丝状真菌蛋白分泌压力反馈调控元件与抗反馈抑制的启动子、质粒及制备方法和转化细胞

摘要

本发明公开一种丝状真菌蛋白分泌压力反馈调控元件与抗反馈抑制的启动子、质粒及制备方法和转化细胞，该调控元件为丝状真菌启动子-378bp～-291bp区域的碱基序列。该调控元件与蛋白分泌压力反馈相关。抗反馈抑制的启动子为丝状真菌启动子上至少缺失或者替换掉-378bp～-291bp区域的碱基所得的碱基序列、并且具有启动子活性。本发明的启动子可以在丝状真菌，特别是在米曲霉中蛋白能够高效表达。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域。具体而言，本发明涉及与丝状真菌中蛋白分泌压力反馈调节相关顺式元件，和一种在丝状真菌中如米曲霉（Aspergillus oryzae）中由于缺失蛋白分泌压力反馈顺式调控元件而解除分泌压力反馈抑制的蛋白高效表达的启动子。 

背景技术

丝状真菌具有很强的蛋白质分泌能力，能正确的进行蛋白翻译后的加工修饰，其糖基化途径接近哺乳动物，特别是其曲霉属长期应用于传统的食品和饮料工业，是公认的安全生产菌株，是理想的工业化生产重组蛋白宿主菌（Nevalainen KM等，2005）。但与同源蛋白产量相比，丝状真菌生产异源蛋白的产量却相当低，对其的限制因素分析表明，外源基因的转录及mRNA稳定性水平总体上是令人满意的，其生产中瓶颈主要存在于转录后的阶段，即在分泌途径中（Conesa A等，2001；Gouka RJ等，1997）。对真核生物蛋白分泌途径中主要的限制因素分析显示：分泌蛋白在内质网的折叠和修饰是最主要的限速步骤（Raden D等，2005；Gasser B等，2008）。内质网中蛋白折叠的质量控制主要是由两种细胞机制参与：非折叠蛋白应答机制（unfolded protein response,UPR）负责感应和监测内质网中存在未折叠的蛋白质并诱导激活与蛋白折叠相关的分子伴侣和折叠酶、蛋白修饰、运输相关的基因表达，以加强细胞处理非折叠蛋白的能力；另一个是内质网相关的蛋白质降机制（ER-associated protein degradation,ERAD）,负责清理降解那些没有形成正确构象的恶蛋白质（Nevalainen KM等，2005；Conesa A等，2001；Gasser B等，2008）。在异源蛋白的表达、培养条件改变、化学物刺激、致病菌感染等应激条件将影响内质网中蛋白的正确折叠，并导致内质网中非折叠蛋白积累。内质网在上述压力条件下通过诱导UPR机制和ERAD机制，协调作用维持蛋白分泌途径的折叠能力，调节并保持内质网在分泌应激条件下自体状态的稳定性（Travers KJ等，2000）。哺乳动物UPR机制总体效应不仅增加了与蛋白折叠相关的分子伴侣和蛋白修饰酶的数量,同时还通过抑制蛋白翻译减少了由核糖体进入内质网的蛋白量，并通过增强内质网蛋白降解（ERAD）来增加未折叠蛋白清除能力。相比之下，酵母的UPR机制缺乏相应的蛋白翻译水平的负反馈调节效应（Patil C等，2001；Ma Y等，2001）。值得关注的是丝状真菌的UPR机制与酵母类似，同样缺乏内质网压力下蛋白翻译水平的负反馈调节，但是在丝状真菌中却存在独特的反馈机制，在内质网压力在转录水平反馈抑制分泌蛋白基因表达，从而阻止或减少了进入内质网的蛋白量的负调控机制（蛋白分泌压力反馈机制Repression under secretion stress，RESS）（Al-Sheikh H等，2004；Pakula TM等，2003）。构巢曲霉、黑曲霉、里氏木霉的功能基因组分析显示在内质网压力下主要分泌酶系基因的表达都受到抑制（Guillemette T等，2007；Arvas M等，2006；Sims AH等，2005）。 

