一种扁座壳孢菌几丁质酶的分离纯化方法

摘要

本发明公开了一种扁座壳孢菌几丁质酶的分离纯化方法。将扁座壳孢菌在优化后的产酶培养基中发酵，经60%硫酸铵沉淀、DEAESepharosefastflow阴离子交换层析、SephadexG-75凝胶过滤等步骤，从发酵液获得了SDS-PAGE电泳均一的扁座壳孢外切几丁质酶，本发明特异性高，工艺简单，蛋白质不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推广应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及几丁质酶的分离纯化工艺，具体涉及一种扁座壳孢菌几丁质酶的分离纯化方法。

背景技术

座壳孢(Aschersonia Montagne)是子囊菌门、粪菌纲、肉座菌目、麦角菌科的一个属，主要寄生在粉虱和介壳虫上，在拉丁美洲、南亚和东南亚等地方都有分布。粉虱属于同翅目的多食性昆虫，是世界性的重要虫害之一，广泛分布于世界各大洲的90多个国家和地区，为害的寄主植物目前估计达74科600种。除直接为害外, 还可在30种作物上传播70种以上的病毒病。近年来，粉虱已成为蔬菜作物和园林植物上的一种主要害虫，且有逐年加重为害与蔓延的趋势，极大影响了我国蔬菜和园林花卉植物等的生产和贸易。其成员扁座壳孢能在自然生境和农业生态系统中造成粉虱群流行病，从而达到控制粉虱类害虫的发生与危害的目的。据报道，座壳孢对粉虱具有较强的杀虫作用与该菌产生的几丁质酶相关，对几丁质酶进行分离纯化及其酶学性质研究，能为最终揭示虫生真菌致病机理并指导其生产应用奠定基础，可为将来真菌防治害虫的深入研究提供科学依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种扁座壳孢菌几丁质酶的分离纯化方法，特异性高，工艺简单，蛋白质不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推广应用价值。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

用优化试验筛选出的培养基培养扁座壳孢菌株（邱君志等，Optimization of the medium composition of a biphasic production system for mycelial growth and spore production of Aschersonia placenta using response surface methodology. Journal of Invertebrate Pathology, 2013, 112(2): 108-115），在几丁质酶活性达最高时取发酵液；

在上述发酵液基础上，由下述纯化方法获得：

(1) 粗酶液的制备：将发酵液在8500 rpm条件下离心10 min，上清液用真空抽滤，收集滤液。向滤液中加入固体硫酸铵至饱和度为60%，4℃静置过夜。12000 rpm、4℃离心15 min收集沉淀，用适量的缓冲液溶解沉淀。12000 rpm、4℃离心15 min除去不溶物体，上清液装于透析袋，经0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH6.5)透析后，再用聚乙二醇浓缩得到粗酶液。

(2) DEAE Sepharose fast flow阴离子交换层析：粗酶液经过PEG20000浓缩后，用起始缓冲液平衡过夜，上样于充分平衡后的DEAE Sepharose fast flow阴离子交换层析柱，再用含0~1 mol/L NaCl 的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行连续洗脱，洗脱条件设置为：流速30 mL/h；5 mL/管，收集具有酶活性部份。

(3) Sephadex G-75凝胶过滤层析：用0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)充分平衡的Sephadex G-75凝胶过滤层析柱（1.8×100 cm），等上样后，再用相同的缓冲液进行洗脱。洗脱条件设置为：流速15 mL/h；5 mL/管，收集有酶活性的部份。

(4) 纯化几丁质酶的分子量检测：采用不连续垂直板电泳系统测定几丁质酶的纯化程度及分子量，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%，凝胶大小为100 mm×70 mm×0.75 mm。所用的标准蛋白为：磷酸化酶B94000；牛血清蛋白67000；肌动蛋白43000；碳酸酐酶30000；大豆蛋白酶抑制剂20100；乳清蛋白14400。电泳后用考马斯亮蓝法显示蛋白条带。

本发明的显著优点在于：特异性高，工艺简单，蛋白质不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推广应用价值。

附图说明

图1是几丁质酶粗酶液的DEAE Sepharose fast flow阴离子交换层析柱图；虚线表示几丁质酶活性，实线表示蛋白质含量。

图2是几丁质酶的Sephadex G-75凝胶过滤层析柱图；虚线表示几丁质酶活性，实线表示蛋白质含量。

图3是几丁质酶SDS-PAGE图谱：泳道1为粗酶液；泳道2为经Sephadex G-75凝胶过滤层析后的纯酶；泳道M为标准蛋白。

具体实施方式

实施例1

(1) 用优化试验筛选出的培养基培养菌株，在几丁质酶活性达最高时取发酵液，8500 rpm离心10 min，上清液用真空抽滤，收集滤液。向滤液中加入固体硫酸铵至饱和度为60%，4℃静置过夜。12000 rpm、4℃离心15 min收集沉淀，用适量的缓冲液溶解沉淀。12000 rpm、4℃离心15 min除去不溶物体，上清液装于透析袋，经0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)透析后，再用聚乙二醇浓缩得到粗酶液。

(2) 将上述粗酶液经过0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)充分透析，并用PEG20000适当浓缩后，上样到充分平衡好的DEAE Sepharose fast flow阴离子交换层析柱。以平衡胶柱用的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行洗脱，再以含0~1 mol/L NaCl的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行盐离子梯度连续洗脱，共洗脱出2个蛋白质峰(图1)。测定收集液的几丁质酶活性发现，上述收集液中后一个峰的酶活最高，酶活达到4.36 U/mL，主要集中在400～500 min时间收集的管中。

(3) 用PEG20000适当浓缩400～500 min获得的收集液，上样到充分平衡好的Sephadex G-75凝胶过滤柱。以平衡胶柱用的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行洗脱，共洗脱出三个蛋白峰，对每个峰分别测酶活得出第一个峰的酶活最高为5.64 U/mL，其他峰的酶活很小接近于零，所以这个峰的取出液就是我们要的几丁质酶(图2)。

(4) 上述活性峰用SDS-PAGE电泳，表现为单带(图3)，表明纯化后的几丁质酶为单一组分，已达到电泳纯。如图3所示，纯酶和标准蛋白经 SDS-PAGE测定，该酶分子量约为30 kDa。

表1 座壳孢外切几丁质酶的纯化表

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。