一种大规模培养树突状细胞疫苗的制备方法及其应用

摘要

本发明提供了一种大规模培养树突状细胞疫苗的制备方法，其中包括如下工序：采用血细胞分离机通过采集人外周血中白细胞，经体外分离纯化获得大量的单个核细胞，数量级可达109以上，在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素4诱导培养获得大量未成熟树突状细胞，数量级可达108以上；未成熟树突状细胞负载肿瘤特异抗原后，并在肿瘤坏死因子α与脂多糖诱导培养条件下获得具有抗肿瘤作用的成熟树突状细胞疫苗。本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的树突状细胞疫苗多次多疗程的临床应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种大规模培养树突状细胞疫苗的制备方法。本发明涉及的采用血细胞分离机通过采集人外周血中白细胞，经体外分离纯化获得大量的单个核细胞。获得的单个核细胞能简便地获得大量的树突状细胞，其高表达共刺激分子，具有激活机体效应性T淋巴细胞的功能，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的多个疗程的免疫治疗。 

背景技术

细胞免疫治疗癌症在临床已得到广泛的应用，其无放化疗带来的巨大毒副作用，达到了相对安全，提高了患者生活品质，有尊严的治疗方式。树突状细胞是机体内最大的抗原呈递细胞，机体效应性T淋巴细胞，而杀死肿瘤细胞。树突状细胞疫苗多疗程治疗对患者疗效和生存期有着明显的帮助，并得到临床上认可。 

目前，获得树突状细胞的来源主要为从患者外周血中分离出单个核细胞，而采集患者外周血是有限的，一般为50毫升到300毫升，从而得到的树突状细胞仅为0.5-3×10⁷个，仅满足一个疗程2-6次治疗，很大程度上影响了给患者的治疗，而且多疗程治疗时需要再次采血，给予患者很大的精神压力。 

本发明通过血细胞分离机循环采集人外周血中白细胞，经体外纯化获得大量的单个核细胞，简便地获得大量的未成熟树突状细胞，将未成熟树突状细胞冷冻保存起来。每次治疗时复苏一部分未成熟树突状细胞进行负载肿瘤抗原和诱导成熟，获得特异的树突状细胞疫苗。这样不仅可以满足多疗程树突状细胞疫苗免疫治疗，持续发挥树突状细胞的免疫功能，有助于提高临床疗效和延长患者生存期，而且血细胞分离机采集属于白细胞成分采集，来自患者的血细胞、血小板和血浆仍返回患者体内，不会对患者造成重大健康影响。 

发明内容

现有技术主要通过从患者中采集有限量的外周血，一般为50毫升到300毫升，通过体外诱导获得树突状细胞的数量也是有限的，仅为0.5-3×10⁷个细胞。若一次树突状细胞疫苗治疗至少使用0.5×10⁷个细胞，最多能满足6次的治疗，1个疗程一般为4-5次，因而最多可以进行1.5个疗程治疗。 

树突状细胞能激活机体效应T细胞，对外源性快速增殖的肿瘤细胞进行杀伤。就犹如疫苗一样，树突状细胞需要持续地进行加强，维持对机体“非我”的肿瘤细胞进行杀伤，有效地抑制肿瘤细胞的复发和转移。因而树突状细胞疫苗在临床应用中需要进行多次多疗程治疗，更好地提高患者临床疗效和延长生存期。通过现有技术获得的树突状细胞数量，没法完成患者的多次多疗程的治疗和保证患者的长期疗效。血细胞分离机采集属于白细胞成分采集，来自患者的血细胞、血小板和血浆仍返回到患者体内，不会对患者造成重大健康影响。本发明技术通过血细胞分离机循环采集人外周血中白细胞，经体外纯化获得大量的单个核细胞，数量级可大于0.8×10⁹，简便地获得大量的未成熟树突状细胞，数量级可大于8×10⁷，将未成熟树突状细胞冷冻保存起来。每次治疗时吸取或复苏6×10⁶未成熟树突状细胞进行负载肿瘤抗原和诱导成熟，获得特异的树突状细胞疫苗，可用于多达13次以上、3个疗程以上的临床应用。 