过量表达外分泌蛋白或药物刺激，如二硫苏糖醇（DTT）、衣霉素、Ca²⁺离子载体刺激诱导产生蛋白压力，从而产生UPR效应。在丝状真菌中，在蛋白压力下，外分泌蛋白mRNA转录水平表达受到抑制，称为蛋白分泌压力反馈机制（RESS）。目前报道对RESS机制研 Hashem Al-Sheikh等，2004）、里氏木霉（Tiina M.Pakula等，2003）和米曲霉（Bin Wang等，2010）。Hashem Al-Sheikh等在黑曲霉中研究了葡萄糖淀粉酶（glaA）基因的启动子最后确定与RESS机制相关的启动子区域确定在启动子上游1kb-2kb之间。Tiina M.Pakula等在里氏木霉中研究纤维二糖水解酶1（CBH1）基因的启动子最后确定与RESS机制相关的启动子区域确定在启动子上游161bp-2200bp之间。王斌等使用RNA-SEQ技术对米曲霉的转录组进行解析，发现很多外分泌蛋白基因是与RESS机制相关的，但是没有对这些基因的顺式转录调控区进行深入的分析。 

米曲霉能分泌大量的淀粉酶（Taka-amylase）。淀粉酶的表达是受淀粉、麦芽糖诱导，但同时也受葡萄糖（Kozo TSUCHIYA等，1992）阻遏,这些效应主要是受启动子上顺式作用元件调控的。目前对淀粉酶amyB基因(Taka-amylase B)启动子顺式转录调控区功能分析，主要是常规功能元件分析。例如，Kozo TSUCHIYA等和Yoji KANEMORI等通过缺失和融合分析，确定在启动子上存在regionⅠ、regionⅡ、regionⅢ三个与蛋白表达相关的功能区域。但是直到目前为止，仍未见对amyB基因启动子的RESS机制顺式作用调控元件的报道。 

发明内容

鉴于以上现状，本发明的目的之一是找出与RESS机制相关的顺式转录调控元件（87bp）。 

本发明目的之二是基于该机制构建一个能够抗分泌压力反馈抑制的启动子。 

本发明目的之三在于提供由上述启动子构建的质粒载体及其制备方法。 

本发明目的之四在于提供一种转化细胞。 

本发明的目的通过以下技术方案实现： 

丝状真菌蛋白分泌压力反馈调控元件，该调控元件为丝状真菌启动子-378bp～-291bp区域的碱基序列。所述碱基序列如SEQ ID NO.1所示。调控元件具有如下特点： 

（1）包含SEQ ID NO.1序列的amyB基因启动子，在蛋白分泌压力条件下该启动子所连接的外源分泌蛋白的转录水平受到蛋白分泌压力的反馈抑制； 

（2）不包含SEQ ID NO.1序列的amyB基因启动子，在蛋白分泌压力条件下该启动子所连接的外源分泌蛋白的转录水平解除蛋白分泌压力的反馈抑制； 

（3）与SEQ ID NO.1所示的碱基序列在严谨条件下能够杂交，并且具有蛋白分泌压力反馈抑制功能的核苷酸序列，可以是来源于米曲霉也可以是其它的丝状真菌。 

本发明的上述启动子可以通过如实施例1所述的方法得到，也可以在鉴定碱基序列后，通过化学合成方法获得。 

一种抗蛋白分泌压力反馈抑制的启动子，该启动子为丝状真菌启动子上至少缺失或者替换掉-378bp～-291bp区域的碱基所得的碱基序列、并且具有启动子活性。所述丝状真菌启动子为amyB启动子。该启动子为碱基序列如SEQ ID NO.2所示。SEQ ID NO.2所示的序列，在蛋白分泌压力条件下该序列所连接的外源分泌蛋白的转录水平不发生下调。 

本发明启动子不仅可以是SEQ ID NO.2所示的DNA，也可以是包含上述碱基序列号中所示碱基的DNA，只要与其具有相似调控功能。还可以是包含在上述碱基序列号所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少一个碱基所得的碱基序列的DNA，以及与SEQ ID NO.2所示的碱基序列在严密条件下杂交，并具有相似调控功能的、来自米曲霉的DNA或者是 

本发明的DNA优选包含与SEQ ID NO.2所示碱基序列具有75%以上同源性的碱基序列，同源性优选为80%以上，最优选90%以上，更优选95%以上，进一步优选98%以上。 

