使用微米图案化的成核位点控制肌动蛋白丝的生长和组织的装置和方法

摘要

本发明涉及用微米图案化的成核位点控制肌动蛋白丝的生长和组织的装置和方法，它们在研究肌动蛋白网络形成、筛选药物或制备复杂结构中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及装置和方法，所述装置和方法用于控制肌动蛋白丝网络的组织并由此用于研究肌动蛋白丝网络的组织，用于筛选能够调节肌动蛋白网络的组织的化合物或用于制造基于肌动蛋白的组件，特别是使用肌动蛋白网络作为模板用于其他纳米工程学过程。

背景技术

肌动蛋白丝构成细胞骨架的主要组分之一。肌动蛋白丝是从肌动蛋白单体自发自组装到细胞中的聚合物。它们形成复杂的细胞内结构，为调节细胞形状提供机械支撑。以丝状伪足或以应力纤维组装成束后，它们在细胞形态发生、粘附和运动期间发挥关键的作用。所述束的出现已与体内的特异性肌动蛋白调节物广泛相关联。通过在本体溶液（bulk solution）中或使用仿生装置进行肌动蛋白网络集合体的生物化学重建，也突显了这样的动态调节。然而，还没有被查明几何学边界例如在细胞中所遇到的那些如何影响高度有序的肌动蛋白结构的动态形成这一问题。

肌动蛋白单体可以从过滤后的细胞匀浆液分离和纯化。在体外，这些单体能够在成核蛋白和ATP（能量来源）的存在下聚合，形成新的肌动蛋白丝（F-肌动蛋白）。与细胞内集合体相反，当在体外形成时，肌动蛋白丝网络没有特定结构。已描述了几种用于在体外重建肌动蛋白网络的方法（Haraszti等，2009）。

在第一种方法中，在溶液中从纯化的单体执行肌动蛋白丝的体外聚合（例如US2004/0038323、US2006/0003399）。然而，这种类型的重建的缺点在于肌动蛋白丝网络的自发且随机的组织，特别是完全缺乏对引发区域的几何形状控制。

在第二种方法中，使用分散在溶液中的包被有成核蛋白的珠子来执行肌动蛋白的聚合（Michelot等，2007）。然而，这种包被珠子的主要限制之一是它们在溶液中的随机相对位置。

在第三种方法中，在肌动蛋白丝在溶液中聚合之后对肌动蛋白丝的组织进行控制。

例如，可以将它们固定在支柱网络上（即，肌动蛋白丝将沿着支柱网络排列成行）（Roos等，2003）。在29微米高支柱的顶部制造2微米宽金盘的阵列。这些点被用于接枝肌球蛋白并由此连接肌动蛋白丝。然后使用包含肌动蛋白单体的溶液延长这些连接的肌动蛋白丝。从所述点生长出来的长丝没有定向，并且没有在空间中自发组织网络。但是添加一种肌动蛋白结合蛋白即细丝蛋白，可以迫使肌动蛋白丝成束，并引起在点之间形成桥。这种组织只有在肌动蛋白丝被锚定在微支柱的顶部上时才会发生，所述微支柱的长度必须超过肌动蛋白丝的长度。在平坦表面上而不是在支柱的顶部上的同样的点阵列，即使在细丝蛋白存在下也只促进形成不清楚的网络。

也可以将它们送入放置有带光阱的珠子的腔室中（Uhrig等，2009）。

然而，在这两种情况下，肌动蛋白丝网络不是自组装的；它通过流体的流动或捕获珠子的位置从外部定向。最终结构体系不依赖于肌动蛋白丝集合体的生物学性质和相互作用，因此这些方法不能用于测试这些性质。此外，在从外部定向的肌动蛋白丝束中，单个肌动蛋白丝的极性不受控制。因此不能高度控制这些网络的精确结构体系。

在第四种方法中，通过在表面上引入肌动蛋白成核位点和肌动蛋白捕获位点，在固体支持物上控制肌动蛋白丝的组织（US20050106629）。使用这两种锚定点，可以控制肌动蛋白丝的组织。然而，结构不是自组装的，而是通过成核位点和捕获位点的受控位置从外部安排的。具体来说，将成核位点在支持物上排列成使得来自于一个成核位点的肌动蛋白丝不与来自于另一个成核位点的肌动蛋白丝相互作用。此外，从成核位点生长出来的肌动蛋白丝没有定向，并且必须通过由磁阱或光阱所操纵的珠子从外部驱动。

这些方法中没有一种允许提供具有可重复和受控的几何形状的有序肌动蛋白丝网络的自组装。

发明内容

本发明人第一次证实了成核几何形状本身可能是肌动蛋白丝体系结构的首要决定因素。本发明人确定了指导肌动蛋白丝组织的规律，第一规律是肌动蛋白丝相对于成核位点放射状生长。他们开发出肌动蛋白成核位点的微米图案，所述微米图案允许制备有趣且可重复的肌动蛋白丝网络结构。具体来说，形状、取向和成核区域之间的距离控制了肌动蛋白丝的取向和长度、肌动蛋白丝-肌动蛋白丝的相互作用和丝状伪足样束的形成（平行束）或应力纤维样束的形成（反平行束）。

因此，本发明提供了一种装置，其包含表面，在所述表面上配置有包含含有肌动蛋白成核剂的线（例如至少一条线）的图案、优选为纳米图案或微米图案，或包含至少两个点的图案，其中每个点包含肌动蛋白成核剂，并且所述点处于允许来自于两个相邻点的聚合的肌动蛋白丝发生相互作用的适合距离。优选情况下，所述线具有15、20、25或30微米，优选15或20微米的最小长度。优选情况下，所述点具有1至10μm、优选2至7μm、更优选约5μm的直径。优选情况下，所述表面在其上配置有多个图案，优选为多个可寻址图案。

优选情况下，所述肌动蛋白成核剂选自WASP/SCAR家族的成员、其PWA片段及其VAC结构域、ActaA、IscA及其C-末端区域。更优选情况下，所述肌动蛋白成核剂是pWA。任选地，所述pWA与一个或两个标签（例如GST标签和/或His标签）连接或融合。更具体来说，所述pWA在其N端处与GST标签连接或融合，并在其C端处与His标签连接或融合。

优选情况下，所述图案包含数个点或数条线，所述点或线处于允许来自于两个相邻点或两条相邻线的聚合的肌动蛋白丝发生相互作用的适合距离。因此，所述图案可以包括至少2、3、4、5、6、7、8、9或10条线或至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个点，具体来说可以包括2、3、4、5、6、7、8、9或10条线或2、3、4、5、6、7、8、9或10个点。优选情况下，两个相邻线或两个相邻点（即两条相邻线的近端）之间的距离为1、2、5、10、15、20、25或30微米，优选为5、10、15或20微米，更优选为约10微米。

优选情况下，所述图案、优选为纳米图案或微米图案包含：

-一个圆或数个圆，优选为嵌套的圆；和/或

-两条以上的线；和/或

-点的阵列。

在优选实施方案中，所述图案、优选为纳米图案或微米图案包含2至5个圆，所述圆具有不同的直径并且是同心或偏心的。优选情况下，所述圆是嵌套的。换句话说，较小的圆被包含在较大的圆内。

在第一可选优选实施方案中，所述图案、优选为纳米图案或微米图案包含两条以上的线，特别是两条以上的直线，所述线是平行的或相对于彼此形成小于或不超过25°的角度、优选相对于彼此形成小于或不超过22°的角度、更优选相对于彼此形成小于或不超过10°的角度。

在第二可选优选实施方案中，所述图案、优选为纳米图案或微米图案包含两条以上的线，特别是两条以上的直线，所述线相对于彼此形成超过25、30、35、40或45°并小于110°的角度，优选相对于彼此形成在45°和90°之间的角度。任选地，所述图案包括两条线，优选为两条直线。任选地，所述图案包括数条线，所述线被排列成形成放射状图案。

在第三可选优选实施方案中，所述图案、优选为纳米图案或微米图案包含两条以上的线，特别是两条以上的直线，所述线相对于彼此形成超过110°并小于150°、140°或130°，优选在110°和120°之间的角度。任选地，所述图案包括两条线性肌动蛋白成核位点，优选为两条直线的肌动蛋白成核位点。任选地，所述图案包括数条线性肌动蛋白成核位点，所述位点被排列成形成放射状图案。

优选情况下，所述表面是硅、应变硅、多晶硅、多晶硅、二氧化硅、锗、砷化镓、玻璃、塑料、陶瓷或金属。在优选实施方案中，所述表面是玻璃。在更优选实施方案中，所述表面是平面的。

本发明还涉及一种试剂盒，其包含本文中所公开的装置和肌动蛋白聚合混合物，所述混合物包含足以引起肌动蛋白聚合的组分。所述组分包含肌动蛋白单体、ATP、Arp2/3复合体、肌动蛋白丝和二价阳离子。任选地，所述肌动蛋白聚合混合物还可以包含肌动蛋白抑制蛋白（profilin）。任选地，所述聚合混合物包含标记的肌动蛋白单体，特别是用荧光染料或蛋白标记的肌动蛋白单体和/或结合有金属原子、特别是金的肌动蛋白单体。

