基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极制备

摘要

本发明公开了一种基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极的制备方法，该方法将碳糊电极作为基体电极，然后使用滴涂的方法对其进行修饰，利用金属掺杂炭气凝胶的吸附性能将肌红蛋白、离子液体层层固定在碳糊电极的表面，最后使用冷干燥得到稳定的基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极。其制作方法简单，可以直接检测过氧化氢，具有灵敏度高，稳定性强和检测限低的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种电化学生物传感器，具体地说是一种基于金属掺杂炭气 凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极制备方法，该方法制得的基于金属 掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极可用于过氧化氢的检测。

背景技术

生物传感器是由固定化的生物敏感材料作为识别元件（包括酶、抗体、 抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性组织）与适当的理化换能器（如 氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等）及信号放大装置构成的分析工具 或系统，具有接受器与转换器的功能。由于这类传感器响应快、灵敏度高、 制作简单而被广泛应用和研究。

金属（metal M）微粒往往比本体金属呈现出更高的活性，特别是催化 活性，将金属微粒修饰到电极表面在传感领域引起了极大的关注。炭气凝胶 （carbon aerogels，CA）作为具有导电性的气凝胶，具有孔隙率高、孔隙尺 寸小、比表面积大、电导率高、孔径大小及分布可控等特点。将金属与炭气 凝胶复合，既发挥了金属微粒的催化性能又利用了炭气凝胶的优良性质，是 电化学传感器的研究热点。

离子液体（Ionic liquid，IL）作为绿色替代溶剂，在电化学中的应用涉 及电催化、电镀、电池、有机电合成和电容技术等。与传统的有机溶剂和电 解质相比较，离子液体具有熔点低、液态温度范围宽、可忽略的蒸汽压、较 高的热稳定性、较好的化学稳定性和宽的电化学窗口等。

肌红蛋白（myoglobin，Mb）位于肌肉的及细胞中，其功能是可逆地结 合氧气，将氧气贮存在肌肉细胞中，从结构上来看，Mb以血红素作为活性 中心，与一些以血红素为辅基的酶（如辣根过氧化物酶、细胞色素等）的结 构相似，含有一个供底物结合的空缺配位点。因此Mb常作为研究酶结构与 功能关系的模型化合物。Mb表现出的生理功能及参与的代谢过程，大多数 涉及电子转移过程。因此常用电化学方法研究Mb的氧化还原反应及类酶性 质。同时，Mb由于相对易得，是研究血红素蛋白质和酶的电子传递反应的 理想模型物；但由于Mb与固体电极之间的直接电子转移速率较缓慢，不得 不借助于媒介体或促进剂进行研究。

过氧化氢（H₂O₂）在食品工业、临床应用、环境分析等领域有着广泛的 应用。同时，它也是包括葡萄糖氧化酶、尿酸酶、胆固醇氧化酶、醇氧化酶、 肌氨酸氧化酶、半乳糖氧化酶以及L-氨基酸氧化酶等在内的一系列酶促反应 的重要副产物。因此，发展可靠、灵敏、快速、低成本的H₂O₂检测方法具有 重要意义。目前，H₂O₂检测方法包括滴定法、光谱法、荧光法、化学发光法、 色谱法及电化学法。其中电化学法，尤其是基于各种过氧化物酶和血红蛋白 的电流型生物传感器研究最为广泛，该方法检测H₂O₂具有简单、方便、成本 低和速度快等优点，受到了广泛关注。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修 饰的碳糊电极的制作方法，该方法制作的金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子 液体修饰的碳糊电极具有测试稳定性好、灵敏度高等特点，可用于快速的检 测过氧化氢。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极制备方 法，其特征在于，由下列步骤组成：

步骤一，将质量比为17:3的石墨粉和液体石蜡混匀成碳糊，将碳糊压 入中性笔管中，然后在中性笔管的另一端插入用于导电的铜丝，该铜丝一端 露出中性笔管之外，即为碳糊电极；

步骤二，在碳糊电极表面滴涂一层肌红蛋白溶液，该肌红蛋白溶液的浓 度为5mg/mL，滴涂量为5μL，在冰箱中进行冷干燥，干燥时间为3h，得到 带有肌红蛋白修饰的碳糊电极；

步骤三，在带有肌红蛋白修饰的碳糊电极表面，滴涂一层悬浮液，该悬 浮液的滴涂量为10μL，悬浮液滴涂后在冰箱中进行冷干燥，干燥时间为5h；

所述的悬浮液的制备方法是：

将5mg的金属掺杂炭气凝胶粉末和10μL的[BMIM]BF₄离子液体混合在 1mL的磷酸盐缓冲溶液中，超声30min分散均匀，即形成悬浮液；

步骤四，待滴涂的悬浮液干燥后，用二次蒸馏水将带有肌红蛋白修饰的 碳糊电极表面浸洗2-3次，除去未固定的蛋白质，即得到基于金属掺杂炭气 凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极（M-CA/IL/Mb-CPE）。