本发明中，“相似功能”的启动子是指其通过后述功能分析测试基因的转录水平为上述碱基序列号中所示的DNA在相同条件下检测的转录水平的50%以上，优选为70%以上，最优选80%以上，更优选90%以上，进一步优选95%以上。 

一种质粒，将上述的启动子连接到目标核酸序列上所构建的基因表达单元。 

具体构建方法如下：以SEQ ID NO.3为模板，设计两对引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，PCR扩增单独的两个片段；再使用引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.7，采用融合PCR方法将两个单独的片段融合成一个基因表达框，同时将该融合的大片段磷酸化；将pPTRⅠ质粒用SmalⅠ酶切并去磷酸化；将SmalⅠ酶切载体和融合片段，连接、转化得到质粒PTAF7891。其DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO.8所示。另外，本发明所用的质粒可以是PUC119，pPTRⅠ等。 

本发明中，可以将上述质粒转化到丝状真菌宿主细胞，使目的基因得到表达。也可以，将整个表达单元直接以DNA直接整合到宿主染色体中。这里的宿主优选为丝状真菌，特别优选为米曲霉（Aspergillus oryzae）。按照常规的方法用本发明的质粒转化宿主细胞，例如用氯化钙法转化大肠杆菌，用PEG介导原生质体转化方法转化米曲霉。 

用所得到的转化菌株来分析各种碎裂启动子功能，可以将转化子用其可以利用的碳源和氮源进行培养来进行。培养时用碳源20克，氮源3克，KCl2克，MgSO₄.7H₂O0.5克，K₂HPO₄1克，FeSO₄.7H₂O0.01克，pH5.5。本发明所用的碳源优选为淀粉、麦芽糖、葡萄糖。氮源优选为硝酸钠、亚硝酸钠、多聚蛋白胨、蛋白胨。对培养温度、培养时间没有特殊限制，只要适合菌体生长即可，但优选在25-37℃，培养时间12～96小时。培养完成的菌体分析菌体中报告基因mRNA的量。 

功能元件分析可以通过下面的方法进行，该方法能够特异性的检测出启动子下游连接的基因转录的mRNA量。对分析方法没有特殊的要求，可以是荧光定量PCR(qPCR)也可以是Northern Bloting。 

功能元件的筛选：截断启动子和重组启动子功能分析可以通过测定有该启动子连接的报告基因的mRNA水平或者是mRNA翻译产物的量来进行。 

本发明的启动子在其下游连接报告基因是，可以使该报告基因表达功能。对本发明所用的报告基因可以是碱性蛋白酶、脂肪酶、荧光蛋白、抗体等不同来源的有用蛋白基因等，优选为米赫根毛霉脂肪酶（rml）。 

本发明的启动子、下游连接的报告基因以及终止子可以用作基因表达单元。这里的终止子可以使用常用的终止子，只要能用于表达系统。如amyB、glaA、agdA等。 

米曲霉在化学阻断剂处理如二硫苏糖醇(DTT)和衣霉素、不同培养条件下如固体与液体培养、碳氮源变化以及异源蛋白过量表达等内质网压力对蛋白分泌途径影响下会产生RESS机制。故本发明采用的方法是在药物刺激下，检测报告基因mRNA水平。不同长度的启动子转化子，在DTT的诱导下，以GAPDH(三磷酸甘油醛脱氢酶)为参考基因，比较报告基因rml的mRNA相对表达量。结果显示在amyB基因的启动子上存在87bp顺式转录调控元件与RESS机制相关。 

