.suis2致病性的关系。05ZYH33ΔhtpsC较野生株相比，到达对数生长期时间也相对减慢，生长速率明显减慢；通过透射电镜观察下细菌的表面形态，发现突变株表面的荚膜与野生株相比，粘膜局部融合；体外与Hep-2细胞的粘附能力明显下降，其抗巨噬细胞吞噬杀伤能力略微增强,提示htpsC基因与细菌粘附功能相关。动物毒力试验结果表明突变株05ZYH33ΔhtpsC的毒力下降。故提示htpsC参与了S.suis2的致病过程，是一种新的毒力相关因子。该突变 菌株为多价亚单位疫苗的保护性抗原的筛选提供了重要线索，可应用于S.suis减毒疫苗及多价亚单位疫苗的开发。 

3.本发明构建的05ZYH33ΔhtpsC，为进一步研究猪链球菌2型的致病机制奠定了基础，为更有效的防控猪链球菌病提供了技术支持。 

4.与现有的研究成果相反，本发明成功构建的S.suis205ZYH33的htpsC基因敲除突变株05ZYH33ΔhtpsC，在腹腔注射鼠模型毒力实验中引起突变株05ZYH33ΔhtpsC毒力下降。体外与人喉上皮Hep-2细胞的粘附能力明显下降，提示htpsC基因与细菌粘附功能相关。本发明构建的Htp蛋白家族成员的单个基因缺失突变株05ZYH33ΔhtpsC引起菌株毒力改变，说明HtpsC是猪链球菌的一个潜在毒力因子。对其进行克隆、表达、纯化，以制备出重组蛋白性抗原的候选分子作为抗原免疫动物，进行克隆、表达与纯化，以制备出重组蛋白性抗原的候选分子作为抗原免疫动物，发现小鼠的存活时间和存活率均明显提高，表明HtpsC具有免疫保护作用，为该菌疫苗保护性抗原筛选走向应用奠定基础。 

生物材料保藏信息 

05ZYH33ΔhtpsC，分类命名为猪链球菌Streptococcus suis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2013年3月28日，保藏号为CGMCCNo.7376。 

附图说明

图1为基因敲除载体pUC::htpsC交叉PCR鉴定结果图。 

泳道1为250bp Marker,泳道1,2,3,4,5,6分别是以LA1/LA2、spc-F/spc-R、RA1/RA2、LA1/spc-R、spc-F/RA2、LA1/RA2为引物对的PCR产物。 

图2为05ZYH33ΔhtpsC突变株的组合PCR鉴定结果图 

泳道1为250bp Marker，泳道1，3，5，7是以05ZYH33为模板的PCR，泳道2，4，6，8是以05ZYH33ΔhtpsC突变株为模板的PCR。 

图3为05ZYH33ΔhtpsC突变株的RNA提取图及逆转录PCR鉴定图 

A图为05ZYH33ΔhtpsC突变株的RNA提取图，其中泳道1为05ZYH33ΔhtpsC突变株RNA，泳道2为野生株05ZYH33RNA；B图为05ZYH33ΔhtpsC突变株的逆转录PCR鉴定图，其中泳道1是以05ZYH33cDNA为模板，以checkin1/checkin2为引物的PCR产物,泳道2是以05ZYH33ΔhtpsC cDNA突变株为模板，以checkin1/checkin2为引物的PCR产物。 

具体实施方式

实施例1：基因敲除载体的构建 

⑴根据S.suis2野生株05ZYH33基因组htpsC编码基因的上下游DNA序列， 

设计PCR特异引物，碱基序列如下： 

LA1：5′-CGGAATTCTGAAGCGCAGATAAATC-3′(SEQ ID NO.5，下划线处为引入的EcoR I酶切位点) 

LA2：5′-CGGGATCCAGTCCAAGGTCAAA-3′(SEQ ID NO.6，下划线处为引入的BamH I酶切位点) 

RA1：5′-CGTCGACTTTTGTCCTCCTAAGCTC-3′(SEQ ID NO.7，下划线处为引入的Sal I酶切位点) 

RA2：5′-CGGCATGCAGGTAGCAGAGATAGTAC-3′(SEQ ID NO.8，下划线处为引入的Sph I酶切位点) 

根据pSET2质粒序列，设计一对特异引物spc-F/spc-R，以pSET2质粒为模板扩增整个的spc表达盒，引物序列为: 

Spc-F：5’-CCGGATCCGTTCGTGAATACAT-3’(SEQ ID NO.9，下划线处为引入的BamH I酶切位点) 

Spc-R：5’-CGGTCGACGTTTTCTAAAATCTGA-3’(SEQ ID NO.10，下划线处为引入的Sal I酶切位点) 

PCR反应体系为： 

PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃50s，55℃60s，72℃2min，30个循环，最后72℃延伸10min，以双蒸水为阴性对照。 

LA1/LA2、RA1/RA2和spc-F/spc-R三对引物扩增所得PCR产物经1%琼脂糖电泳检测分别获得的目的片段大小为1005bp(LA)、960bp(RA)和1130bp（Spc^R）。PCR产物回收、纯化，分别用EcoR I/BamH I、Sal I/Sph I和BamH I/Sal I进行双酶切，将双酶切产物回收、纯化，冻存备用。 