本发明还涉及用于制备或制造肌动蛋白丝网络的方法，所述方法包括：a）提供本文中所公开的装置；b）将所述图案、优选为所述纳米图案或微米图案与包含肌动蛋白单体、ATP、二价阳离子、肌动蛋白丝和Arp2/3复合体的聚合溶液或混合物相接触，从而引起肌动蛋白丝的聚合；以及任选地c）移除所述聚合溶液或混合物。所述方法还可以包括从所述表面移除获得的肌动蛋白丝的步骤。所述方法还可以包括：所述肌动蛋白丝的包被，特别是用传导性物质例如金包被；和/或所述肌动蛋白丝的处理，特别是用肌动蛋白交联剂例如肌成束蛋白或α-辅肌动蛋白处理。优选情况下，所述聚合溶液或混合物含有足以引起临界密度的肌动蛋白丝聚合的量的Arp2/3复合体，特别是至少30nM的Arp2/3复合体。

此外，本发明提供了用于研究肌动蛋白丝网络的空间组织的方法，其中所述方法包括：a）提供本文中所公开的装置；b）将所述图案、优选为所述纳米图案或微米图案与包含肌动蛋白单体、ATP、二价阳离子、肌动蛋白丝和Arp2/3复合体的聚合溶液或混合物相接触，从而引起肌动蛋白丝的聚合；以及c）观察所述肌动蛋白丝网络。优选情况下，所述聚合溶液或混合物含有足以引起临界密度的肌动蛋白丝聚合的量的Arp2/3复合体，特别是至少30nM的Arp2/3复合体。

本发明还涉及用于筛选能够调节肌动蛋白丝网络的测试分子的方法，其中所述方法包括：a）提供本文中所公开的装置；b）将所述图案、优选为所述纳米图案或微米图案与包含肌动蛋白单体、ATP、二价阳离子、肌动蛋白丝和Arp2/3复合体的聚合溶液或混合物相接触，从而引起肌动蛋白丝的聚合；以及c）观察所述肌动蛋白丝网络；其中在所述肌动蛋白聚合之前、期间和/或在所述肌动蛋白聚合之后添加所述测试分子，并且其中确定所述测试分子对所述肌动蛋白丝网络的影响。优选情况下，所述聚合溶液或混合物含有足以引起临界密度的肌动蛋白丝聚合的量的Arp2/3复合体，特别是至少30nM的Arp2/3复合体。

最后，本发明涉及用于研究分子马达例如肌球蛋白的方法，所述方法包括：a）提供本文中所公开的装置；b）将所述图案、优选为所述纳米图案或微米图案与包含肌动蛋白单体、ATP、二价阳离子、肌动蛋白丝和Arp2/3复合体的聚合溶液或混合物相接触，从而引起肌动蛋白丝的聚合；以及c）观察聚合的肌动蛋白丝的结构、相互作用和/或变形；其中在所述肌动蛋白聚合之前、期间和/或在所述肌动蛋白聚合之后添加所述分子马达。优选情况下，所述聚合溶液或混合物含有足以引起临界密度的肌动蛋白丝聚合的量的Arp2/3复合体，特别是至少30nM的Arp2/3复合体。任选地，也可以与所述分子马达同时或顺序添加测试分子，并观察所述测试分子对聚合的肌动蛋白丝的结构和变形的影响。任选地，所述方法还可以包括选择能够调节所述分子马达的活性及其与肌动蛋白丝的相互作用的测试分子。

附图说明

图1：肌动蛋白成核和生长的几何形状控制。图1a，表面微米图案化方法。图1b，在pWA包被的微米图案上成核的肌动蛋白丝以及在不存在pWA包被的情况下溶液中的自发肌动蛋白丝聚合的落射荧光显微术图像。图1c，肌动蛋白丝在pWA包被的微米图案上的成核和生长。图1d，将荧光图像过滤，并根据肌动蛋白丝沿着条的位置（x）人工测量肌动蛋白丝与所述条微米图案主轴之间的角度。比例尺表示10μm。

图2：肌动蛋白丝数量和长度的生物化学控制。图2a，隐失波显微术下肌动蛋白-alexa568集合体沿着pWA包被的微米图案的引发和伸延。图2b，培养基中存在的单体肌动蛋白浓度的变化。随着肌动蛋白浓度增加，从成核区延伸出来的肌动蛋白丝变得更长。图2c，成核倍率随Arp2/3复合体浓度的变化。随着Arp2/3复合体浓度的增加，逸出成核区的肌动蛋白丝变得更短。图2d，对刺端加帽物即异二聚体加帽蛋白的响应。随着加帽蛋白浓度的增加，逸出成核区的肌动蛋白丝变短。图2e，肌动蛋白单体-Ca-ATP而不是生理学相关形式肌动蛋白单体-Mg-ATP的聚合。在肌动蛋白组装的标准条件下，钙肌动蛋白丝不受扰乱地生长，形成微米图案化的成核表面。图2f，肌动蛋白在0.25%甲基纤维素存在下的聚合。图2g，肌动蛋白在1%甲基纤维素存在下的聚合。在两种情况下，肌动蛋白丝保持其组装成束的性质。比例尺为20μm。

图3：肌动蛋白丝的长度控制它们穿越致密肌动蛋白网络的能力。图3a，在成核圆上形成的肌动蛋白结构的荧光显微术图像。图3b,通过几张图像（第一列）的重叠和平均所计算得到的以及来自于肌动蛋白丝生长（第三和第四列）的数值模拟的肌动蛋白网络密度图。示出了成核区域。本发明人测定了沿着插入图像中的内圆和外圆（第二列，虚线的圆）线扫描的荧光比率。点对应于实验密度图的比率（第二列）；线是指其中肌动蛋白丝能够或不能穿越致密肌动蛋白网络的数值模拟的比率（第三和第四列）。比例尺表示10μm。

图4：成核区域的取向控制束的形成。图4a，在120°V形成核区上成核的肌动蛋白丝的成核、延长和变形。图4b，在四种不同角度的V形区上形成的肌动蛋白结构的荧光显微术图像。图4c，每个角度30张图像的平均荧光投影。图4d，由在微米图案上成核的肌动蛋白丝的相互作用引起的束形成的示意图。沿着在平均后的图像上执行的线扫描（虚线）的荧光强度分布；组c中的箭头表示最大荧光。比例尺表示10μm。

图5：肌动蛋白丝的固有性质和集体组装调控平行束的形成。图5a，随时间推移在8分枝的放射状阵列上获得肌动蛋白丝的成核和延长。图5b，在肌动蛋白组装的稳态下三种尺寸的放射状阵列的荧光图像。图5c，平均荧光投影。图5d是图5b的放大。图5e，条的底部与转变点位置之间的距离d，在三种放射状阵列尺寸之间没有变化。图5f，模型假设：肌动蛋白丝的概率性行为取决于它们的局部环境。图5g，左侧：来自于图5e的三种不同放射状阵列尺寸的组合实验测量值。右侧：根据概率Q(y)和沿着X轴的正常变化性计算得到的20000个转变点的位置。中间：转变点位置的实验测量值与模型函数Q(y)的比较。图5h，左侧：大的放射状阵列的每个扇形的平均荧光投影。右侧：构成根据函数Q(y)产生的束的10000个平行肌动蛋白丝的计算得到的荧光强度。中间：沿着实验平均图像（点）和从模型获得的分析公式上的对分线的荧光强度的比较。比例尺表示10μm。

图6：成束蛋白对几何形状诱导的肌动蛋白网络的差异影响。图6a添加α-辅肌动蛋白或肌成束蛋白对图案化表面上预先形成的丝状结构的影响。为了引入蛋白而不扰乱肌动蛋白丝的组织，使用了特殊设置。不是产生流动池，而是将肌动蛋白聚合混合物直接滴加在微米图案化的盖玻片上，并放置在湿度箱中。然后可以将成束蛋白的液滴轻轻添加在其顶部。这种1μMα-辅肌动蛋白的添加引起相邻的肌动蛋白丝在有序的结构体系内成束（放大的图像），而1μM肌成束蛋白不引起变化。图6b，图像显示了从一开始就添加α-辅肌动蛋白的影响。在高浓度下失去了肌动蛋白丝的标准组织。图6c，α-辅肌动蛋白使肌动蛋白丝成束。在4℃下以13krpm转速对4μM肌动蛋白执行低速离心测定法，所述肌动蛋白如所示在存在或不存在α-辅肌动蛋白的条件下在20℃下组装至稳态1小时。未成束的肌动蛋白丝被保留在上清液中（第1和2道），而α-辅肌动蛋白成束的肌动蛋白丝被转移至沉淀物（第3至12道）。在低速沉淀物中回收的肌动蛋白丝的百分率随α-辅肌动蛋白浓度而变化，显示出α-辅肌动蛋白以20nM的表观Kd与肌动蛋白丝结合。图6d，图像显示了从一开始就添加肌成束蛋白（100nM）的影响。在该浓度下失去肌动蛋白丝的标准组织。

图7：通过TIRF显微术观察到的平行和反平行肌动蛋白丝网络形成的实时获取。从两个成核条（虚线卵形区）引发肌动蛋白丝组装。线突显了从在成核区上引发的分枝肌动蛋白网络发出的肌动蛋白丝的取向。小的倒置箭头表示延长中的刺端的位置。大的箭头指出反平行（在200s处）或平行（在360s处）肌动蛋白丝网络的形成。

图8：点阵列的肌动蛋白丝网络。从肌动蛋白成核剂pWA的点阵列引发肌动蛋白丝组装。点的直径为5微米，点相隔20微米。点阵列的使用产生特定且可重复的肌动蛋白丝网络。肌动蛋白丝束是肌动蛋白丝的反平行排列。