本发明涉及一种大规模培养树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下工序：采用血细胞分离机通过采集人外周血中白细胞，经体外分离纯化获得大量的单个核细胞，在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素4诱导培养获得大量未成熟树突状细胞；未成熟树突状细胞负载肿瘤特异抗原后，并在肿瘤坏死因子α与脂多糖诱导培养条件下获得具有抗肿瘤作用的成熟树突状细胞疫苗。 

采用血细胞分离机进行循环0.5L-4L人外周血，采集白细胞，数量级可达到1×10⁹-3.5×10¹⁰；采集的白细胞进行体外分离纯化，去除红细胞、血小板和粒细胞等，获得单个核细胞，数量级可达到0.8×10⁹-2.8×10¹⁰。 

优选地，本发明所述方法为：根据血常规检测结果要求大于2.0×10⁹个白细胞/升，采用血细胞分离机进行循环1L人外周血，采集白细胞，数量级可达到2×10⁹；采集的白细胞进行体外分离纯化，去除红细胞、血小板和粒细胞 等，获得单个核细胞，数量级可达到1.6×10⁹。 

血细胞分离机采集经纯化后1.6×10⁹的单个核细胞用RPMI 1640培养基重悬，苔盼兰染色计数，使用RPMI 1640培养基调整到细胞浓度为3-5×10⁶/mL，并加入大容量培养皿或培养瓶中贴壁；在37℃、5％CO₂培养箱中孵育90min后(每半小时左右摇动几下)，未贴壁细胞洗涤收集下来；贴壁细胞加入培养基诱导培养，该培养基含有200ng/mL GM-CSF、50ng/mL IL-4和5％的自体血清；于37℃、5％CO₂培养箱中培养；在培养到第三天时1000rpm(转每分钟)离心10分钟收集细胞，半量更换新鲜RPMI1640培养基，该新鲜培养基含200ng/mL GM-CSF、50ng/mL IL-4和体积比5％自体血清；培养到第五天收获未成熟树突状细胞；获得未成熟树突状细胞苔盼兰计数，数量级可大于12.8×10⁷，树突状细胞可冻存起来，6×10⁶个未成熟树突状细胞冻存1毫升，冻存管放置程序降温盒中，放入-80℃超低温冰箱过夜，第二天转至液氮冻存。 

每次吸取或复苏6×10⁶个未成熟树突状细胞用RPMI 1640培养基(含体积比5％自体血清)稀释到细胞浓度2.5×10⁶/mL，并添加0.1mL的1×10⁶肿瘤全细胞抗原，或50ng/mL肿瘤特异表达抗原多肽，负载于树突状细胞，于37℃、5％CO₂培养箱中孵育2小时；孵育后添加10ng/mL肿瘤坏死因子α和10ug/mL脂多糖，培养到第7天收获树突状细胞疫苗。 

将所述的树突状细胞疫苗进行细胞活率和细胞表型检测，细胞活率达到98％以上；其高表达共刺激分子CD80、CD83和CD86。其中，CD80+/HLA-DR+细胞为大于90％，CD86+/CD11c细胞为大于80％，CD83+/CD11c+细胞为大于65％(高表达)。 

其中，优选的细胞活率检测方法为：计算培养最后一天的活细胞数。取1mL最后一天培养的培养液，1000rpm、4℃下离心10分钟，细胞用培养基重悬，取20ul细胞液用1×PBS稀释20倍，稀释液加入1倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞，细胞活率达到98％以上。 

优选的细胞表型检测方法为：取苔盼兰染色计数后的4×10⁶细胞，分四组，第一组分别添加到有20μL FITC标记鼠抗人CD11c单抗、20μL PE标记鼠抗人CD83单抗和20μL PerCP标记鼠抗人HLA-DR单抗；第二组分别添加20μL FITC标记鼠抗人CD11c单抗、20μL PE标记鼠抗人CD86单抗和20μL PerCP标记鼠抗人HLA-DR单抗；第三组分别添加20μLFITC标记鼠抗人CD40单抗、20μLPE标记鼠抗人CD80单抗和20μLPerCP标记鼠抗人HLA-DR单抗；第四组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgGl、20μLPE标记鼠IgGl和20μL PerCP标记鼠IgGl(BD公司)。置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。经检测，CD11c+/HLA-DR+细胞为97.9％，CD80+/HLA-DR+细胞为88.7％，CD40+/HLA-DR+细胞为96.8％，CD86+/CD11c细胞为97.8.2％，CD83+/CD11c+细胞为90.6％(高表达)。检测结果表明通过本发明所述方法得到的细胞为成熟树突状细胞疫苗，并高表达各类共刺激分子。 