(2)壮观霉素抗性基因SpcR的克隆：将BamH I/Sal I双酶切后的产物与用同样内切酶双酶切处理过的pUC19载体进行连接，16℃过夜后将连接产物转化入DH5a大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素筛选后，挑取LB平板上的克隆培养于LB液体培养基中37℃振荡过夜。次日提取质粒DNA，用BamH I/Sal I进行双酶切鉴定，将有1100bp左右大小DNA片段出现的重组质粒命名为pUC18-Spc。 

(3)RA的克隆：将Sal I/Sph I双酶切后的RA片段与用同样内切酶双酶切处理过的重组质粒pUC18-Spc载体进行连接，16℃过夜后将连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，经盐酸壮观霉素和氨苄青霉素双重筛选后，挑取LB平板上的克隆培养于LB液体培养基中37℃振荡过夜。次日提取质粒DNA，用Sal I/Sph I进行双酶切鉴定，将有960bp左右大小DNA片段出现的重组质粒命名为pUC18-SR。 

(4)LA的克隆：将EcoR I/BamH I双酶切后的LA片段与用同样内切酶双酶切处理过的重组质粒pUC18-SR进行连接，16℃过夜后将连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，经壮观霉素和氨苄青霉素双重筛选后，挑取LB平板上的克隆培养于LB液体培养基中37℃振荡过夜。次日提取质粒DNA，用EcoR I/BamH I进行双酶切鉴定，筛选出有1000bp左右大小DNA片段出现的阳性质粒；并分别用LA1/LA2、RA1/RA2、spc-F/spc-R、LA1/spc-R、spc-F/RA2、LA1/RA2六对引物分别做质粒PCR鉴定，结果见图1，得到的阳性重组质粒命名为pUC::htpsC。 

(5)基因敲除载体pUC::htpsC的鉴定：将得到的阳性重组基因敲除载体pUC::htpsC进行测序（华大基因科技股份有限公司），测序结果表明在Spc^R基因两侧具有同源序列的htpsC目的基因，基因敲除载体pUC::htpsC的构建完全正确。 

实施例2：变株的筛选与鉴定 

（1）基因敲除载体pUC::htpsC电转化入05ZYH33感受态 

①S.suis2野生株05ZYH33感受态细胞的制备：挑取05ZYH33单菌落接种与3mlTHB培养基，37℃摇床震荡培养过夜，次日1：50转接到含有DL-苏氨酸的THY中37℃摇床震荡培养至OD₆₀₀为0.3-0.4左右，4℃离心低速收菌，并用预冷的10%甘油洗菌4次，每次不少于25ml，最后用0.5ml含有15%甘油的0.3M蔗糖重悬细菌沉淀，并分装50μl/管，保存于-80℃备用。 

②电转化：在50μl按上述方法制备的感受态中加入10ul的pUC::htpsC质粒后加入电转杯中（冰上操作），22.5kV/cm、200Ω和25μF电转后，加入0.3M蔗糖的THB(37℃预热)培养基940ul，37℃,160rpm震荡培养2h后涂布于含有壮观霉素抗性的THB平板上，37℃培养24-48h，挑取单菌落进行鉴定； 

（2）05ZYH33△htpsC突变株的初步筛选：从壮观霉素THB平板上挑选猪链球菌菌落，分别培养于2ml液体THB(100mg/ml spc^r)培养基。取菌液作为模板，用引物checkin1和checkin2（位于htpsC基因内部）进行PCR初步筛选。其引物序列为: 

Checkin1：5′-GCCATTCGCATCTTCAGCCA-3′（SEQ ID NO.11） 

Checkin2：5′-TTGAAGGTCCGATCCCGTATGC-3′（SEQ ID NO.12） 

如果htpsC基因被敲除，PCR扩增将会得到阴性结果，如果仍能扩增出预期大小(521bp)的产物，说明htpsC基因未被敲除。通过这种方法，初步筛选获得htpsC基因敲除突变株，将其命名为05ZYH33ΔhtpsC。 

(3)05ZYH33△htpsC突变株的鉴定： 

①组合PCR鉴定：在htpsC敲除目的基因上下游同源序列的LA和RA的两 

外侧再设计一对引物OUt1/OUt2,其引物序列为: 

OUt1:5′-CATTAGCTGTCAGTTCTTCTAAATTCTCTGT-3′（SEQ ID NO.13） 

OUt2:5′-GACGGAAATATCGTATGTAGTCAGCTG-3′（SEQ ID NO.14） 

基因敲除载体pUC::htpsC与细菌的染色体若发生重组，将会出现3种情况出现：a.双交换同源重组事件(double cross-over)，即等位基因置换，此时spc^R基因取代htpsC基因；b.3′端单交换重组事件(3′single cross-over)，此时整个载体DNA序列随着3′端同源序列而整合到细菌的染色体上；c.5′端单交换重组事件(5′single cross-over)，此时载体序列随着5′端同源序列而整合到细菌染色体上。若发生等位基因置换，用引物OUt1/Spc2进行PCR能够扩增出2233p的片段，用引物Spc1/Out2进行PCR能扩增出2187bp的片段，用引物Spc1/Spc2进行PCR能扩增出spc^R基因，而在05ZYH33中，用以上引物进行PCR都应得到阴性结果。而以05ZYH33基因组为模板，用引物checkin1/2能扩增出的521bp的目的片段，结果各PCR产物的大小与理论值相符（图2），并经DNA测序验证（英俊测序），在基因水平证实05ZYH33ΔhtpsC突变株构建成功。 

