使用糖类和糖苷酶制备丙烯酸酯衍生物的糖苷的方法

摘要

式I的烯键式不饱和苷，

说明书

本发明涉及一种通过将烯键式不饱和醇与糖类在糖苷酶的存在下反 应制备烯键式不饱和苷的方法。

包括糖残基的聚合物（糖类共聚物）可以具有糖类的典型特性，例如 良好的水溶性、高电解稳定性、在热水中的胶体稳定性、与表面（例如棉 花）的强相互作用，以及无毒性。这些具体特征为所述聚合物带来多种应 用。因此人们非常有兴趣来开发经济有效的方法以制备明确定义的糖类共 聚物以及它们的相应单体。所述单体可以为可聚合的烯键式不饱和糖苷， 其是由糖苷偶联糖类和烯键式不饱和醇而制得的。所述糖苷的合成具有很 多挑战。有很多种可能形成位置异构物，其中糖类的不同羟基基团参与键 的形成。此外，可能形成不同的端基异构形式。因此大多数带有糖残基的 单体的化学合成通常是不可行的，并导致所需单体的低产量。

酶的应用已经被认为是制备糖苷单体的一个可选方法。与化学合成相 比，由于高的立体选择性，无保护的糖的酶催化反应通常产生更加结构相 同的产物。

通常，有两种途径用于酶催化合成糖苷：热力学控制的逆向水解， 和动力学控制的转糖苷作用。糖基单元通过酶催化的转糖苷作用向带 有伯羟基的非糖化合物的转移已被示出，例如，参见S.Matsumura et  al.(Makromol.Chem.,Rapid Commun.14:55-58,1993)。也有使用糖 苷酶——其催化糖苷在体内水解——通过逆向水解用于糖苷合成的方 法。（例如参见I.Gill and R.Valivety,Angew.Chem.Int.Ed. 39(21):3804-3808,2000)。

在糖苷酶催化合成糖苷的方法的发展中，在寻找最佳溶剂条件时 遇到了困难。一方面，利于热力学控制逆向水解需要使水含量——更 确切地说，使水热力学活性a_w——被最小化。另一方面，糖类通常易 溶于水，在有机介质中经常几乎不可溶。已经提出将水替换为中等极 性的无水溶剂作为满足两种需求的方法。然而，已经显示出常用的糖 苷酶显然需要至少一些水来保持活性(F.van Rantwijk et al.,J.Mol. Catalysis B:Enzymatic6:511-532,1999)。这些有分歧的溶剂需求是难 以满足的。这反映在升高的温度和长反应时间，这是已知的酶催化糖 苷合成的方法的一般需求。

因此本发明的一个目的是开发一种更有效的方法用于酶制备烯键 式不饱和糖苷。这可以通过提高反应速率和/或向糖苷合成方向移动反 应平衡而实现。因此，在一定的反应时间后和/或达到反应平衡时获得 更高量的产物。

发明人现已出乎意料地发现添加一种非反应性的可与水混溶的有机 溶剂到含有糖类、烯键式不饱和醇、糖苷酶和水的反应混合物中可以显著 地增加在一段反应时间后获得的烯键式不饱和糖苷的量。

因此，本发明提供一种制备式I的烯键式不饱和糖苷的方法

其中

n为1、2或3;

A为C_2-20亚烷基或者-R⁶-O-[-R⁶-O-]_x-C_2-20亚烷基；

X选自-O-、-NH-和-NR⁵-；

R³选自-H和C_1-10烷基；

R⁴选自-H、-COOH和-COO^-M⁺；

R⁵为C_1-10烷基;

R⁶为H或-CH₃；

M⁺选自Li⁺、Na⁺、K⁺和NH₄⁺；和

x是一个0至200的整数；

包括将式II的烯键式不饱和醇

在一种糖苷酶的存在下与式III的糖反应，

（i）式II的烯键式不饱和醇与式III的糖的初始摩尔比为2:1至30:1， 例如15:1至25:1；

（ii）在水和一种可以与水混溶的有机溶剂（不是伯醇或仲醇）的溶 剂混合物的存在下，其中水与有机溶剂的重量比为0.1:1至9:1，例如1:1 至3:1；并且

（iii）溶剂混合物与糖的初始重量比为3:1至30:1，例如10:1至20:1。

定义

本文所用的术语“单糖”指的是一个单独单元的多羟基醛，其形成分 子内半缩醛的结构，该结构包括一个由五个碳原子和一个氧原子构成的六 元环。单糖可以以不同的非对映异构体形式存在，例如α或β端基异构体， 和D或L异构体。“低聚糖”由共价连结的单糖单元的短链组成。低聚糖 包括二糖（其包括两个单糖单元）也包括三糖（其包括三个单糖单元）。 “多糖”由共价连结的单糖单元的长链组成。

