一种检测水中有机污染物遗传毒性的方法

摘要

本发明提供了一种有机污染物遗传毒性的检测方法。该方法包含以下步骤：(1)用含有机污染物待测样品的水溶液暴露处理稀有鮈鲫；(2)检测暴露处理后的稀有鮈鲫的外周血红细胞，统计细胞微核率，并绘制剂量-效应曲线。本发明的检测方法灵敏、简便、快捷、更直观、准确，结果重现性好，对于水质遗传毒性研究具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于水环境研究领域，涉及一种检测有机污染物遗传毒性的方法。

背景技术

环境污染加重，给人们的健康带来威胁。各种研究方法已开展对遗传毒性进行评 价，自Heddle等首次提出微核试验至今，微核试验因其经济、简便易行、可信度高等 优点越来越广泛的应用于染色体/纺锤体损伤效应的检测。

水环境中的遗传毒物能诱发鱼体产生微核，通过监测鱼类红细胞微核率的变化可 研究外源物的遗传毒性和评价环境水质。目前，研究者已对多种鱼的红细胞微核试验 的有效性进行讨论，国内学者应用中国传统鱼类鲫鱼、鲤鱼、鲢鱼及鳙鱼等成功地采 取原位测试评价环境水质，证实鱼类外周血红细胞作为监测遗传毒物染色体损伤的生 物标志物的可行性。而随着经济发展和工业化进程加剧，使得水体受大量有机污染物 污染，其中许多属于致癌、致畸、致突变物质。对于水体中有机污染物对稀有鮈鲫外 周血红细胞遗传毒性试验方法检测研究尚未开展。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测样品中有机污染物的遗传毒性的检测方法，包 含以下步骤：

(1)用待测样品的水溶液，暴露处理稀有鮈鲫；

(2)检测暴露处理后的稀有鮈鲫的外周血红细胞，统计细胞微核率。

所述检测方法是根据细胞微核率判断待测样品中有机污染物的遗传毒性。

所述步骤(1)中，在所述暴露处理前，稀有鮈鲫的外周血红细胞微核率为0.1‰。

所述步骤(1)中，所述暴露处理的方法为：将稀有鮈鲫置于所述含待测样品的 水溶液中，放置期间每2-3d换暴露处理液一次，每次替换一半。

所述步骤(1)中，所述暴露处理过程中避光。

所述步骤(1)中，所述暴露处理的时间为21-28d；具体为28d。

所述步骤(1)中，所述待测样品的水溶液的配制方法为：将待测物溶于有机溶 剂后再用水稀释即得。

所述步骤(2)中，所述检测暴露处理后的稀有鮈鲫的外周血红细胞的方法为： 从步骤(1)暴露处理后的、处死后的稀有鮈鲫取血、涂片、固定、晾干、Giemsa应 用液染色、洗净染液、晾干、镜检。

所述方法中，所述有机污染物为苯并[a]芘或4-硝基喹啉-1-氧化物。

本发明的另一个目的是提供稀有鮈鲫在检测水中有机污染物引起的遗传毒性中 的应用。

所述应用中，所述有机污染物为苯并[a]芘或4-硝基喹啉-1-氧化物。

本发明的还一个目的是提供一种辅助检测水中有机污染物含量的方法，包含以下 步骤：

(1)制作标准曲线：

A、制备一系列已知浓度的待测物溶于有机溶剂的溶液储备液，稀释于活性炭处 理后水得到各种不同浓度的待测物水溶液；

B、分别用各种浓度的待测物水溶液暴露处理稀有鮈鲫；

C、检测暴露处理后的稀有鮈鲫的外周血红细胞，统计细胞微核率；

D、以细胞微核率为纵坐标，以所述待测物水溶液中待测物的浓度为横坐标，制 作标准曲线；

(2)取待测水样，按照步骤B和C中相同的方法，对稀有鮈鲫进行暴露处理和 统计细胞微核率；将细胞微核率代入上述步骤D中的标准曲线，即得到待测水样中待 测物的含量。

所述步骤B中，在所述暴露处理前，稀有鮈鲫的外周血红细胞微核率为0.1‰。

所述步骤B中，所述暴露处理的方法为：将稀有鮈鲫置于所述含待测样品的水溶 液中，放置，期间每2-3d换暴露处理液一次，每次替换一半。

所述步骤B中，所述暴露处理过程中避光。

所述步骤B中，所述暴露处理的时间为21-28d；具体为28d。

所述步骤C中，所述检测暴露处理后的稀有鮈鲫的外周血红细胞的方法为：从步 骤B暴露处理后的、处死后的稀有鮈鲫取血、涂片、固定、晾干、Giemsa应用液染色、 洗净染液、晾干、镜检。