图9：研究分子马达对基于成核剂的放射状图案的肌动蛋白丝网络的影响。向形成45°角的8个条的放射状图案添加聚合混合物。肌动蛋白丝在条的近端部分中形成预期的反平行束，并在远端部分中形成平行束。为了测试一种分子马达肌球蛋白VI对预先形成的结构的作用，在完成肌动蛋白丝聚合后向混合物添加10nM纯化的双头肌球蛋白VI（DeLaCruz等，2001）。通过每分钟获取一张Alexa488标记的肌动蛋白丝的图像，在时间流逝视频显微术中监测所述影响。图像显示出结构底部部分的收缩，表明分子马达使反平行的肌动蛋白丝沿着彼此滑动。然而，在几分钟后，收缩传播到结构的其余部分，在仅由平行束构成的纯放射状结构中引起所有肌动蛋白丝的聚结。该实验突显了肌球蛋白VI对肌动蛋白丝的实际收缩效应，及其产生能够使结构完全变形的强大力量的能力。

发明详述

本发明人确定了指导肌动蛋白丝空间自组织的规律，第一规律是肌动蛋白丝相对于成核位点放射状生长，其中它们的刺端被定向在远端。他们开发了肌动蛋白成核位点的微米图案，所述微米图案允许制备有趣且可重复的肌动蛋白丝网络结构。具体来说，形状、取向和成核区域之间的距离控制了肌动蛋白丝的取向和长度、肌动蛋白丝-肌动蛋白丝的相互作用和丝状伪足样束或应力纤维样束的形成。

“自组织”在本文中意在指肌动蛋白丝的固有物理化学性质将促进它们的相互作用和空间重排。肌动蛋白丝将交叉或改变它们的原始取向，并以平行或反平行方式对齐。肌动蛋白丝的这些取向过程不需要外部干预（包括实验人员、外部材料或肌动蛋白捕获位点）。

图案允许肌动蛋白丝的极化。对于所有肌动蛋白丝来说，刺端被定向在远端。

“肌动蛋白丝网络”、“肌动蛋白丝网络体系结构”或“肌动蛋白丝组织”在本文中意在指肌动蛋白丝相对于彼此的空间定位，即肌动蛋白丝在它们所形成的网络中采取的几何形状。通过肌动蛋白丝的相互作用，它们形成肌动蛋白丝的束。具体来说，取决于图案，它提供了平行肌动蛋白丝、反平行肌动蛋白丝、平行肌动蛋白丝的束、反平行肌动蛋白丝的束等。“肌动蛋白丝的平行相互作用”意在指所述肌动蛋白丝表现出相同极性。“肌动蛋白丝的反平行相互作用”意在指所述肌动蛋白丝表现出相反极性。此外，束的取向可以由图案控制。因此，由于这些图案提供了可重复且可预测的肌动蛋白丝结构或网络，它们是非常有用的。

本发明涉及适用于制备肌动蛋白丝的表面以及使用它们的方法。取决于图案形式，本文公开的表面可以形成非常薄的结构（像单个肌动蛋白丝一样薄，约7-8nm），或者当图案产生肌动蛋白丝的束时，形成较大结构（例如90-100nm）。另外，具有多个肌动蛋白丝的结构可以被成形，以形成例如柱。因此，本发明提供了用于在微米和纳米级上形成用于制造和其他目的的各种有序结构的方法和组合物。

本发明提供了一种装置，其包含表面，在所述表面上配置有包含含有肌动蛋白成核剂的线（例如至少一条线）的图案、优选为纳米图案或微米图案，或包含至少两个含有肌动蛋白成核剂的点的图案，所述点处于允许来自于两个相邻点的聚合的肌动蛋白丝发生相互作用的适合距离。具体来说，所述表面在其上配置有多个图案，优选为多个可寻址图案。多个可寻址图案意在指所述图案在所述表面上具有不同的已知位置，所述位置被记录并可以被接近。每个图案位置的精确位置知识使这些“可寻址”图案可用于高通量测定法。优选情况下，图案是纳米图案或微米图案。更优选情况下，图案是微米图案。优选情况下，表面上的图案是一致的。可选地，表面也可以包含数个系列的不同图案。优选情况下，当表面包含数个图案时，所述图案配置在其上的距离使得两个图案之间不存在肌动蛋白丝相互作用。

图案

首先，图案意在指纳米或微米级的图案。因此，术语图案可以被纳米图案或微米图案代替。更优选情况下，图案是微米图案。

重要的是指出，在本发明中，在表面上不需要肌动蛋白捕获位点。事实上，肌动蛋白丝的组织和相互作用以及由此形成的结构由肌动蛋白成核剂的图案的几何形状来控制。因此，在优选实施方案中，所述表面不具有配置在其上的肌动蛋白捕获位点。具体来说，肌动蛋白捕获位点意在指肌动蛋白捕获剂，所述肌动蛋白捕获剂选自肌球蛋白、N-乙基马来酰亚胺-肌球蛋白、鬼笔环肽、α-辅肌动蛋白和肌成束蛋白。

在第一实施方案中，表面可以具有配置在其上的图案，更准确来说是纳米或微米图案，所述图案包含一条或数条包含肌动蛋白成核剂的线或由肌动蛋白成核剂制成的线。线可以是直线或曲线或其组合。线可以是开放或闭合的。开放或闭合的线可以形成任何几何形式或图形。当然，某些几何形式或图形可能表现出与其他形式或图形相比更有趣的特点（例如在肌动蛋白丝网络结构方面）。人们可以设想形成或包含圆、正方形、菱形、三角形、椭圆形及其组合的图案。线具有15、20、25或30微米、优选15或20微米的最小长度。对于线来说，长度至少为厚度的三倍。当图案包括数条线时，所述线被配置在适合的距离处以允许聚合的肌动蛋白丝发生相互作用。

线的厚度可以由本领域的技术人员进行调整，并且可以是例如0.05-100μm。厚度为50-100nm的线可以提供更精确的结构。也可以设想具有大厚度的线。然而，适合的厚度可以为1至10μm、优选2至7μm、更优选约5μm。

在特定实施方案中，线型图案、更准确来说是纳米或微米图案，包括一个或数个圆。具有数个圆的图案提供了向内和向外生长的肌动蛋白丝之间的相互作用，从而在相邻圆之间形成短且细的反平行束。成核区域之间的距离，在使用偏心圆时可以不同，或者在使用同心圆时保持不变。这种类型的示例性微米图案被详细描述在实施例部分中，并示出在图3中。任选地，图案、更准确来说是纳米或微米图案，由一个圆形成。可选地，图案、更准确来说是纳米或微米图案，由数个圆形成（例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个圆）。具体来说，图案、更准确来说是纳米或微米图案，由2、3或4个圆、优选3个圆形成。优选情况下，圆具有不同的直径，并且较小的圆被包含在较大的圆内。圆可以是同心的。可选地，圆可以是偏心的。图案、更准确来说是纳米或微米图案，也可以由同心圆和偏心圆的混合体形成。优选情况下，同心圆或偏心圆被隔开5、10、15、20、25或30微米，优选10、15或20微米，还更优选约15微米。优选情况下，圆或最小的圆具有15、20或25微米、优选20微米的最小直径。

在另一个特定实施方案中，线型图案、更准确来说是纳米或微米图案，含有两条以上的线（例如2、3、4、5、6、7、8、9或10条线），特别是两条以上的直线。线可以具有任何方便的长度。具体来说，线可以具有10-100微米、优选20-50微米、更优选20-30微米的长度。

线型图案、更准确来说是纳米或微米图案，可以含有一条线。这种图案允许获得肌动蛋白丝的平行网络。这种类型的示例性微米图案被详细描述在实施例部分中，并示出在图1b-d和2a-e中。

两条以上的线，特别是两条以上的直线，可以是平行或几乎平行的（即角度小于或不超过25°，优选不超过10°）。本发明人已确定，这样的线型图案提供了被缔合成短且细的反平行束的肌动蛋白丝。这种类型的示例性微米图案被详细描述在实施例部分中，并示出在图4b-d、5f中。具体来说，两条以上的线，特别是两条以上的直线，可以相对于彼此形成10-25°的角度。在非常具体的实施方案中，两条以上的线，特别是两条以上的直线，相对于彼此形成约22°的角度。具体来说，图案、更准确来说是纳米或微米图案，包括两条线、优选为两条直线。所述线被隔开5、10、15、20、25或30微米，优选5、10、15或20微米，更优选约10微米。

可选地，两条以上的线，特别是两条以上的直线，可以相对于彼此形成超过25、30、35、40或45°并小于110°的角度。在优选实施方案中，所述角度相对于彼此在45°和90°之间。本发明人已经确定，这样的线型图案提供了具有两种不同组织类型的混合结构：在线的近端部分处，肌动蛋白丝被缔合成短且细的反平行束；在线的远端部分处，肌动蛋白丝被缔合成平行肌动蛋白丝的束，特别是在相邻线之间的对分线上。所述线在其近端部分中被隔开1、2、5、10、15、20、25或30微米，优选5、10、15或20微米，更优选约10微米。这种类型的示例性微米图案被详细描述在实施例部分中，并示出在图4b-d、5、6和7中。具体来说，图案、更准确来说是纳米或微米图案，包括两条线、优选为两条直线。图案、更准确来说是纳米或微米图案，也可以包括数条线，所述线被排列成形成放射状图案。因此，这样的放射状图案可以包含4-9条线、优选4-8条线。优选情况下，放射状图案中两条相邻线之间的角度是几乎相同的（例如，4分枝的放射状阵列具有90°的角度，5分枝的放射状阵列具有72°的角度，6分枝的放射状阵列具有60°的角度，7分枝的放射状阵列具有51°的角度，8分枝的放射状阵列具有45°的角度）。可选地，放射状图案中两条相邻线之间的角度可以是不同的。任选地，它们可以不同但处于相同的角度范围内（即在25、30、35、40或45°和110°之间，优选在45°和90°之间）。任选地，它们可以不同，以便包括不同种类的组织或结构。因此，放射状图案可以包括角度在25、30、35、40或45°和110°之间、优选在45°和90°之间的的线。