经申请人的实验表明，采用本发明的方法制备的金属掺杂炭气凝胶/肌 红蛋白/离子液体（M-CA/IL/Mb-CPE）修饰电极，可用于H₂O₂的检测，其 响应时间短、灵敏度高，对H₂O₂的检测线性范围为10μM～265μM，且可重 复使用，即当该修金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体 （M-CA/IL/Mb-CPE）修饰电极不使用或测试结束后，均浸没在磷酸盐缓冲 溶液（PBS，pH=7.0浓度为0.10M）中，4℃冰箱中保存。

附图说明

图1是不同金属（M=Ni，Pd）掺杂炭气凝胶（M-CA）的修饰电极在 浓度为0.10M、pH7.0的PBS溶液中循环伏安曲线图，其中（a）为Mb-CPE 电极曲线，（b）为Ni-CA/IL/Mb-CPE电极曲线，（c）为Pd-CA/IL/Mb-CPE 电极曲线；

图2是不同电极在浓度为0.10M、pH7.0的PBS溶液中循环伏安曲线， 其中（a）为Mb-CPE电极曲线，（b）为IL/Mb-CPE电极曲线，（c） Cu-CA/IL/Mb-CPE电极曲线；

图3是不同电极在5.0mM K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆+0.1M KCl溶液中的 循环伏安曲线，其中（a）为CPE电极曲线，（b）为Cu-CA/IL-CPE电极曲 线，（c）为Cu-CA/IL/Mb-CPE电极曲线；

图4是在浓度为0.1M、pH7.0的PBS溶液中Cu掺杂CA/肌红蛋白/离 子液体修饰的碳糊电极（Cu-CA/IL/Mb-CPE）在不同扫描速率下循环伏安曲 线；

图5是图4条件下Mb氧化还原峰电流与扫描速率的关系；

图6是修饰电极Cu-CA/IL/Mb-CPE对H₂O₂的i-t图。

为了更清楚地说明本发明的内容，下面结合附图和具体的实施例对发明 作进一步的详细说明。

具体实施方式

本实施例给出一种基于金属掺杂炭气凝胶/肌红蛋白/离子液体修饰的碳 糊电极制备方法，由下列步骤组成：

将质量比为17:3的石墨粉和液体石蜡混匀成糊状，将碳糊压入中性笔 管中，然后在中性笔管的另一端插入用于导电的铜丝，该铜丝一端露出中性 笔管之外，即为碳糊电极（以下简称CPE电极）；

本实施例中，中性笔管选用内径为3mm废旧的中性笔管，将其裁成长 约4cm左右，并将管口一端在砂纸上打磨平滑。

在CPE电极表面滴涂一层肌红蛋白（Mb）溶液，该肌红蛋白（Mb） 溶液的浓度为5mg/mL，滴涂量为5μL，在冰箱中进行冷干燥，干燥时间为 3h，得到带有肌红蛋白修饰的碳糊电极（以下简称Mb-CPE电极）；

在Mb-CPE电极表面，滴涂一层悬浮液，该悬浮液的滴涂量为10μL， 悬浮液滴涂后在冰箱中进行冷干燥，干燥时间为5h；

悬浮液的制备方法是：

将5mg的金属掺杂炭气凝胶（M-CA）粉末和10μL的[BMIM]BF₄离子 液体（IL）混合在1mL浓度为0.10M、pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液（PBS） 中，超声30min分散均匀，形成悬浮液；

待待滴涂的悬浮液干燥后，用二次蒸馏水将带有肌红蛋白修饰的碳糊电 极表面浸洗2-3次，除去未固定的蛋白质，即得到基于金属掺杂炭气凝胶/ 肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极（以下简称M-CA/IL/Mb-CPE电极）。

使用时，M-CA/IL/Mb-CPE电极需要在称量纸上打磨光滑。当 （M-CA/IL/Mb-CPE电极不使用或测试结束后，均浸没在磷酸盐缓冲溶液 （PBS，pH=7.0浓度为0.10M）中，4℃冰箱中保存。

本实施例中所使用的仪器和原料：

CHI832电化学工作站（上海辰华仪器公司）、电子分析天平（沈阳龙腾 电子称量仪器有限公司）、pH计（北京大学化学系）、超声清洗机（宁波新 芝生物科技股份有限公司）、石墨粉（国药集团化学试剂有限公司，光谱纯）、 液体石蜡（天津化学试剂有限公司，化学纯）、30%过氧化氢（郑州派尼化 学试剂厂，分析纯）、肌红蛋白（Myoglobin Mb上海酶联生物科技有限公司）、 磷酸二氢钾（郑州派尼化学试剂厂）、磷酸氢二钾（西安化学试剂厂）、1- 丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体（[BMIM]BF₄，IL，中科院兰州化学物 理研究所）。测定时所用底液浓度为0.10M的PBS缓冲溶液，由0.10M的 K₂HPO₄和KH₂PO₄储备液配制而成，其pH通过0.10M的H₃PO₄和NaOH 溶液调节。所用水为二次蒸馏水。