通过比较上述方法构建的转化子在不同培养条件下：外源蛋白压力条件（DTT诱导）与正常培养条件（未加DTT诱导），报告基因rml的mRNA的转录水平变化，来比较上述启动子的转录活性。结果显示，由启动子P_△F378-291和rml所构建的表达单元，在蛋白分泌压力条件下，报告基因rml的mRNA转录水平是不受抑制，故表明该启动子是抗蛋白分泌压力反馈调控抑制。同时该启动子在蛋白压力条件下，随着诱导时间的增加，报告基因rml的mRNA的相对表达量较正常培养条件下有不同程度的提高。其具体数值体现在，报告基因rml的相对表达量在1小时提高1.45倍，在2小时提高2.93倍，在4小时提高8.97倍，在6小时提高11.95倍。同时对P_△F378-291启动子和P_amyB1110启动子与rml所构建的表达单元的米曲霉转化子AO3821和AO1110进行摇瓶发酵（发酵条件未优化）。发酵72小时，测定脂肪酶酶活：AO3821酶活是1.8513U/mL；AO1110酶活是1.6884U/mL。该抗反馈抑制启动子的转化子较未改造的启动子的转化子脂肪酶活力提高了10%左右，说明该启动子是抗蛋白分泌压力反馈调控抑制。同时这两株菌的酶活要高于该种类型的脂肪酶在酵母中的表达。ZhangW-G等（2008）和江逢春等（2010）研究脂肪酶在在酵母中表达时，得到的酶活分别为0.3U/mL和1.4U/mL。可见，本发明的启动子可以在丝状真菌，特别是在米曲霉中蛋白能够高效表达。 

附图说明

图1为本发明使用的出发质粒PTA1110。 

图2为本发明步骤7中初筛转化子的透明圈。 

图3为本发明步骤3、4中不同启动子长度的载体构建过程。 

图4为本发明步骤7中截断启动子转化子PCR鉴定策略示意图。 

图5为本发明步骤7中融合缺失启动子转化子PCR鉴定策略示意图。 

图6为本发明步骤8中mRNA琼脂糖电泳图。 

图7为本发明步骤10中haciA基因（a）和amyB基因（b）在蛋白压力下的转录情况。 

图8为本发明步骤10中amyB基因截断启动子所连接的报告基因rml，在蛋白压力下mRNA的转录水平。 

图9为本发明步骤10中amyB基因全长融合缺失启动子所连接的报告基因rml，在蛋白压力下mRNA的转录水平。 

具体实施方式

实施例1 

1、PTA1110和pPTRⅠ质粒DNA的提取 

含有全长amyB基因启动子和报告基因rml和agdA基因终止子的质粒PTA1110和带有PT（吡啶硫胺素）抗性质粒pPTRⅠ(购自Takara公司)都可采用市售质粒提取试剂盒提取。 

2、碎裂启动子和融合缺失启动子的构建 

2.1碎裂启动子的构建 

根据已报道的米曲霉amyB基因启动子序列，设计引物对amyB基因启动子进行改造。设计碎裂启动子引物将amyB基因启动子自5＇端依次截断成14个不同的片段的基因表达单元：P_amyB941（启动子区域-941bp～-1bp，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.7）；P_amyB871(启动子区域-871bp～-1bp，SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.7）；P_amyB766(启动子区域-766bp～-1bp，SEQ  和SEQ ID NO.7）；P_amyB674（启动子区域-674bp～-1bp，SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.7）；P_amyB582（启动子区域-582bp～-1bp，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.7）；P_amyB499（启动子区域-499bp～-1bp，SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.7）；P_amyB419（启动子区域-419bp～-1bp，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.7）；P_amyB378（启动子区域-378bp～-1bp，SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.7）；P_amyB358（启动子区域-358bp～-1bp，SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.7）；P_amyB329（启动子区域-329bp～-1bp，SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.7）；P_amyB291（启动子区域-291bp～-1bp，SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.7）；P_amyB234（启动子区域-234bp～-1bp，SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.7）；P_amyB182（启动子区域-182bp～-1bp，SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.7）；P_amyB73（启动子区域-73bp～-1bp，SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.7）。 

2.2融合缺失启动子的构建 

通过缺失和融合PCR的方法设计引物构建缺失部分片段的重组amyB基因启动子：P_△F378-291（融合缺失启动子区域-378～-291后构建的新启动子，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7）；P_△F378-358（融合缺失启动子区域-378～-358后构建的新启动子，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.23；SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.7）；P_△F358-291（融合缺失启动子区域-358～-291后构建的新启动子，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.25；SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.7）；P_△F378-329（融合缺失启动子区域-378～-329后构建的新启动子，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.27；SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.7）；P_△F329-291（融合缺失启动子区域-329～-291后构建的新启动子，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.29；SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.7）；P_△F342-318（融合缺失启动子区域-342～-318后构建的新启动子，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.31；SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.7）；P_△F419-358（融合缺失启动子区域-419～-358后构建的新启动子，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.33；SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.7）。 