所述方法中，所述有机污染物为苯并[a]芘或4-硝基喹啉-1-氧化物。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1.稀有鮈鲫为中国特有小型试验鱼类，易于规范化研究，减少其他试验因素影响， 其外周血红细胞微核试验能很好地检测水中有机污染物遗传毒性危害状况。

2.开发针对有机物暴露方式及暴露时间的微核测定技术，并绘制剂量-效应曲线， 实现对遗传毒物毒性的定量化评价。

因此，本发明方法灵敏、简便、快捷、更直观、准确，结果重现性好，对于水质 遗传毒性研究具有重要意义。

附图说明

图1为苯并[a]芘剂量-效应曲线。

图2为4-硝基喹啉-1-氧化物剂量-效应曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1、二甲基亚砜遗传毒性的检测

(一)检测方法与步骤

(1)稀有鮈鲫的驯养：驯养同一批次、体长体重相近的稀有鮈鲫14d，期间无自 然死鱼现象，其外周血微核率达到0.1‰左右，即可用于试验；

(2)预试验选择合适浓度范围的二甲基亚砜进行处理，在拟采用最高暴露浓度下 无死鱼现象；

(3)暴露处理液的配制：将二甲基亚砜溶于活性炭处理自来水，配制成体积分数 比0.03％的水溶液，即为配制好的暴露处理液；

(4)暴露处理：设不加二甲基亚砜的空白对照；实验暴露组随机选5尾稀有鮈鲫， 避光暴露28d，每2-3d换暴露处理液一半；

(5)制作稀有鮈鲫血红细胞的血涂片：将暴露处理后的鱼处死后取血，甲醇固定 10min，晾干，经Giemsa应用液染色15min、立即用pH＝6.8的磷酸盐缓冲液洗净染液、 晾干即得；

(6)细胞微核率的检测：血涂片置于显微镜下观察，10*100倍观察、计数，选 取视野内完整、分散均匀且着色适当的细胞，双盲法阅片，每张涂片计数约5000个胞 浆清晰完整的鱼红细胞的微核率，结果以千分率(‰)表示。二甲基亚砜暴露体积分 数为0％、0.03％时对应的细胞微核率分别为0.29±0.04‰、0.37±0.06‰，无显著性 差异，表明二甲基亚砜在本测试条件下未显示遗传毒性效应。

实施例2、苯并[a]芘遗传毒性的检测

(一)检测方法与步骤

(1)稀有鮈鲫的驯养：驯养同一批次、体长体重相近的稀有鮈鲫14d，期间无自 然死鱼现象，其外周血微核率达到0.1‰左右，即可用于试验；

(2)预试验选择合适浓度范围进行处理；以拟采用最高暴露浓度暴露处理未观察 到死鱼现象，表明可用于后续微核暴露试验。

(3)暴露处理液的配制：将苯并[a]芘溶于二甲基亚砜中，配制成浓度分别为0 mg/L、4/3mg/L、20/3mg/L、100/3mg/L、500/3mg/L的母液，然后分别取相同体 积数的母液溶于活性炭过滤的自来水中，配制成苯并[a]芘浓度分别0μg/L、0.4μg/L、 2.0μg/L、10.0μg/L、50.0μg/L的溶液，即为配制好的5组暴露处理液；

(4)暴露处理：设不加苯并[a]芘的二甲基亚砜空白溶液为对照组；每组选10 尾稀有鮈鲫；采用半静态暴露方式，即每2-3d换暴露处理液一次，一次一半；避光暴 露28d；

(5)制作稀有鮈鲫血红细胞的血涂片：将暴露处理后的鱼处死后取血、涂片、甲 醇固定10min，晾干，经Giemsa应用液染色15min、立即用pH＝6.8的磷酸盐缓冲液洗 净染液、晾干即得；