此外，两条以上的线，特别是两条以上的直线，可以形成超过110°的角度。然而，角度优选小于150°、140°或130°。本发明人已经确定，这样的线型图案提供了平行肌动蛋白丝的束，但不是在相邻线之间的对分线上。这种类型的示例性微米图案被详细描述在实施例部分中，并示出在图4中。在优选实施方案中，所述角度相对于彼此在110°和120°之间。具体来说，图案、更准确来说是纳米或微米图案，包括两条线、优选为两条直线。图案、更准确来说是纳米或微米图案，也可以包括数条线，所述线被排列成形成放射状图案。例如，这样的放射状图案可以包含3条线。优选情况下，放射状图案中两条相邻线之间的角度是几乎相同的（例如120°）。所述线在其近端部分中被隔开1、2、5、10、15、20、25或30微米，优选5、10、15或20微米，更优选约10微米。

任选地，本发明还涉及在两条相邻线之间具有不同角度的放射状图案，以便包含不同种类的组织或结构。因此，放射状图案可以包括具有第一种类型的角度（即具有小于或不超过25°的角度）和/或第二种类型的角度（即具有在25、30、35、40或45°和110°之间，优选在45°和90°之间的角度）和/或第三种类型的角度（即具有超过110°的角度）的线。

在第二实施方案中，表面可以具有配置在其上的图案，更准确来说是纳米或微米图案，所述图案包含至少两个包含肌动蛋白成核剂的点或由肌动蛋白成核剂制成的点，所述点处于允许来自于两个相邻点的聚合的肌动蛋白丝发生相互作用的适合距离。优选情况下，点具有1至10μm、优选2至7μm、更优选约5μm的直径。优选情况下，图案包含数个点，所述点处于允许来自于两个相邻点的聚合的肌动蛋白丝发生相互作用的适合距离。因此，图案可以包括至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个点，具体来说可以包括2至1,000个点、10至100个点。优选情况下，两个相邻点之间的距离为1至40微米，例如1、2、5、10、15、20、25或30微米，优选为5、10、15或20微米，更优选为约10微米。在优选实施方案中，图案是点的阵列。优选情况下，点具有相同的直径，并且阵列的几何形状是规则的。点的阵列的实例示出在图8中。这类图案提供了反平行束的网络。肌动蛋白丝网络的这种体系结构在电子学领域中可能表现出特殊的兴趣。

本发明不限于这些特定图案。取决于所关心的问题，本领域的技术人员可以设计其他图案。事实上，本发明人的贡献不限于此，因为他们第一次确立了肌动蛋白成核剂的形式和排列方式允许控制由肌动蛋白聚合所形成的结构，即具有受控的位置、长度和取向的平行和反平行肌动蛋白丝的束。

表面

表面可以是具有足够面积用于在其上配置如本文所公开的肌动蛋白成核剂的图案、优选多个线型图案、更优选多个可寻址图案的任何固体支持物。在某些实施方案中，表面可以被认为是平坦的或平面的，但也可以在弯曲或其他形状的表面上使用本发明的装置和方法。

在优选实施方案中，表面是平面的或基本上平面的。因此，在这种实施方案中，表面不是珠子，特别是直径太小而不能提供足以在其上配置如本文所公开的肌动蛋白成核剂的图案的面积的珠子。

适用于结合肌动蛋白成核剂以形成图案的任何表面均可用于本文所公开的装置和方法。

在优选实施方案中，除了肌动蛋白成核剂图案之外，表面是惰性表面。适合的惰性表面的实例是用聚乙二醇衍生物覆盖的表面。然而，本领域的技术人员知道用于制备惰性表面的其他可选方案。例如，表面可以是非衍生化的硅烷，或者表面可以被免疫测定法中常用于减少非特异性结合的其他分子包被，例如脱脂奶、牛血清白蛋白和人血清白蛋白。

总的来说，表面可以是用于微米级或纳米级应用的任何表面。例如，表面可以是硅、应变硅、多晶硅、多晶硅、二氧化硅、锗、砷化镓、玻璃、塑料、陶瓷或金属。在优选实施方案中，表面是玻璃。

在优选实施方案中，表面可以是便于共聚焦、光学和/或荧光显微术、特别是落射荧光和全内反射荧光（TIRF）显微术的支持物，但是本发明也设想了不具有良好光学品质（例如适用于电子显微术）的支持物。在更优选实施方案中，板是玻璃，并可能覆盖有氧化的聚苯乙烯的薄层。例如，本发明的方便的板是盖玻片或载玻片。它也可以是塑料载玻片、塑料皿或皮氏培养皿。

本发明还涉及包含数个如上定义的表面或如上定义的表面与其他元件的组合的系统。因此，具有数个表面的系统形成3D结构。表面被放置成使得从每个表面的肌动蛋白成核位点生长的肌动蛋白丝可以彼此相互作用。表面可以彼此平行，或者可以形成角度，例如孔的相邻侧面。

用于制备装置的方法

本发明涉及用于制备本文所公开的表面的方法。具体来说，本发明涉及使用分离的肌动蛋白成核剂将表面图案化以获得如上公开的图案的方法。方法至少包括使用肌动蛋白成核剂制备配置在表面上的线型图案、优选多个线型图案、更优选多个可寻址图案的步骤。

对于微米和纳米图案化来说，可以使用各种方法，例如微接触印刷、光刻法、激光烧蚀、基于UV的微米图案化方法（Azioune等，2009）、蘸水笔（Dip Pen）（Ginger等，2004）、原子力显微术（“AFM”）差减（Wadu-Mesthrige等，2001）和等离子体沉积。例如，对于微米级别的结构来说，通过接触印刷将工作表面微米图案化，可以通过将工作表面紧压于包被有肌动蛋白成核剂的微米图案化的印模来实现。用于蛋白质沉积的印模，典型地按照现在的标准惯例在聚二甲基硅氧烷（“PDMS”）基材上使用光刻法来制造。可以用蛋白质直接对印模“上墨”，所述蛋白质将被被动吸附于或者可以使用常用方法步骤共价结合于基材。

具体来说，理想情况下，将要用肌动蛋白成核剂覆盖的图案不含赋予表面惰性的涂层。实现这一点有许多方式。例如，可以将成核剂施加到表面上，然后再施加赋予表面惰性的涂层。可选地，可以用可移除材料覆盖表面，然后将表面与赋予表面惰性的涂料接触，并将所述材料移除，留下不含涂层和肌动蛋白成核剂的位点。然而，优选情况下，通过移除这些位点处的涂层，可以在肌动蛋白成核剂的图案处产生不含涂层材料的区域。涂层材料可以用激光烧掉，利用以接触方式使用的AFM针刮掉或推掉，或者通过保护掩模用UV或等离子体处理来移除。方便的方案被详细描述在实施例部分中并示出在图1a中。

可以将肌动蛋白成核剂的多个图案置于表面上。可以通过例如将肌动蛋白成核剂的一系列图案以所需阵列放置，来提供图案（以及由此提供肌动蛋白丝）的有序阵列。优选情况下，表面上肌动蛋白成核剂的图案彼此隔开足够远，使得来自于阵列的一个图案的肌动蛋白丝不会接触来自于另一个图案的肌动蛋白丝。可以容易地确定将成对的肌动蛋白成核位点图案隔开的距离。

肌动蛋白成核剂或成核促进因子

肌动蛋白成核剂是能够在肌动蛋白单体和ATP以及任选的其他元件的存在下引发肌动蛋白聚合的蛋白质或其片段。肌动蛋白成核剂在本领域中往往被称为“成核促进因子”（NPF）。具体来说，肌动蛋白成核剂可以是例如ActA（诱导肌动蛋白组装的蛋白）、IscA、RickA、WASp（Wiskott-Aldrich综合征蛋白）、N-WASP、SCAR（cAR的抑制因子）、VCA结构域（富脯蛋白同源域，丝切蛋白同源域，酸性区）或WA区、pWA区。肌动蛋白成核剂还包括能够引发肌动蛋白聚合的类似物（嵌合形式或突变体）及其片段。肌动蛋白成核剂被公开在US2006/0003399和US2005/0106629中，其公开内容在此引为参考。其他适合的肌动蛋白成核剂也被公开在下面的参考文献中：Pollard等，2000；Higgs和Pollard，2001。

除了肌动蛋白单体和ATP之外，肌动蛋白成核剂可能还需要引发肌动蛋白聚合所必需的其他元件，特别是Arp2/3复合体和肌动蛋白丝。具体来说，将肌动蛋白成核剂包被在装置的表面上，而将引发肌动蛋白聚合所需的其他元件特别是肌动蛋白单体、ATP、肌动蛋白丝和Arp2/3复合体提供在聚合溶液或混合物中。

为引发肌动蛋白聚合，肌动蛋白成核剂还需要Arp（肌动蛋白相关蛋白）2/3复合体。肌动蛋白成核剂通过改变Arp2/3复合体的构象以模拟F-肌动蛋白二聚体来起作用，从而引发肌动蛋白聚合。因此，肌动蛋白的聚合以Arp2/3依赖性方式来引发。