3、amyB基因碎裂启动子表达单元及载体的构建 

以上述步骤2.1中14组DNA为引物，以步骤1所制备的PTA1110为模板进行PCR扩增得到14个片段。扩增使用的是Takara公司PrimeSTAR^R○HS DNA Polymerase PCR DNA聚合酶。扩增条件，95℃5分钟，98℃15秒，退火温度根据不同的引物设定15秒，72℃根据不同的扩增片段长度设定时间，30个循环，72℃10分钟，16℃保温。得到不同长度的启动子表达单元，同时对扩增的PCR产物进行磷酸化，磷酸化过程参考Takara T4PNK说明书。同时对步骤1中的pPTRⅠ质粒使用SmalⅠ酶切并去磷酸化，该过程使用的是Thermo Scientific FastDigest SmalⅠ限制性内切酶和Thermo Scientific FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase去磷酸化酶(购自Thermo Scientific公司)，具体使用过程参考该产品的使用说明书。将上述处理过的14个PCR产物分别与酶切载体pPTRⅠ，使用Takara公司的连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2.0，16℃，过夜连接。之后，将过夜连接反应液转化大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli），提取质粒进行测序。测序结果显示，本发明构建的一系列碎裂amyB基因启动子的表达单元序列与amyB基因启动子在相应位置的碱基序列是一致的，上述启动子截断片段所对应的质粒名称为PTA941、PTA871、PTA766、PTA674、PTA582、PTA499、PTA419、PTA378、PTA358、PTA329、PTA291、PTA234、PTA182、PTA73。具体构建的过程如图3所示。 

4、amyB基因融合缺失启动子表达单元和载体的构建 

分别以上述步骤2.2中7组DNA为引物，以步骤1所制备的PTA1110为模板进行PCR扩增得到7组DNA,每组DNA有两个片段。具体而言，扩增使用的是Takara公司PrimeSTAR^R○RHS DNA Polymerase PCR DNA聚合酶。每组引物，扩增条件，95℃5分钟，98℃15秒，退火温度根据不同的引物设定15秒，72℃根据不同的扩增片段长度设定时间，30个循环，72℃10分钟，16℃保温。分别扩增得到两个片段。再以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.7所示的DNA为引物，以上述的两个片段为模板进行重组PCR,具体是95℃5分钟，98℃15秒，68℃4分钟，30个循环，72℃10分钟，16℃保温。得到7个不同融合缺失启动子表达单元。同时对扩增的PCR产物进行磷酸化，磷酸化过程参考Takara T4PNK说明书。同时对步骤1中的pPTRⅠ质粒使用SmalⅠ酶切并去磷酸化，该过程使用是Thermo Scientific FastDigest SmalⅠ限制性内切酶和Thermo Scientific FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase去磷酸化酶，具体使用过程参考该产品的使用说明书。将上述处理过的PCR产物与酶切载体pPTRⅠ，使用Takara公司的连接试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2.0，16℃，过夜连接。之后，将过夜连接反应液转化大肠杆菌，提取质粒进行测序。 

测序结果显示，本发明构建的一系列融合缺失的amyB基因启动子的基因表达单元与amyB基因启动子在相应位置的碱基序列是一致的，上述启动子融合缺失片段后所对应的质粒名称为PTAF7891、PTAF7858、PTAF2991、PTAF4218、PTAF1958、PTAF5891、PTAF7829，具体构建的过程如图3所示。 

5、米曲霉外源基因的导入 

用PEG-CaCl₂法介导转化米曲霉（Aspergillus oryzae niaD300,购自日本NRIB研究所） 

取适量米曲霉的新鲜孢子接种到50ml的DPY培养基(2%葡萄糖，1%蛋白胨，0.5%酵母抽提物，0.5%K₂HPO₄，0.05%MgSO₄)中，30℃，培养20-24小时。过滤，并用0.8M NaCl冲洗菌体后，加入用0.8M NaCl和10mM磷酸盐缓冲液（pH6.0）配制的酶液（1%纤维素+1%蜗牛酶+0.5%溶菌酶）中后，30℃温浴3小时收集原生质体，将步骤2、3得到的质粒分别和原生质体按比例混匀后，加入PEG介导转化，转化的具体过程参考Takara公司pPTRI DNA（Code No.3621），使用说明书。30℃培养5-10天，挑选PT抗性的转化子。通过上述转化获得步骤2、3中构建的包含不同启动子长度的转化子。 