实施例1：

图1为不同金属（M=Ni，Pd）掺杂炭气凝胶（M-CA）的修饰电极在浓 度为0.1M、pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中的循环伏安曲线。从图中 可以看出，Mb-CPE电极在扫描范围内无氧化还原峰出现，说明在Mb-CPE 电极表面未发生氧化还原反应，也说明Mb在CPE电极表面氧化还原反应很 难进行（曲线a）。但是，随着金属掺杂炭气凝胶（M-CA）和离子液体（IL） 材料的修饰，Ni-CA/IL/Mb-CPE及Pd-CA/IL/Mb-CPE电极分别出现了一对明 显的氧化还原峰，说明IL和M-CA的材料的修饰加速了Mb的氧化还原（曲线 b，c），△E_p分别为0.138V、0.145V，表明反应是一个准可逆过程。

实施例2：

图2是不同电极在浓度为0.10M、pH7.0的PBS溶液中的循环伏安曲 线，其中（a）Mb-CPE电极，（b）IL/Mb-CPE电极，（c）Cu-CA/IL/Mb-CPE 电极；同样如图1所述，曲线（a）表明Mb-CPE电极表面没有发生氧化还 原反应，说明Mb在CPE电极表面很难发生氧化还原反应。在曲线（b）有 一对小的不可逆的氧化还原峰，这说明Mb在IL-CPE电极表面电子转移速 率略有升高，这是因为水溶性的离子液体[BMIm]BF₄的在电极表面形成了一 层具有电化学活性的分子膜，一定程度上促进了电极表面电子的传递。曲线 （c）的电化学响应明显加强，出现了一对峰形良好的氧化还原峰。这可能 因为水溶性[BMIm]BF₄与Cu-CA在电极表面形成了一层均匀的膜， [BMIm]BF₄提高了膜的稳定性和导电性，Cu-CA不仅导电性能优越，而且 优化了Mb在电极表面的空间构象，促进了电子传递。曲线（c）的△E_p=0.110V 表明Cu-CA/IL/Mb-CPE修饰电极也是一个准可逆过程。

实施例3：

图3是K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆在碳糊电极（CPE）及修饰电极的循环伏 安图。曲线a表明CPE的K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆氧化还原峰峰电位差△E_p较大，峰电流较小，电极过程不可逆；在Cu-CA/IL-CPE上（曲线b），氧 化还原峰电流明显增大，△E_p减小为0.186V，电极过程为准可逆，表明 Cu-CA/IL可以加速铁氰化钾的电子转移。而在其上继续修饰Mb后（曲线 c），氧化峰及还原峰电流均明显降低，表明Mb膜阻碍了铁氰化钾的电子转 移，也表明Mb成功修饰到基体电极表面。

实施例4：

图4是考察了Cu掺杂CA/肌红蛋白/离子液体修饰的碳糊电极 （Cu-CA/IL/Mb-CPE）扫描速度与峰电流之间的关系，从图中可知随着扫描 速度的增加，氧化还原峰电流也在不断地增加，在40-1000mV·s^-1范围内， 随着扫描速度的增加，还原峰电位负移，氧化峰电位正移。随着扫速的增加， 氧化还原峰电流均与扫描速度呈线性关系，如图5所示，还原峰E_pc和氧化 峰E_pa与扫描速度v之间呈良好的线性关系，表明在40-1000mV·s^-1的扫速范 围内电极反应为吸附控制过程，说明电极反应主要受表面控制，即为薄层电 化学行为。其线性回归方程分别为：还原峰：i_pc(μA)=13.31+94.09v （R=0.9947）；氧化峰：i_pa(μA)=-3.94-116.42v（R=0.9978）。

实施例5：

图6是修饰电极Cu-CA/IL/Mb-CPE对H₂O₂的i-t图。使用电化学工作 站对H₂O₂在修饰电极Cu-CA/IL/Mb-CPE上的催化性能进行了研究。实验采 用三电极体系，饱和甘汞电极做参比，Pt电极为对电极，Cu-CA/IL/Mb-CPE 修饰电极作为工作电极。采用计时电流法考察了Cu-CA/IL/Mb-CPE修饰电 极对底物H₂O₂的电化学催化行为，选择工作电压为-0.35V，待背景电流稳 定后，连续向浓度为0.10M、pH7.0的PBS底液中添加H₂O₂溶液，测试结 果表明，电流随着过氧化氢（H₂O₂）浓度的增大而增大，并且响应时间短， 均在5s内达到稳定，同时也说明修饰电极Cu-CA/IL/Mb-CPE对H₂O₂的还 原有良好的电催化作用。实验结果表明，固定在Cu-CA/[BMIM]BF₄复合材 料中的Mb不仅可以进行有效的电子转移，而且还保持其对H₂O₂还原的生 物电催化活性。

实验中响应电流（I_ss）与H₂O₂浓度（c）在10μM～265μM范围内呈良 好的线性关系，满足线性回归方程I_ss(μA)=0.0089c(μM)+0.963，相关系数R 为0.9987。以3倍信噪比计算，可得该修饰电极Cu-CA/IL/Mb-CPE对H₂O₂的检出限为3.5μM。