对于提供在聚合溶液或混合物中的肌动蛋白丝来说，重要的是指出该肌动蛋白丝不被延长。事实上，形成了包括肌动蛋白成核剂、Arp2/3和肌动蛋白丝的三元复合体。该三元复合体然后能够引发肌动蛋白丝的聚合，新合成的肌动蛋白丝生长为三元复合体的肌动蛋白丝的分枝。因此，从最初的肌动蛋白丝开始，成核剂将促进数百个肌动蛋白丝的聚合，由此达到生长的肌动蛋白丝的高密度。

此外，某些肌动蛋白成核剂如ActA、IscA、RickA、WASp、N-WASP和SCAR可能需要其他调控蛋白或元件（也称为上游调控因子）例如Cdc42、PIP₂、Nck和Rac1。这些要求在本领域中是公知的，并被详细描述在例如US2006/003399以及Higgs和Pollard，2001中。

在优选实施方案中，肌动蛋白成核剂是pWA，即来自于WASP/Scar蛋白的C端结构域。pWA包括WASP或SCAR的富含脯氨酸的结构域、肌动蛋白单体结合性W结构域和p21结合性A结构域。具体来说，pWA可以包含人类Scar蛋白的172-559位氨基酸（SEQ ID No1）或由所述氨基酸构成。有利情况下，肌动蛋白成核剂也可以是VCA结构域。

事实上，使用pWA或VCA结构域比其他肌动蛋白成核剂更有利，这是因为它不需要上游调控因子。在更优选实施方案中，肌动蛋白成核剂是pWA（具体来说，如在Machesky等，1999中所详细公开的）。

肌动蛋白成核剂可以包括一个或数个标签，所述标签优选与氨基和/或羧基末端连接或融合。标签被用于增强表达、增加溶解性、协助纯化和/或促进在表面上的结合。可以使用各种标签，包括但不限于：1）谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签，其可用于与谷胱甘肽-琼脂糖结合；2）His6标签（或简称HIS标签），其可用于与固定化的金属离子柱（例如镍）结合；3）钙调蛋白结合肽（CBP）标签，其与钙调蛋白-琼脂糖柱结合；4）表位标签（例如血细胞凝集素标签、myc标签或FLAG标签），其可用于与对所述表位标签具有特异性结合亲和性的抗体结合；以及5）麦芽糖结合蛋白（MBP）标签，其增加融合蛋白的溶解性。这些标签也可以被组合使用，其中一个或多个标签与氨基端融合，一个或多个其他标签与羧基端融合。在特定实施方案中，肌动蛋白成核剂是连接有两个标签的pWA，所述两个标签具体来说是GST标签和His标签，更具体来说GST标签连接在其N端处，His标签连接在其C端处。带有两个标签的pWA呈递所述序列。

聚合溶液或混合物

聚合溶液或混合物包含足以引起并维持肌动蛋白聚合的成分。对聚合溶液或混合物的要求在本领域中是公知的。具体来说，本领域的技术人员知道聚合混合物组分的适合浓度。

聚合溶液或混合物包括ATP、单体肌动蛋白（G-肌动蛋白）、二价阳离子和Arp2/3复合体。优选情况下，聚合溶液或混合物还包括肌动蛋白丝。

很久以来，用于制备纯化的单体肌动蛋白的方法在本领域中就已是公知的（MacLean-Fletcher&Pollard，1980；Spudich&Watt，1971）。事实上，肌动蛋白及其聚合已被研究了几乎50年。此外，纯化的单体肌动蛋白也是可商购的（例如Invitrogen：目录号A12375）。

优选情况下，单体肌动蛋白包括标记的单体肌动蛋白。事实上，优选用荧光蛋白或染料标记单体肌动蛋白。荧光蛋白或染料的实例包括但不限于荧光染料例如Alexa Fluor染料（例如Alexa350、Alexa430、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa568和Alexa594染料）、花青素染料（例如Cy3和Cy5）、德克萨斯红、acyrolodan、芘等，以及荧光蛋白例如GFP、CFP、YFP、RFP和mCherry。优选情况下使用荧光染料。某些荧光标记的肌动蛋白单体是可商购的（非穷举地，例如Invitrogen：Alexa488结合物（目录号：A12373），Alexa568结合物（目录号：A12374），Alexa594结合物（目录号：A34050）和Alexa647结合物（目录号：A34051））。其他适合的荧光标签对于本领域的普通人员来说是显而易见的。优选情况下，聚合溶液或混合物包含标记和未标记的肌动蛋白单体的混合物。

在特定实施方案中，单体肌动蛋白可以可选地或还包括与金属原子、特别是与金结合的单体肌动蛋白。用金标记的肌动蛋白单体的制备被详细描述在Patolsky等，2004中。聚合溶液或混合物可以只包含用金属原子、特别是用金标记的肌动蛋白单体，或者可以包含未标记的肌动蛋白单体与用金属原子、特别是用金标记的肌动蛋白单体的混合物。

“Arp2/3复合体”首先分离自卡氏棘阿米巴（Acanthamoebacastellani），由7种多肽构成：两种肌动蛋白相关蛋白Arp2和Arp3，以及5种其他蛋白p40、p35、p19、p18和p14。人类的复合体由7个亚基构成，所述亚基包括肌动蛋白相关蛋白Arp2和Arp3以及被称为p41-Arc、p34-Arc、p21-Arc、p20-Arc和p16-Arc的5种其他蛋白。所有7个亚基的预测的氨基酸序列已被确定。啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）中的Arp2/3复合体由6个亚基构成。研究确定，复合体的成核和组织活性是可分开的。因此，对于本发明的方法所设想的成核活性来说，可能不是所有的Arp2/3复合体亚基都是必需的。因此，当在本文中使用时，对“Arp2/3复合体”的指称是指全部6或7种组分的复合体，或者是指成核肌动蛋白聚合所必需的这些复合体组分的集合物，除非上下文要求指称全部6或7种蛋白的复合体。来自于任何来源的任何Arp2/3复合体都可方便地用于本文所公开的聚合混合物、方法和试剂盒。例如，专利申请US2006/0014266公开了用于纯化Arp2/3复合体的方法（其公开内容在此引为参考）。

任何肌动蛋白丝都是适合的。例如，适合的肌动蛋白丝可以具有30-100nm的长度。

优选情况下，聚合溶液或混合物还包括肌动蛋白抑制蛋白。事实上，肌动蛋白抑制蛋白允许阻止肌动蛋白的自发聚合。当肌动蛋白成核剂是pWA时，在聚合混合物或溶液中存在肌动蛋白抑制蛋白是非常适合的。

在特定实施方案中，聚合混合物或溶液可以是细胞提取物（Theriot等，1992）或卵提取物（例如非洲爪蟾卵提取物）（Marchand等，1995）。

试剂盒

本发明涉及用于制备肌动蛋白丝特别是具有确定组织的肌动蛋白丝的试剂盒，或用于执行测定法或筛选方法的试剂盒。

本发明还涉及一种试剂盒，其包含本文所公开的装置以及用在所述装置上的肌动蛋白聚合溶液或混合物，特别是如上公开的聚合混合物，所述溶液或混合物包含足以在肌动蛋白成核剂的存在下引起肌动蛋白聚合的组分。试剂盒可以包含解释如何使用试剂盒的说明书。试剂盒还可以包含对肌动蛋白丝网络、肌动蛋白丝相互作用和/或结构具有明确影响的对照分子。这样的分子可以是肌球蛋白、α-辅肌动蛋白或肌成束蛋白。

应用和方法

本文所公开的装置可用于制备或制造肌动蛋白丝网络，特别是具有肌动蛋白丝的可重复（即可预测）结构、组织和/或相互作用的肌动蛋白丝网络。因此，本发明涉及本文公开的装置在制备或制造肌动蛋白丝网络中的应用。本发明涉及用于制备或制造肌动蛋白丝网络、特别是二维或三维肌动蛋白结构的方法。具体来说，本发明提供了用于制备或制造肌动蛋白丝网络的方法，所述方法包括a）提供如本文所公开的装置；b）将所述图案、优选为所述纳米或微米图案与聚合溶液或混合物相接触，由此引起肌动蛋白丝的聚合，以及任选地c）移除聚合溶液或混合物。

在优选实施方案中，所述方法包括一种或几种下面的实施方案：a）肌动蛋白成核剂是pWA；和/或b）表面是平面的；和/或c）聚合混合物包括肌动蛋白单体、ATP、二价阳离子、Arp2/3复合体，并且优选为标记的肌动蛋白单体，优选为荧光标记的肌动蛋白单体或结合有金属原子例如Au的肌动蛋白单体。

据认为，由于致密网络中肌动蛋白丝-肌动蛋白丝的排斥，肌动蛋白丝以垂直于成核区域边缘的形式从成核区域定向长出。低密度的肌动蛋白丝不会引起从成核区域定向长出。当肌动蛋白丝被充分压紧时，它们的空间排斥引起它们垂直于成核区域的边缘排列。具体来说，可以认为肌动蛋白丝的最小密度为10根肌动蛋白丝/μm²。优选情况下，肌动蛋白丝密度为至少20、30、40或50根肌动蛋白丝/μm²。当成核区域被NPF（成核促进因子）（在本文中也称为肌动蛋白成核剂）例如pWA完全包被时，肌动蛋白丝密度仅仅依赖于聚合混合物或溶液中Arp2/3复合体的密度。事实上，成核是由pWA-Arp2/3-肌动蛋白丝三聚体的形成引起的。肌动蛋白单体以足以引起并维持肌动蛋白聚合的适合浓度（例如，最低浓度为0.01mg/ml）下使用。然而，在允许肌动蛋白丝聚合的条件下，肌动蛋白单体优选以大的过量使用。因此，三聚体的形成仅依赖于Arp2/3复合体的存在。10nM的Arp2/3复合体浓度不足以引起临界密度的肌动蛋白丝在它们的生长期间允许平行排列。Arp2/3复合体超过30nM时，肌动蛋白丝足够致密，允许垂直于成核区域边缘以平行方式生长。因此，与肌动蛋白成核剂的图案相接触的聚合溶液或混合物含有至少30nM的Arp2/3复合体。