6、米曲霉基因组DNA的提取 

取适量摇瓶液体培养米曲霉菌丝过滤抽干，得到的菌丝用液氮研磨到细粉状，同时将研磨好的菌丝转移到装有700ul的溶菌缓冲液（50mM Tris-HCl pH8.0，50mM EDTA，3%SDS，1%巯基乙醇）的2ml离心管中，60～65℃，水浴1h。然后，加入等体积的Tris-酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）后，上下轻轻颠倒混匀。12000g/min离心15min。取上清到另外一个离心管中，重新用等体积Tris-酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提后，取上清到一个新离心管中，加入2.5倍体积的冷无水乙醇，颠倒混匀后，-20℃放置30min。12000g/min，4℃，15min。弃上清，以75%乙醇洗涤沉淀两次后，室温干燥。用适量的含有50ug/ml的RNase的水溶液溶解沉淀。沉淀溶解后保存在-20℃备用。 

7、米曲霉转化子的鉴定 

（1）初筛 

本发明中的不同长度启动子构建的基因表达单元中，所用的报告基因是米赫根毛霉的脂肪酶基因（rml）。将转化子用牙签挑到含有三丁酸甘油酯的CD（0.2%PVA-124，0.5%三 0.3%NaNO₂，0.2%KCl，MgSO₄.7H₂O0.05%，0.001%FeSO₄.7H₂O，0.1%K₂PHO₄,2%葡萄糖，0.25%曲拉通-100，pH5.5，2%琼脂粉）平板上，30℃培养过夜，看是否会产生透明圈，如图2所示，有透明圈说明报告基因rml在宿主中表达了。 

通过上述方法初步筛选出不同启动子的转化子。 

（2）转化子的PCR鉴定 

以步骤5中的方法提取产生透明圈转化子的基因组并以此为模板，鉴定转化子。鉴定的方法策略如图4、5所示。图4，在鉴定amyB基因截断启动子的转化子时，使用引物1，引物2，引物3、引物4，4对引物。引物1包含在截断启动子区域内故一定能扩增出与转化片段相差不大条带；引物2是该启动子的截断特异性引物刚好能扩增出转化子转入片段；引物3和引物4不包含在片段启动子区域（图中用虚线表示）内故得不到扩增产物，非特异性扩增除外。图5，在鉴定amyB基因融合缺失启动子的转化子时，使用引物1，引物2，引物3、引物4、引物5，5对引物。引物1包含在融合缺失启动子区域内故一定能扩增出与转化片段相差不大条带；引物2是该启动子融合缺失特异性引物刚好能扩增出转化子转入片段；引物3和引物4不包含在融合缺失启动子区域（图中用虚线表示）内故得不到扩增产物，非特异性扩增除外，引物5在融合区之外故可以扩增出目的条带。 

同时将该扩增的PCR产物测序。测序结果显示测序的碱基片段序列与自己设计的序列一致。 

8、米曲霉RNA的提取 

将转化子的孢子接种到CD-P液体培养基(0.3%蛋白胨，0.2%KCl，0.05%MgSO₄.7H₂O，0.001%FeSO₄.7H₂O，0.1%K₂PHO₄，2%葡萄糖，pH5.5)中（200ml/1000ml），使孢子终浓度达到10⁶个/ml，培养24小时后，在无菌的条件下过滤收集菌体。将菌体均分到10瓶新鲜的CD-P培养基（50ml/250ml），同时将其分为5组。培养6小时后，每组中1瓶加入新鲜配制的DTT使终浓度达到20mM，对照加入等体积的水。诱导30min、60min、120min、240min、360min后液氮研磨，加入TRIZO溶解菌体（100mg菌体/1ml TRIZO）。RNA的提取步骤参考Takara公司产品RNAiso Plus（D9108B）说明书。将提取的RNA用无RNA酶ddH2O溶解并稀释到1ug/ul以下，-80℃保存。同时进行普通的琼脂糖电泳，确定RNA的完整性和污染情况，如图6所示。 