术语“糖苷键”或“糖苷连接”是一类化学键或连接，其在糖类或是 糖类衍生物（糖基（glycone））的端基异构的羟基和另一个糖类或非糖类 有机化合物（苷元）例如醇上的羟基之间形成。所述二糖或多糖的还原端 的位置接近结构上最后的端基异构碳，并且终端在相反方向。

本文所用的“酶催化”或“生物催化”方法意指所述方法在酶特别是 糖苷酶的催化作用下进行。所述方法可以在以分离（纯化、富集）或粗品 形式的所述糖苷酶的存在下进行。

术语“糖苷酶”还包括糖苷酶的变体、突变体和酶活性部分。

酶的催化量以“U”("单位（unit）")表示，其中1U等于在特定条 件下（通常为37°C，pH7.5）每分钟催化1μmol底物反应的酶的量。因 此，10U糖苷酶等于每分钟催化10μmol糖类底物反应需要的酶的量。 麦芽糖淀粉酶的催化量以"MANU"(麦芽糖淀粉酶Novo单位)表示，其中 1MANU等于在标准条件下（10mg/ml麦芽三糖，37°C，pH5.0，反应 时间为30分钟）每分钟催化1μmol麦芽三糖反应所需要的酶的量。酶的 催化量可以通过本领域已知的方法测定。

术语“烷基”包括直链或支化的具有1-10个碳原子的C_1-10烷基。其 实例为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、2-丁基、异丁基或叔丁基、 戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙 基、己基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、 3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基 丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、 2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、 1-乙基-2-甲基丙基、庚基、辛基、壬基和癸基，以及它们的结构异构物， 如2-乙基己基。

术语“亚烷基”包括C_2-20亚烷基二价基团，其为具有1至20个碳 原子的直链或支化二价基团。

术语“烯键式不饱和”指的是包括非芳香族C=C双键的化合物。具 体地，本文所用的“烯键式不饱和糖苷”指的是一种糖苷，其由一种糖苷 式连接至烯键式不饱和醇的糖类组成。

“可与水混溶的有机溶剂”被理解为意指一种有机溶剂，其在所用的 水和有机溶剂的重量比之下与水形成均匀的混合物。

所述有机溶剂不为伯醇或仲醇，并且相应地不与糖类反应。通常，所 述有机溶剂选自烷酮、烷基腈、叔醇和环醚，以及它们的混合物。

优选的溶剂选自丙酮、乙腈、叔戊醇、叔丁醇、1,4-二氧杂环己烷和 四氢呋喃，以及它们的混合物。特别优选1,4-二氧杂环己烷。

所述式II的烯键式不饱和醇选自

(甲基)丙烯酸羟基烷基酯；

N-羟基烷基(甲基)丙烯酰胺；或

马来酸的单(羟基烷基)酯或其盐。

在另一个实施方案中，所述式II的烯键式不饱和醇为上述烯键式不 饱和醇的乙氧基化物、丙氧基化物，或是乙氧基化衍生物、丙氧基化衍生 物。

优选的式II的烯键式不饱和醇选自丙烯酸2-羟基乙酯、甲基丙烯酸 2-羟基乙酯、丙烯酸3-羟基丙酯、甲基丙烯酸3-羟基丙酯、N-(2-羟基乙 基)丙烯酰胺、N-(2-羟基乙基)甲基丙烯酰胺、N-(3-羟基丙基)丙烯酰胺、 N-(3-羟基丙基)甲基丙烯酰胺、(2-羟基乙基)氢马来酸酯。

在某个实施方案中n为1；A为C_2-6亚烷基；X为-O-；并且R³为-H 或-CH₃。

所述糖可以为单糖例如葡萄糖、半乳糖或甘露糖；二糖如麦芽糖、乳 糖或纤维二糖；三糖例如麦芽三糖；或它们的混合物。本发明的方法不需 要糖被活化，例如通过经由醚键连接到糖1位的碳原子(C-1)的烷基或邻 硝基苯基的存在而活化。合适地，所述糖选自D-葡萄糖、D-半乳糖、D- 甘露糖，以及它们的混合物。

在本发明的方法中，糖和烯键式不饱和醇的反应通过糖苷酶催化，糖 苷酶是一类也被称作糖苷水解酶的酶。通常，酶对参与这些反应的底物的 反应显示出高特异性。糖苷酶是可以催化O-和S-糖苷化合物水解的酶。 此外，糖苷酶可以通过逆向水解用于催化糖苷键的形成，其中反应的平衡 位置被逆转，或者通过转糖苷作用，其中苷部分从一个糖苷（即给体糖苷） 转移到另一个糖苷（即受体糖苷），从而形成新的糖苷。糖苷酶被分配的 酶分类号为EC3.2.1.x.。