所述方法还可以包括包被肌动蛋白丝的步骤或对它们进行处理的步骤。具体来说，在肌动蛋白聚合之后或在肌动蛋白聚合期间，肌动蛋白丝可以被进一步处理或包被。任选地，在移除聚合溶液后进行所述进一步处理或包被。

在第一实施方案中，用交联肌动蛋白丝的蛋白质进一步处理肌动蛋白丝。事实上，这种附加处理可以增加由肌动蛋白丝形成的结构特别是肌动蛋白束的强度。这允许制备更刚性的结构。正如下面进一步提到的，已知多种蛋白质可在细胞中结合肌动蛋白丝、使肌动蛋白丝成束或交联肌动蛋白丝。例如肌动蛋白交联蛋白质可以是α-辅肌动蛋白、肌成束蛋白、EF-1、Scruin、villin、dematin、fimbrin、血影蛋白、抗肌萎缩蛋白、ABP120或细丝蛋白（Lodish等，《分子细胞生物学》（Molecular Cell Biology），W.H.Freeman and Company，N.Y.,N.Y.（2000），表18.1）。示例性的交联蛋白质是肌成束蛋白，其可用于将一个肌动蛋白丝中的每个亚基与相邻肌动蛋白丝中的亚基相连（Matsudaira等，1994）。类似地，蛋白质α-辅肌动蛋白可用于连接肌动蛋白丝。肌成束蛋白和α-辅肌动蛋白两者使肌动蛋白丝平行排列并连接肌动蛋白丝，但肌成束蛋白将它们连接得更紧密。使用肌动蛋白交联蛋白质的附加处理，可以通过将肌动蛋白结构在包含连接蛋白质的溶液中洗涤或浸泡来进行。这可以在肌动蛋白聚合完成后或在肌动蛋白聚合过程期间进行。已观察到，用交联蛋白质例如肌成束蛋白或α-辅肌动蛋白进行处理，特别是在肌动蛋白聚合过程期间，可以改变获得的结构或组织。例如，在肌动蛋白聚合过程期间添加大量肌成束蛋白（例如100nM）或α-辅肌动蛋白（例如500nM），可以防止形成平行束，这是由于平行肌动蛋白丝的刚性对于肌动蛋白成核位点来说太高（参见实验部分和图6）。此外，获得的效应可以随着交联蛋白质例如肌成束蛋白或α-辅肌动蛋白的用量而变（参见实验部分和图6a）。

在第二实施方案中，用加帽蛋白进一步处理肌动蛋白丝。事实上，加帽蛋白可用于控制肌动蛋白丝的长度。加帽蛋白在本领域中是已知的，例如CAPZA1（F-肌动蛋白加帽蛋白亚基α-1）或CAPZB。此外，使用加帽蛋白与丝切蛋白的组合可以产生动态结构，从而维持生长的肌动蛋白丝。

在第三实施方案中，用物质进一步包被肌动蛋白丝。具体来说，可以用传导性物质包被肌动蛋白丝。优选情况下，传导性物质可以是金属原子，更优选为金。可选地，物质可以是碳纳米管。在特定实施方案中，肌动蛋白丝已包含与金结合的肌动蛋白，并且用金包被允许增强金的沉积（例如参见Patolsky等，2004）。因此，本发明提供了用于制备基于肌动蛋白的金属丝、特别是金丝的方法。因此，本发明涉及用于制备可用于纳米级电路的制造、特别是可用于纳米生物技术领域的传导性微米丝或纳米丝的方法。

此外，本发明提供了用于制备或制造肌动蛋白丝、特别是具有确定组织的肌动蛋白丝的方法，所述方法还包括从表面移除获得的肌动蛋白丝。任选地，在从表面移除后，也可以如上所述对肌动蛋白丝进行处理或包被。

在另一个特定实施方案中，本发明提供了使用物质将表面图案化的方法。在这种方法中，表面上的肌动蛋白丝在用物质包被表面时被用作掩模。具体来说，方法包括：a）提供其上具有本发明的纳米或微米图案的表面，b）将所述纳米或微米图案与聚合溶液相接触，由此引起肌动蛋白丝的聚合，c）用物质包被表面，以及d）从表面移除肌动蛋白丝（例如通过肌动蛋白丝的解聚），由此留下被包被在表面上具有所需图案的物质。例如，表面的包被可以通过化学气相沉积来进行。物质可以选自硅、多晶硅、二氧化硅、碳纤维、碳纳米纤维、细丝、碳纳米管、SiO₂、硅-锗、钨、碳化硅、氮化硅、氮氧化硅、氮化钛、金属和各种高k电介质。可选地，可以通过旋涂法进行包被，并且物质可以是聚合物例如聚苯乙烯或极性更高的聚合物例如聚砜或聚醚酰亚胺。它也可用于制备光敏聚合物膜抗蚀剂。

在可选的特定实施方案中，本发明提供了用物质蚀刻表面的方法。在这种方法中，表面上的肌动蛋白丝在用物质蚀刻表面时被用作掩模。具体来说，方法包括：a）提供其上具有本发明的纳米或微米图案的表面，b）将所述纳米或微米图案与聚合溶液相接触，由此引起肌动蛋白丝的聚合，c）蚀刻表面，以及d）从表面移除肌动蛋白丝（例如通过肌动蛋白丝的解聚）。事实上，肌动蛋白丝起到掩模的作用以覆盖表面，而没有被肌动蛋白丝覆盖的表面被蚀刻。例如，在芯片制造中，典型地将薄金属膜沉积在半导体例如硅上，将金属以所需图案遮蔽，并将未遮蔽的金属蚀刻掉。本发明的方法允许用肌动蛋白丝在金属层上遮蔽所需图案，然后蚀刻没有被肌动蛋白丝遮蔽的金属。

本发明的图案、特别是纳米或微米图案，可用于研究肌动蛋白丝相互作用和/或用于研究肌动蛋白丝网络结构。因此，本发明涉及本文所公开的装置用于研究肌动蛋白丝相互作用和/或用于研究肌动蛋白丝网络结构的应用。本发明还涉及用于研究肌动蛋白丝相互作用和/或用于研究肌动蛋白丝网络结构的方法，其中所述方法包括制备或制造如上公开的肌动蛋白丝。具体来说，方法包括：a）提供如本文所公开的装置；b）将所述图案、优选为所述纳米或微米图案与聚合溶液或混合物相接触，由此引起肌动蛋白丝的聚合；以及c）观察肌动蛋白丝的结构和/或相互作用。具体来说，观察步骤可以包括观察肌动蛋白丝的生长及其组织。可以在一个特定时刻、在连续的特定时刻或通过视频来进行观察。肌动蛋白丝的相互作用可以是平行或反平行的。可以观察特定结构的形成，例如肌动蛋白丝束的形成。在肌动蛋白丝聚合后，人们也可以研究肌动蛋白的解聚。

优选情况下，可以通过荧光显微术观察肌动蛋白丝及其组织。因此，可以在聚合步骤期间通过使用荧光标记的肌动蛋白单体来标记肌动蛋白丝，或者可以在聚合后用荧光标记的鬼笔环肽标记肌动蛋白丝。几种荧光标记的鬼笔环肽是可商购的（例如，罗丹明-鬼笔环肽（Molecular Probes）；德克萨斯红-鬼笔环肽（Molecular Probes）等）。

在步骤b）期间、在步骤b）与c）之间或在步骤c）期间，可以进一步将微米图案与其他分子或条件相接触，特别是用于研究这些其他分子或条件对肌动蛋白聚合和/或肌动蛋白丝相互作用和/或肌动蛋白丝网络结构或网络的影响。

所公开的装置也可用于评估或确定测试分子对肌动蛋白丝相互作用和/或肌动蛋白丝网络结构的影响。因此，本发明涉及使用本文所公开的装置用于评估或确定测试分子对肌动蛋白丝相互作用和/或肌动蛋白丝网络结构的影响的应用。本发明还涉及用于确定测试分子是否调节肌动蛋白丝相互作用和/或肌动蛋白丝网络结构或网络的方法，其中方法包括制备或制造如上公开的肌动蛋白丝，将肌动蛋白丝与测试分子相接触，以及确定测试分子对肌动蛋白聚合、肌动蛋白丝相互作用和/或肌动蛋白丝网络结构或网络的影响。具体来说，方法包括：a）提供本发明的纳米或微米图案，b）将所述微米图案与聚合溶液相接触，c）观察肌动蛋白丝的结构和/或相互作用，由此确定测试分子是否调节肌动蛋白丝相互作用和/或肌动蛋白丝网络结构；其中在肌动蛋白聚合之前、期间和/或在肌动蛋白聚合之后添加测试分子。在优选实施方案中，在肌动蛋白聚合期间添加测试分子，例如与聚合混合物或溶液同时添加测试分子。在可选的优选实施方案中，在肌动蛋白丝聚合之后，例如在移除聚合混合物或溶液后之添加测试分子。优选情况下，将在测试分子存在下观察到的肌动蛋白丝相互作用和/或肌动蛋白丝网络结构或网络，与在测试分子不存在下观察到的肌动蛋白丝相互作用和/或肌动蛋白丝网络结构或网络进行比较。本文公开的图案的优点在于使用本发明的装置获得的肌动蛋白丝相互作用和肌动蛋白丝网络结构是可重复的。因此，在测试分子存在和不存在下的肌动蛋白聚合、肌动蛋白丝相互作用和肌动蛋白丝网络结构的比较是有可能并且准确的。