9、米曲霉RNA的RT-PCR 

以步骤7中的RNA为模板，使用Takara公司primeScript^○RRT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录试剂盒合成cDNA，反转录反应分两步完成，第一步反应是去除RNA中污染的基因组，反应时间42℃，2分钟；第二步反应是在第一部的基础上进行反转录，反应程序：37℃，15分钟；85℃，5秒。具体操作过程参考该试剂盒说明书。 

10、启动子的功能分析 

参考王斌等（Bin Wang等，2010）和叶蕾等（YE,L等，2008）以GAPDH（三磷酸甘油醛脱氢酶）为参考基因，检测引物为SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36。报告基因rml基因检测引物SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38。haciA基因是UPR机制直接相关的关键转录因子，在蛋白压力条件下，haciA基因mRNA水平会发生上调，如图7所示。haciA基因检测引物SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40。amyB基因是与RESS机制相关的效应基因，在蛋白压力条件下amyB基因的mRNA会发生下调，如图7所示，amyB基因检测引物SEQ ID  和SEQ ID NO.42。对不同的转化子的上述基因的mRNA水平进行qPCR分析。反应使用的8排管是购自AXYGENE，荧光定量试剂是SYBR^R○Premix Ex Tap^TMⅡ(Tli RNaseH Plus);反应体系是：10ul（各成分配比参照说明书）；程序：95℃30秒，95℃5秒，60℃34秒，40个循环，在循环完成后对扩增产物进行溶解曲线分析。使用的仪器：ABI7500荧光定量PCR仪。在图8和9显示与RESS机制相关的87bp顺式作用元件在amyB基因启动子上的具体区域和去除该元件后通过融合所得到的启动子P_△F378-291在蛋白压力下所连接报告基因rml的mRNA表达量。如图8通过截断分析可以看出启动子的长度在-378bp～-1bp时，在蛋白压力下，rml的mRNA水平下调；但在启动子的长度在-291～-1时，在蛋白压力下，rml的mRNA不发生下调。从而说明87bp顺式作用调控区与RESS机制相关。如图9通过融合缺失分析发现，amyB基因全长启动子只有缺失了-378～-291这个区域时构建的新启动子P_△F378-291，在蛋白压力下，rml的mRNA是不受抑制的。 

实施例2 

1、米曲霉转化子发酵 

将P_△F378-291启动子和P_amyB1110启动子与rml所构建的表达单元的米曲霉转化子AO3821和AO1110接种到50mL（500mL的挡板摇瓶）的发酵培养基（0.3%蛋白胨，0.2%KCl，0.05%MgSO₄.7H₂O，0.001%FeSO₄.7H₂O，0.1%K₂PHO₄，2%麦芽糖，pH5.5）中，孢子终浓度达到10⁶个/ml。在30℃，200r/min条件下发酵。 

2、酶活的测定方法 

PNPC酶活测定方法如下所示： 

（1）向1.5mL的离心管中加入480μL的Tris-HCl缓冲液（50mM pH8.0）和500μL的PNPC（4-硝基苯基苯酚酯）溶液，混匀后在40℃水浴5分钟； 

（2）向（1）中加入20μL的发酵液，混匀后在40℃水浴10分钟； 

（3）向（2）中加入20μL5%的TCA（三氯乙酸），混匀后在40℃水浴2分钟； 

（4）取（3）中的反应液200μL至酶标板中，用酶标仪测定A₄₀₅吸光值。 

3、酶活力单位计算公式： 

$U=\frac{A_{405}\times 0.12\times 1000\mathrm{uL}}{V\times T}$

酶活单位（U）定义为：每分钟水解底物生成1μmol具有颜色对硝基苯酚所需的酶量。 

V：反应体系中加入发酵液的体积(L)。 

T：加入发酵液后反应时间 

4、酶活测定 

培养72小时终止发酵。取发酵液上清按照上述方法测定酶活。结果显示：AO3821酶活是1.8513U/mL；AO1110酶活是1.6884U/mL。