所述糖苷酶可以以纯化形式、作为富集浓缩剂或作为粗品酶制剂使 用。

本发明方法中存在的糖苷酶适合选自淀粉酶、纤维素酶、葡萄糖苷酶 和半乳糖苷酶。

α-淀粉酶是一种酶分类号为EC3.2.1.1的酶，并且已知为糖原酶、内 淀粉酶、Taka-淀粉酶A、或1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶。α-淀粉酶可 以催化含有三个或更多(1→4)-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖（例如淀粉 和糖原）中的(1→4)-α-D-糖苷连接的内水解，从而释放α-结构中的还原基 团。

β-淀粉酶是一种酶分类号为EC3.2.1.2的酶，并且也已知为糖原淀粉 酶、糖原酶、或者1,4-α-D-葡聚糖麦芽水解酶。β-淀粉酶可以催化多糖（例 如淀粉和糖原）中的(1→4)-α-D-糖苷连接的水解，从而从多糖链的非还原 端释放连续的β-麦芽糖单元。

纤维素酶是一种酶分类号为EC3.2.1.4的酶，并且也已知为内 -1,4-β-D-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,4-内葡聚糖水解酶、纤维素酶A、 cellulosin AP、内葡聚糖酶D、碱性纤维素酶、纤维素酶A3、纤维糊精 酶（celludextrinase）、9.5纤维素酶、微晶纤维素酶、pancellase SS、或 1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。纤维素酶可以催化纤维素、地 衣多糖和谷类β-D-葡聚糖中(1→4)-β-D-糖苷连接的内水解，以及催化同样 含有1,3-连接的β-D-葡聚糖中的1,4-连接的内水解。

α-葡萄糖苷酶是一种酶分类号为EC3.2.1.20的酶，并且已知为麦芽 糖酶、葡萄糖转化酶、葡萄糖苷蔗糖酶、麦芽糖酶-葡糖淀粉酶、α-吡喃 葡萄糖苷酶（α-glucopyranosidase）、葡萄糖苷转化酶 （glucosidoinvertase）、α-D-葡萄糖苷酶、α-糖苷水解酶、或者α-1,4-葡萄 糖苷酶。α-葡萄糖苷酶能够催化终端非还原性的(1→4)-连接的α-D-葡萄 糖残基的水解，从而释放α-D-葡萄糖。

β-葡萄糖苷酶是一种酶分类号为EC3.2.1.21的酶，并且也已知为龙 胆二糖酶、纤维二糖酶、苦杏仁酶、弹丝酶（elaterase）、芳基-β-葡萄糖 苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷葡萄糖水解酶、熊果苷酶（arbutinase）、 杏苷酶（amygdalinase）、对硝基苯基β-葡萄糖苷酶、樱草苷酶、苦杏仁 苷酶、limarase、salicilinase、或β-1,6-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶可以催 化终端非还原性的β-D-葡糖基残基的水解，从而释放β-D-葡萄糖。

α-半乳糖苷酶是一种酶分类号为EC3.2.1.22的酶，并且也已知为蜜 二糖酶、α-D-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、或α-半乳糖苷半乳糖水解 酶。α-半乳糖苷酶可以催化水解在α-D-半乳糖苷（包括半乳糖寡聚糖和半 乳甘露聚糖）中的终端非还原性的α-D-半乳糖残基。

β-半乳糖苷酶是一种酶分类号为EC3.2.1.23的酶，并且也已知为乳 糖酶、β-乳糖苷酶、maxilact、hydrolact、β-D-乳糖苷酶、S2107、乳糖 水解酶、三乳糖酶、β-D-半乳聚糖酶、oryzatym或sumiklat。β-半乳糖 苷酶可以催化水解β-D-半乳糖苷中的终端非还原性的β-D-半乳糖残基。

适用于本发明方法的糖苷酶的一种粗品形式是果籽粉（fruit seed  meal）。果籽粉是耐用的可循环的催化剂，其可以通过一种简单并省钱的 方式制备。果籽粉的制备和特异性酶活性记载于Lu et al.(Practical  methods for Biocatalysts，Whittall and Satton(eds.)，Wiley，2010，7.3 章，第236-239页)中。可以在本发明方法中使用的果籽粉包括巴旦杏 （Prunus dulcis）(扁桃)仁粉、桃（Prunus persica）仁粉、杏（Prunus  armeniaca）仁粉、苹果（Malus pumila）籽粉、以及枇杷（Eriobotrya  japonica）籽粉。优选地，所使用的果籽粉选自巴旦杏仁粉、桃仁粉，和 苹果籽粉。