测试分子可以具有各种来源、性质和组成。它可以是任何有机或无机物质，例如脂质、肽、多肽、核酸、小分子、药物等，它是分离的或与其他物质形成混合物。例如，测试化合物可以是抗体、反义寡核苷酸或RNAi。所述分子例如可以是产物组合文库的全部或一部分。

调节意在指测试分子可以抑制或激活肌动蛋白聚合。可选地，测试分子也可以扰乱肌动蛋白丝组织，特别是肌动蛋白丝相互作用和肌动蛋白丝网络结构或网络。

在实验部分中，使用如上公开的装置测试了某些分子对肌动蛋白聚合的影响以及对聚合的肌动蛋白丝的影响（参见图6，其中研究了α-辅肌动蛋白和肌成束蛋白的影响）。可以观察到，本发明的图案通过提供可重复且可预测的肌动蛋白丝组织，允许观察测试分子对肌动蛋白丝组织的影响。具体来说，所述影响可以在肌动蛋白聚合期间进行观察，但是也可以在肌动蛋白丝聚合并由选定的图案组织后进行观察。

用于评估或确定测试分子对肌动蛋白聚合和/或肌动蛋白丝相互作用和/或肌动蛋白丝网络结构或网络的影响的方法，表现出几种用途。

在第一特定实施方案中，这种方法可用于根据所寻求的效果筛选分子并鉴定能够或不能调节肌动蛋白聚合、肌动蛋白丝相互作用和/或肌动蛋白丝网络结构或网络的测试分子。当所述分子对肌动蛋白的聚合表现出抑制剂活性时，本文公开的筛选方法允许鉴定可用于治疗肿瘤转移、血栓形成或骨质疏松症或用于抑制血管发生的分子；以及当所述分子对肌动蛋白的聚合表现出激活剂活性时，鉴定可用于改善伤口愈合或用于促进神经发生的分子。

在第二实施方案中，这种方法可用于评估分子的毒性，特别是分子的肌动蛋白毒性。这种毒性可以通过分子抑制肌动蛋白聚合或肌动蛋白解聚或阻止正常肌动蛋白丝网络形成的能力来评估。

所公开的装置也可用于评估或确定特定细胞提取物对肌动蛋白丝相互作用和/或肌动蛋白丝网络结构的影响。因此，本发明涉及本文公开的装置用于评估或确定确定特定细胞提取物对肌动蛋白丝相互作用和/或肌动蛋白丝网络结构的影响的应用。本发明还涉及用于确定特定细胞提取物是否调节肌动蛋白丝相互作用和/或肌动蛋白丝网络结构或网络的方法，其中所述方法包括使用特定细胞提取物制备或制造如上公开的肌动蛋白丝，并通过与参比细胞提取物进行比较来确定所述特定细胞提取物对肌动蛋白聚合、肌动蛋白丝相互作用和/或肌动蛋白丝网络结构或网络的影响。具体来说，所述方法包括：a）提供本发明的纳米或微米图案，b）将所述微米图案与特定细胞提取物相接触，c）通过与参比细胞提取物进行比较来观察肌动蛋白丝的结构和/或相互作用，由此确定特定细胞提取物是否调节肌动蛋白丝相互作用和/或肌动蛋白丝网络结构。本文所公开的图案的优点在于使用本发明的装置获得的肌动蛋白丝相互作用和肌动蛋白丝网络结构是可重复的。因此，比较在特定细胞提取物存在下的肌动蛋白聚合、肌动蛋白丝相互作用和肌动蛋白丝网络结构并与参比细胞提取物进行比较，是有可能并且准确的。具体来说，参比细胞提取物由健康细胞提供，并且特定细胞提取物由具有缺陷特别是与肌动蛋白丝相关的缺陷的细胞提供。

本发明也便于研究分子马达例如肌球蛋白。分子马达可以被添加在聚合混合物中，或者可以被添加在具有已经聚合的肌动蛋白丝的表面上。在分子马达作用下，肌动蛋白结构被弯曲或扭曲。通过研究肌动蛋白结构的变形，通过确定区域变形的次序，以及通过测量变形速度和取向，人们可以研究分子马达如何与肌动蛋白丝相互作用。此外，本发明还提供了用于鉴定能够调节分子马达活性或分子马达与肌动蛋白丝之间的相互作用的分子的方法。不使用本文所公开的装置，分子马达的体外研究是非常困难或者是不可能的，并且这种研究一般仅限于其中结构是不可预测且复杂的细胞内背景。在细胞内背景中，除了复杂的结构之外，还存在大量与肌动蛋白相互作用的蛋白质。因此，在这种复合体中，不能对肌动蛋白丝的明显可鉴定且可测量的变形进行观察和定量。类似地，通过在凝胶或其他肌动蛋白结构中研究分子马达，不可能或难以比较分子马达相互作用之前和之后的结构，这是因为肌动蛋白丝网络结构是随机的，因此全都不同并且不可比较。本发明的装置允许克服这些缺点并方便地研究分子马达。

定义

本发明中所使用的蛋白质的来源没有影响。可以使用任何来源的蛋白质，具体来说，各种来源的蛋白质可以被一起使用。

当在本文中使用时，术语“约”是指+/-10%、优选+/-5%。当然，当该术语与数值相连时，该术语可以被去除，并且在本文中总是设想了该精确的数值。

本发明的其他方面和优点将被公开在下面的实验部分中，所述实验部分应该被视为示例性的，并且不限制本申请的范围。

实施例

肌动蛋白丝构成细胞骨架的主要组分之一。特定的肌动蛋白细胞骨架结构例如分枝的网络或平行的肌动蛋白丝束，驱动明确的细胞功能。在本体溶液中或使用仿生装置从纯化的蛋白质进行肌动蛋白网络集合体的生物化学重建，已成为避开细胞复杂性和解译控制肌动蛋白组装的分子机制的强有力工具。这些方法突显了肌动蛋白结合蛋白如何在动态网络中影响肌动蛋白丝的生长和相互作用。然而，几何学边界例如在细胞中所遇到的那种如何影响高度有序的肌动蛋白结构的动态形成这一问题仍然在很大程度上未被研究。

在这里，本发明人证实了成核几何形状本身可能是肌动蛋白网络体系结构的首要决定因素。他们开发出一种微米图案化方法，所述方法允许对用于体外测定法的肌动蛋白成核位点进行空间控制。具体来说，他们在与细胞尺寸对应的尺度上调节成核位点的定位。形状、取向和成核区域之间的距离控制了肌动蛋白丝的取向和长度、肌动蛋白丝-肌动蛋白丝的相互作用和丝状伪足样束的形成。肌动蛋白丝生长和相互作用的建模证实了，基本的机械和概率法则控制更高级结构的肌动蛋白组装。

作为第一步，为了在体外精确调控肌动蛋白成核位点的位置，本发明人使用了最近开发的基于UV的微米图案化方法（Azioune等，2009）来为成核促进因子（NPF）pWA的定位产生模板（图1a）。pWA（SEQ ID No1）包含来自于WASP/Scar蛋白的C端结构域，所述WASP/Scar蛋白是在Arp2/3复合体和肌动蛋白单体存在下在预先存在的肌动蛋白丝上引发肌动蛋白聚合的普遍存在的蛋白质家族（Blanchoin等，2000；Machesky等，1999；Mullins等，1998）。将少量由纯化的蛋白肌动蛋白聚合的最小组合（2μM肌动蛋白单体（7%，用Alexa-568标记）、6μM肌动蛋白抑制蛋白和30nM Arp2/3复合体）制成的溶液置于pWA包被的微米图案化的载玻片与玻璃支持物之间。官能化的微米图案在其表面上特异性引发肌动蛋白丝成核，并促进肌动蛋白丝的2D生长（图1b）。作为对照，本发明人证实了，在不存在pWA包被的情况下，条形微米图案不能募集任何在溶液中自发组装的肌动蛋白丝（图1b）。这证实了官能化的微米图案在其表面上特异性引发肌动蛋白丝成核。肌动蛋白丝成核和生长的实时可视化突显了网络形成的自催化过程（图2）。这些网络由从pWA包被的区域生长的肌动蛋白丝产生，其中它们快速生长的刺端向外取向（图1c）。与肌动蛋白丝在玻璃杆上的生长一致，随着成核波传播，在微米图案上形成了致密且互连的网络（图2）。总体来看，除了在接近于条末端的狭窄区域中之外，从这个致密网络发出的肌动蛋白丝一般自我组织到微米图案的边缘（图1c-d）。尽管致密组织成平行网络，但通过添加交联因子，可以将这些肌动蛋白丝进一步聚集成更大的束，因此本发明人将其称为肌动蛋白丝而不是束。本发明人将不受随后添加交联剂影响的结构称为束（参见图6）。他们证实了肌动蛋白丝在微米图案上的生长对已知的生物化学参数敏感：肌动蛋白丝长度随着G-肌动蛋白的浓度而增加，随着Arp2/3或加帽蛋白的浓度增加而减小，并被α-辅肌动蛋白或肌成束蛋白成束（图2）。