(6)细胞微核率的检测：血涂片置于显微镜下观察，10*100倍观察、计数，选 取视野内完整、分散均匀且着色适当的细胞，双盲法阅片，每张涂片计数约5000个胞 浆清晰完整的鱼红细胞的微核率，结果以千分率(‰)表示。暴露浓度依次增高的细 胞微核率分别为0.37±0.06‰、1.53±0.11‰、4.19±0.08‰、10.29±0.93‰、 17.93±0.43‰。

结果显示，当苯并[a]芘浓度为0.4μg/L时，细胞微核率与空白对照具有显著性 差异。现有文献报道的检测方法如表1所示。

表1

表1结果表明，与现有检测方法相比较，本发明提供的检测方法灵敏度更高。

(二)剂量-效应曲线

以苯并[a]芘浓度为横坐标，微核千分率为纵坐标，绘制剂量-效应曲线，如图2 所示。由剂量-效应曲线量化剂量-效应关系为下述公式：

y＝2.14(1-e^-1.76x)+16.30(1-e^-0.069x)

苯并[a]芘28d暴露拟合曲线公式变化：R²＝0.9994；adjusted R²＝0.9974

多重比较显示各浓度组间存在差异极显著，说明苯并[a]芘对稀有鮈鲫外周血红细 胞具有遗传毒性作用，并有比较明显的剂量效应关系。

实施例3、4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)遗传毒性的检测

(一)检测方法与步骤

(1)稀有鮈鲫的驯养：驯养同一批次、体长体重相近的稀有鮈鲫14d，期间无自 然死鱼现象，其外周血微核率达到0.1‰左右，即可用于试验；

(2)预试验选择合适浓度范围进行处理；以拟采用最高暴露浓度暴露处理未观察 到死鱼现象，表明可用于后续微核暴露试验；

(3)暴露处理液的配制：将4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)溶于二甲基亚砜中， 配制成浓度分别为0mg/L、1/3mg/L、5/3mg/L、25/3mg/L、125/3mg/L的母液， 然后分别取相同体积数的母液溶于活性炭过滤的自来水中，配制成4-NQO浓度分别 0μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、2.5μg/L、12.5μg/L的溶液，即为配制好的5组暴 露处理液；

(4)暴露处理：设不加4-硝基喹啉-1-氧化物的二甲基亚砜空白溶液为对照组； 每组选10尾稀有鮈鲫；采用半静态暴露方式，即每2-3d换暴露处理液一次，一次一半； 避光暴露28d；

(5)制作稀有鮈鲫血红细胞的血涂片：将暴露处理后的鱼处死后取血、涂片、甲 醇固定10min，晾干，经Giemsa应用液染色15min、立即用pH＝6.8的磷酸盐缓冲液洗 净染液、晾干即得；

(6)细胞微核率的检测：血涂片置于显微镜下观察，10*100倍观察、计数，选取 视野内完整、分散均匀且着色适当的细胞，双盲法阅片，每张涂片计数约5000个胞浆 清晰完整的鱼红细胞的微核率，结果以千分率(‰)表示。暴露浓度依次增高的细胞 微核率分别为0.37±0.06‰、1.36±0.08‰、4.35±0.40‰、8.89±0.26‰、 22.69±0.56‰。

结果显示，当4-硝基喹啉-1-氧化物浓度为0.1μg/L时，与空白对照具有显著性差 异。文献Valentin-Severin，I.et al.Mutation Research-Genetic Toxicology and  Environmental Mutagenesis[J].536(1-2)：79-90.中通过人肝癌细胞HepG2检测4- 硝基喹啉-1-氧化物的遗传毒性，实验结果表明，细胞微核率达到阴性对照微核率的二 倍时，4-硝基喹啉-1-氧化物的浓度为22.8μg/L。这表明与现有检测方法相比较，本 发明提供的检测方法灵敏度更高。

(二)剂量-效应曲线

以4-硝基喹啉-1-氧化物浓度为横坐标，微核千分率为纵坐标，绘制剂量-效应曲 线，如图2所示。由剂量-效应曲线量化剂量-效应关系为下述公式：

y＝4.19(1-e^-3.24x)+39.26(1-e^-0.05x)

4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)28d暴露拟合曲线公式变化：R²＝0.9996；adjusted R²＝0.9983

多重比较显示各浓度组间存在差异极显著，说明4-硝基喹啉-1-氧化物对稀有鮈 鲫外周血红细胞具有遗传毒性作用，并有比较明显的剂量效应关系。