所述酶可以溶解在反应混合物中或者固定在与反应混合物接触的固 体载体上。如果酶被固定，则其被附着到惰性载体上。合适的载体材料是 本领域已知的。合适的载体材料的实例为粘土，粘土矿物例如高岭土、硅 藻土、珍珠岩、二氧化硅、氧化铝、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉末、阴离 子交换材料、合成聚合物，例如聚苯乙烯、丙烯酸类树脂、酚醛树脂、聚 氨酯和聚烯烃，例如聚乙烯和聚丙烯。为制备与载体附着的酶，所述载体 材料通常以细粉末形式使用，其中优选多孔形式。载体材料的粒径通常不 超过5mm，特别是2mm。此外，合适的载体材料为藻酸钙和角叉菜聚 糖。酶可以直接通过戊二醛而连接。广泛的固定方法是本领域已知的（例 如J.Lalonde and A.Margolin"Immobilization of Enzymes"in K.Drauz  und H.Waldmann,Enzyme Catalysis in Organic Synthesis2002,Vol.III, 991-1032,Wiley-VCH,Weinheim）。

所述酶催化反应可以间歇进行、半间歇进行或者连续进行。反应物可 以在反应开始时提供，或者以半连续或连续的方式随后提供。本发明方法 所需的糖苷酶的催化量取决于反应条件，例如温度、溶剂和底物的量。

反应在如上所述的水和一种可与水混溶的有机溶剂的溶剂混合物中 进行。所述反应混合物可以但不必须另外含有一种合适的缓冲液以调节 pH值至6.0-9.0，例如在6.5至8.0的范围内，例如在7.0至7.8的范围内。 合适的缓冲液包括但不限于乙酸钠、三(羟甲基)氨基甲烷("TRIS")和磷酸 盐缓冲液。

反应物的浓度，即，糖和烯键式不饱和醇的浓度，可以被调整适于最 佳反应条件。例如，初始的糖浓度可以在100mM至3000mM的范围内， 例如200mM至500mM。以过量摩尔数使用一种反应物即烯键式不饱和 醇，以便将反应平衡移向产物一侧。

反应温度可以被调整为适于最佳反应条件，其可取决于所使用的具体 的酶。反应可以便利地在反应混合物的凝固点与酶的变性温度之间的温度 发生。在达到变性温度时酶的催化活性丧失。例如，该反应可以在0°C 至80°C范围内的温度进行，例如40°C至60°C，或约50°C。

反应可以进行直至反应物和产物之间达到平衡，但也可以较早停止。 通常的反应时间在6h至96h的范围内，例如约24h。

本发明的方法还可以包括一个步骤来回收所得的烯键式不饱和糖苷。 术语“回收”包括从反应混合物中萃取、收集、分离或提纯化合物。所述 化合物的回收可以根据本领域已知的任意常规的分离或提纯方法进行，包 括但不限于，用常规的树脂（例如阴离子或阳离子交换树脂、非离子吸附 树脂等）处理、用常规吸附剂（例如活性碳、硅酸、硅胶、纤维素、氧化 铝等）处理、改变pH、溶剂萃取（例如使用常规溶剂例如醇、乙酸乙酯、 己烷等）、蒸馏、渗析、过滤、浓缩、结晶、重结晶、pH调整、冻干等。

分离出的产物的特性和纯度可以用已知技术测定，所述技术例如薄层 色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、光谱法(例如 IR、UV、NMR光谱法)、着色法、NIRS、或者酶检验。

下述实施例用于阐述本发明，而不以任何方式限制本发明。

实施例1：使用β-葡萄糖苷酶从D-葡萄糖催化合成丙烯酸2-(β-葡糖 基氧基)-乙酯

将1.0g D(+)-葡萄糖溶解在2ml水中。在所述葡萄糖溶液中加入12 ml丙烯酸2-羟基乙酯（含有200ppm MEHQ）和1ml的1,4-二氧杂环 己烷。通过加入0.070g(364U)来自扁桃的β-葡萄糖苷酶来开始反应。将 反应混合物在50°C搅拌24h。通过薄层色谱法(TLC)(氯仿/甲醇4/1(v/v)， Rf0.55)检测产物，并用柱色谱法（硅胶，洗脱液：氯仿/甲醇7/1(v/v)） 提纯。汇集含有目标产物的级分，并且通过旋转蒸发仪来除去溶剂。产率： 0.459g(46%)。纯度：99%。