本发明人利用了肌动蛋白生长的几何形状控制来研究彼此相向生长的两组肌动蛋白丝之间的相互作用。因此，他们分析了肌动蛋白从单个、同心或偏心圆的生长。20至30微米长的肌动蛋白丝成放射状向内和向外生长（图3a）。令人吃惊的是，由隔开15微米的三个同心圆产生的网络不简单地叠加，并且平行束的向心排列方式消失。相反，向内和向外生长的肌动蛋白丝之间的相互作用，在相邻圆之间形成短且细的的反平行束。有趣的是，肌动蛋白丝的延长似乎被在相邻圆上形成的致密肌动蛋白网络阻断。为了证实这一点，本发明人通过将在相同的微米图案上分别获取的几张图进行平均，对肌动蛋白网络局部密度进行了定量（图3b）。此外，为了理解肌动蛋白丝生长如何能够产生这些肌动蛋白密度分布情况，他们执行了数值模拟，其中将肌动蛋白丝沿着圆以恒定的线密度成核。肌动蛋白丝一般从圆生长出来，它们的长度由生物化学条件决定。然后允许肌动蛋白丝穿越或不穿越相邻的成核区域，并从模拟的肌动蛋白丝的局部密度推导出理论密度图（图3b）。数值模拟显示，在同心圆上，肌动蛋白丝不穿越位于其路径上的致密网络区域。相反，当分开的成核区域之间的距离被缩短时，正如在偏心圆的情形中，内圆中的密度不再各向同性。数值模拟证实，其他肌动蛋白丝进入这个最内部的区域，从而在局部增加了荧光强度（图3b）。这证实了短的并因此硬挺的肌动蛋白丝可以生长通过致密的网络，而较长且更柔性的肌动蛋白丝变得缠结在一起，并被相邻的肌动蛋白网络阻断。因此，除了生物化学信号之外，物理限制也调控肌动蛋白丝的长度。

为了进一步探索几何参数对肌动蛋白丝的相互作用及其得到的网络结构的作用，本发明人迫使肌动蛋白丝之间以各种角度接触。当从两个短条成核时，肌动蛋白丝首先垂直于所述条生长，然后相互作用并拉链式生长，以形成丝状伪足样平行束（图4a、图7），这令人联想起在体内出现的情形。这种相互作用迫使肌动蛋白丝弯曲，因此束的形成依赖于肌动蛋白丝改变其生长方向的能力。我们通过改变两个短条之间的角度测试了这个参数（图4b），并对平行束的形成进行定量（图4c）。对于接近于22°的成核条角度来说，肌动蛋白丝缔合成短且细的反平行束。只有在大于22°至45°之间的临界角时才开始形成平行束，并且平均图像分析证实存在促进大量肌动蛋白丝聚结成平行束的最适角度（图4d）。

由于本发明人证实了肌动蛋白丝的长度和刚性调节它们与肌动蛋白丝网络的相互作用，因此他们调查了在两个成核区域之间的给定角度下，距离的变化是否影响束的形成。为此目的，他们设计了8分枝的放射状阵列，其中放射线从原点开始里外移动。正如所预期的，肌动蛋白丝从每个放射线向外生长，并在相邻放射线之间的对分线上形成平行的束（图5a、b和图7）。当放射线足够远时，短的平行束沿着对分线精确地形成并维持它们的取向。随着放射线之间的距离减小，束变得更长、错位且弯曲（图5b、c）。在所有情形中，在放射线的近端部分中反平行束的组装与其远端部分中平行束的组装之间的转变，在相当可变的位置处发生（图5d、e）。因此，在所测试的范围内，成核位点之间的距离对于最终结构的产生不是关键的。从反平行束转变成平行束的位置，可以作为肌动蛋白丝的固有性质和集体组装的结果进行建模（图5f）。如果肌动蛋白丝在网络的近端部分中专一地组装成反平行束，则彼此接触的肌动蛋白丝组装成平行束的概率为p。这种固有概率p只取决于肌动蛋白丝的取向，并因此取决于它们沿着放射线的位置（图1d）。如果肌动蛋白丝在近端网络中形成平行束，则相遇的肌动蛋白丝被迫弯曲并促成这种平行束。因此形成平行束的概率Q由下式给出：

Q(y+1)＝p(y)(1-Q(y))+Q(y)  (1)

其解为

$>Q\left(y\right)=1-\underset{k=0}{\overset{y-1}{\Pi }}(1-p(k\left)\right)---\left(2\right)$>

其中y是表征沿着对分轴的位置的离散变量。从概率函数Q获得的转变位置与实验数据精确匹配（图5g）。由于转变点产生由所有远端肌动蛋白丝构成的平行束，因此本发明人计算了与每个转变点相关的束的大小和荧光强度。模型准确解释了由肌动蛋白丝组装成束造成的荧光增加和由束中各种不同的肌动蛋白丝长度造成的荧光降低两者（图5h）。在两种不同的肌动蛋白交联剂存在下，这些几何形状介导的束也以浓度依赖性方式出现（图6）。这证实了束的出现受到肌动蛋白丝机械性质的严密控制。

由本发明人执行的丝状伪足样束的重建依赖于前体结构的自发形成，所述前体结构由从致密肌动蛋白网络发出的肌动蛋白丝的崩溃和进一步的聚结所形成，并且相邻的延长的肌动蛋白丝将系统性地会聚于所述前体结构。有趣的是，由前体、例如与体内观察到的外张丝状伪足根（splayed filopodial root）对应的Λ-前体所引发的肌动蛋白丝的这种伸延性聚结，解释了细胞中平行束从周围的致密网络出现。此外，这种伸延性过程解释了束中短肌动蛋白丝的存在，这与板状伪足的前缘处存在高的刺端加帽活性相一致。

本发明的创新性方法证实了，独立于肌动蛋白结合蛋白的混合物，成核几何形状在决定肌动蛋白丝网络结构体系中发挥关键作用。相邻成核区的相应定位导致肌动蛋白丝缠结成网络并控制它们的长度。肌动蛋白丝的取向决定了它们与邻近肌动蛋白丝相互作用并形成束的能力。从根本上说，基本的机械和概率法则控制着反平行和丝状伪足样平行肌动蛋白丝对确定的几何边界条件做出响应的空间排列方式。扩展到活细胞，本工作强调了成核区的空间和时间组织的重要性，所述空间和时间组织产生特定的肌动蛋白网络结构体系，并因此控制力产生的位置。尽管已知肌动蛋白生长的时空调控影响细胞形状，但本工作以定量方式揭示出细胞内或细胞周围的相互物理边界控制了肌动蛋白细胞骨架的结构体系。

材料和方法

蛋白质表达和纯化：肌动蛋白纯化自兔骨骼肌丙酮粉末（MacLean-Fletcher&Pollard，1980；Spudich&Watt，1971）。按照Isambert等（1995）的方法用Alexa-488在赖氨酸上标记肌动蛋白。Arp2/3复合体按照Egile等（1999）的方法纯化自牛脑提取物。GST-pWA、按照以前描述的方法（Almo等，1994；Falck等，2004；Machesky等，1999）来表达和纯化人肌动蛋白抑制蛋白和小鼠加帽蛋白。

微米图案化：将玻璃盖玻片用氧等离子体氧化（10s，30W，HarrickPlasma,Ithaca,NY），并与0.1mg/ml聚赖氨酸-L-g-聚乙二醇（PLL-PEG）（JenKem Technology，TX）在10mM pH7.4的HEPES中温育1h。使用自制真空支架将聚乙二醇化的盖玻片置于铬合成石英光掩模（Toppan Photomasks，Corbeil，France）上。光掩模的铬层含有3μm宽的透明微米图案。然后将掩模覆盖的盖玻片暴露于深紫外光（l<200nm，UVO Cleaner，Jelight Company，Irvine，CA）5min，并用0.5μM的成核促进因子pWA溶液包被15min。

肌动蛋白聚合：将蛋白质混合物在新鲜制备的荧光缓冲液中稀释以引起肌动蛋白聚合，所述缓冲液含有10mM咪唑-HCl（pH7.8）、50mM KCl、1mM MgCl₂、100mM二硫苏糖醇、3mg/ml葡萄糖、20μg/ml过氧化氢酶、100mg/ml葡萄糖氧化酶和0.5%甲基纤维素。在含有2μM肌动蛋白单体（7%，用Alexa568或Alexa488标记）和6μM肌动蛋白抑制蛋白以及30nM Arp2/3复合体的溶液中引起肌动蛋白聚合。

图像获取：使用装备有40x干物镜（UPLFLN，NA=0.75）、XY马达驱动载物台（Marzhauser，Germany）和CoolSnap HQ2相机（RoperScientific，GmbH，Germany）的立式BX61Olympus显微镜获取图像。显微镜和装置由MetaMorph（Molecular Devices，downington，PA）驱动。

图像处理：使用相同的光强度和曝光时间获取所有图像。然而，在进行重叠和平均之前，调整图像的灰度以具有相同的最小和最大灰度值。使用来自于Image J软件的“非锐化掩模”（unsharp mask）和“高斯模糊”（Gaussian blur）滤镜对显示的图像进行过滤，以从背景中突显肌动蛋白丝。

全内反射荧光显微术：在装备有50mW488nm激光器和QuantEM512SC–定量EMCCD相机（Roper Scientific）的Nikon TE2000E倒置显微镜上执行全内反射荧光的获取。

参考文献

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