②RT-PCR鉴定：为了进一步对05ZYH33ΔhtpsC突变株进行验证，利用checkin1/2引物分别对突变株和野毒株反转录得到的cDNA进行PCR扩增。野生株05ZYH33中结果为阳性，说明htpsC正常转录；而在突变株05ZYH33ΔhtpsC中为阴性。经过转录水平的鉴定，成功获得htpsC基因敲除突变株，命名为05ZYH33ΔhtpsC， 并送交CGMCC保藏，保藏号为CGMCC No.7376，保藏日期为2013年3月28日。 

实施例3：体外实验 

（1）革兰氏染色 

根据北京索莱宝科技有限公司生产的革兰氏染色液的说明书操作，分别给野生株05ZYH33和突变株05ZYH33ΔhtpsC（CGMCC No.7376）进行革兰染色，发现突变株05ZYH33ΔhtpsC相比野生株的链状排列更加散在，而且链的长度比野生株的短，说明突变株05ZYH33ΔhtpsC（CGMCC No.7376）的成链能力减弱。 

（2）生长特性 

在相同培养条件下,分别挑取05ZYH33ΔhtpsC（CGMCC No.7376）和野生株05ZYH33单菌落分别接种于3mL含壮观霉素(100mg/mL)和不含壮观霉素的THB培养基中,37℃振荡培养过夜。次日取出过夜培养的细菌,测定600nm处吸光度值,用THB培养基将两者稀释至约1×10⁸CFU/mL浓度。然后分别取60μL突变株和野生株分别接种于THB培养基3mL中,于37°C,200r/min振荡培养,每隔1h分别取样测定OD₆₀₀,以培养时间为横坐标,OD₆₀₀值为纵坐标,绘制突变株和野生株生长曲线,结果发现突变株05ZYH33ΔhtpsC（CGMCC No.7376）的生长速率要低于野生株的生长速率。 

（3）黏附与抗吞噬实验 

分别将37℃培养至对数生长期的SS2野生株05ZYH33和突变株05ZYH33ΔhtpsC（CGMCC No.7376），3000g离心10min收集细菌，用PBS洗3次，重悬于PBS中制成浓度为10⁸CFU/ml的细菌悬液。活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFDA-SE或通称为CFSE)CFSE标记细菌悬液，37℃孵育20min。4℃3000g离心6min收集菌体，用10ml预冷的PBS洗两次，重悬至10⁷CFU/ml，放置冰上用于实验。取37℃培养至对数期人喉癌上皮细胞Hep-2及巨噬细胞RAW264.7，铺板，12h后 长满单层，PBS洗3次，吹打悬浮于冰冷的PBS中。将CFSE标记的细菌加入到细胞悬液中，使得细菌与细胞数量比为100:1，37℃避光轻柔振荡2h，用温PBS洗涤3次，100ul/ml庆大霉素与5ul/ml青霉素作用1ｈ，洗涤3次，加入等体积的含4%(wt/vol)多聚甲醛的PBS溶液固定。流式细胞仪检测荧光强度。流式细胞术检测显示，05ZYH33ΔhtpsC（CGMCC No.7376）与05ZYH33相比与Hep-2细胞的粘附能力明显下降，其抗巨噬细胞吞噬杀伤能力略微增强。提示htpsC基因与细菌粘附功能相关。 

实施例4：动物致病性实验 

为了检测突变株05ZYH33ΔhtpsC（CGMCC No.7376）的致病性，在平板上分别挑取05ZYH33和突变株05ZYH33ΔhtpsC（CGMCC No.7376）的单个菌落，于THB培养基中37℃振荡培养至对数生长中期（OD₆₀₀≈0.4，约10⁸CFU剂量)离心收集菌体，用无菌PBS缓冲液重悬细菌。SPF级4周龄雌性BALB/c小鼠30只,随机分为3组,分别腹腔注射野生型和突变株菌液1mL(约10⁸CFU/只),并设THB阴性对照组(1mL/只),及时观察记录小鼠发病及存活时间有无明显变化。结果发现，用致死剂量的野生株05ZYH33攻击小鼠24h后，10只小鼠全部死亡，而用相同剂量敲除株△htpsC攻击小鼠12h后仍有8只存活，延至72h后，共死亡5只，存活5只;存活小鼠观察至7天实验结束时，均未发现有任何发病症状。阴性对照组10只状态均良好。说明htpsC基因敲除对05ZYH33的毒力产生了影响。动物实验结果表明，htpsC基因与细菌05ZYH33的毒力相关，可将其应用于猪链球菌2型减毒疫苗及多价亚单位疫苗的研制。