¹H-NMRδ，以ppm计:3.2-4.2GIucOCH₂CH₂R(8p);4.39 GlucOCH₂CH₂R(2p Tri J4.384.38Hz);4.50GlucH_α(1p Dou J7.91Hz); 5.99H_transCH=CHR(1p Dou J10.46Hz);6.22CH₂=CHR(1p DDou J 17.2910.46Hz);6.46H_cisCH=CHR(1p Dou J17.30Hz)

¹³C-NMRδ，以ppm计:60.9GlucC₆;64.4OCH₂CH₂;68.1OCH₂CH₂; 69.8GlucC₅;73.3GIucC₂;75.9GlucC₃;76.1GlucC₄;102.7GlucC_1β;127.6 H₂C＝CHR;132.9H₂C=CHR;168.6O(O)CR

ESI-MS pos:计算值:301.0894(C11H18O8Na);观测值:301.2500

实施例2：使用β-葡萄糖苷酶从D-葡萄糖催化合成甲基丙烯酸2-(β- 葡糖基氧基)-乙酯

将1.0g D(+)-葡萄糖溶解在2ml水中。在所述葡萄糖溶液中加入12 ml甲基丙烯酸2-羟基乙酯（含有200ppm MEHQ）和1ml的1,4-二氧 杂环己烷。通过加入0.070g(364U)来自扁桃的β-葡萄糖苷酶来开始反应。 将反应混合物在50°C搅拌24h。通过TLC(氯仿/甲醇4/1(v/v)，Rf0.59) 检测产物，并用柱色谱法（硅胶，洗脱液：氯仿/甲醇7/1(v/v)）提纯。汇 集含有目标产物的级分，并且通过旋转蒸发仪来除去溶剂。

产率：0.514g(51%)。纯度：97%。

¹H-NMRδ，以ppm计:1.91CH₂=C(CH₃)R(3p Sin);3.2-4.2 GlucOCH₂CH₂R(8p);4.35GlucOCH₂CH₂R(2pTri J4.374.37Hz);4.48 GlucH_α(1p Dou J7.92Hz);5.70H_transCH=CCH₃R(1p Sin);6.14 H_cisCH=CHCH₃R(1p Sin)

¹³C-NMRδ，以ppm计:17.5H₂C=C(CH₃)R;60.8GlucC₆;64.5OCH₂CH₂; 68.1OCH₂CH₂;69.7GIucC₅;73.2GlucC₂;75.8GlucC₃;76.1GlucC₄;102.7 GlucC_1β;127.1H₂C＝C(CH₃)R;135.9H₂C=C(CH₃)R;169.8O(O)CR

实施例3：使用β-葡萄糖苷酶从D-葡萄糖催化合成丙烯酸4-(β-葡糖 基氧基)-丁酯

将1.0g D(+)-葡萄糖溶解在2ml水中。在所述葡萄糖溶液中加入12 ml丙烯酸4-羟基丁酯（含有200ppm MEHQ）和1ml的1,4-二氧杂环己 烷。通过加入0.070g(364U)来自扁桃的β-葡萄糖苷酶来开始反应。将反 应混合物在50°C搅拌24h。通过TLC(氯仿/甲醇4/1(v/v)，Rf0.69)检测 产物，并用柱色谱法（硅胶，洗脱液：氯仿/甲醇7/1(v/v)）提纯。汇集含 有目标产物的级分，并且通过旋转蒸发仪来除去溶剂。产率：0.310g (31%)。纯度：(>85%)。

¹H-NMRδ，以ppm计:1.75OCH₂CH₂CH₂CH₂O(4p);3.2-4.2 GlucOCH₂CH₂R(8p);4.21(O)COCH₂R(2pTri J5.905.90Hz);4.43 GlucH_α(1p Dou J7.96Hz);5.95H_transCH=CHR(1p Dou J10.43Hz);6.22 CH₂=CHR(1p DDou J17.3610.35Hz);6.41H_cisCH=CHR(1p Dou J17.32 Hz)

¹³C-NMRδ，以ppm计:24.7OCH₂CH₂CH₂CH₂O;25.6 OCH₂CH₂CH₂CH₂O;61.0GlucC₆;61.7OCH₂R;65.4(O)COCH₂R;69.9 GlucC₅;73.3GIucC₂;76.0GlucC₃;76.1GlucC₄;102.4GlucC_1β;127.9 H₂C＝CHR;132.4H₂C=CHR;168.9RO(O)CR

ESI-MS pos：计算值：329.1207(C13H22O8Na)；观测值：329.1188