附图说明

图1表示本发明大规模培养获得的树突状细胞的流式细胞图； 

图2表示本发明大规模培养的树突状细胞疫苗进行临床实验，患者血液中细胞因子分泌检测结果。 

具体实施方式

本发明发现通过血细胞分离机循环采集人外周血中白细胞，经体外纯化获得大量的单个核细胞，数量级可大于0.8×10⁹，简便地获得大量的未成熟树突状细胞，数量级可大于8×10⁷，将未成熟树突状细胞冷冻保存起来。每次治疗时吸取或复苏6×10⁶未成熟树突状细胞进行负载肿瘤抗原和诱导成熟，获得特异的树突状细胞疫苗，可用于多达13次以上与3个疗程以上的临床应用。 

对本发明涉及的一种大规模培养树突状细胞疫苗的制备方法进行具体说明。本发明涉及采用血细胞分离机通过采集人外周血中白细胞，经体外分离纯化获得大量的单个核细胞，在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素4诱导培养获得大量未成熟树突状细胞；未成熟树突状细胞负载肿瘤特异抗原后，并在肿瘤坏死因子α与脂多糖诱导培养条件下获得具有抗肿瘤作用的成熟树突状细胞疫苗。 

本发明涉及树突状细胞的体外培养方法：采用血细胞分离机进行循环0.5L-4L人外周血，采集白细胞，数量级可达到1×10⁹-3.5×10¹⁰；采集的白细胞进行体外分离纯化，去除红细胞、血小板和粒细胞等，获得单个核细胞，数量级可达到0.8×10⁹-2.8×10¹⁰。 

优选地，本发明所述方法为：根据血常规检测结果要求大于2.0×10⁹个白细胞/升，采用血细胞分离机进行循环1L人外周血，采集白细胞，数量级可达到2×10⁹；采集的白细胞进行体外分离纯化，去除红细胞、血小板和粒细胞等，获得单个核细胞，数量级可达到1.6×10⁹。 

血细胞分离机采集经纯化后的1.6×10⁹单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，苔盼兰染色计数，使用RPMI1640培养基调整到细胞浓度为3-5×10⁶/mL，并加入大容量培养皿或培养瓶中贴壁；在37℃、5％CO₂培养箱中孵育90min后(每半小时左右摇动几下)，未贴壁细胞洗涤收集下来；贴壁细胞加入培养基诱导培养，该培养基含有200ng/mL GM-CSF、50ng/mL IL-4和5％的自体血清；于37℃、5％CO₂培养箱中培养；在培养到第三天时1000rpm(转每分钟)离心10分钟收集细胞，半量更换新鲜RPMI1640培养基，该新鲜培养基含200ng/mL GM-CSF、50ng/mL IL-4和体积比5％自体血清；培养到第五天收获未成熟树突状细胞；获得未成熟树突状细胞苔盼兰计数，数量可大于12.8×10⁷，树突状细胞可冻存起来，6×10⁶个未成熟树突状细胞冻存1毫升，冻存管放置程序降温盒中，放入-80℃超低温冰箱过夜，第二天转至液氮冻存。 

每次吸取或复苏6×10⁶个未成熟树突状细胞用RPMI1640培养基(含体积比5％自体血清)稀释到细胞浓度2.5×10⁶/mL，并添加0.1mL的1×10⁶肿瘤全细胞抗原，或50ng/mL肿瘤特异表达抗原多肽，负载于树突状细胞，于37℃、5％C0₂培养箱中孵育2小时；孵育后添加10ng/mL肿瘤坏死因子α和10ug/mL脂多糖，培养到第7天收获树突状细胞疫苗。 

作为本发明制造方法中使用的大容量培养皿或培养瓶，可例举，为细胞培养板、225cm²细胞培养瓶、多层细胞培养瓶或多层细胞培养器等细胞培养用器材(容器)，均可用于本发明，优选多层细胞培养器。 

本发明的制造方法中对未成熟树突状细胞进行冻存，对冻存液无特殊限制，但优选例如为50％小牛血清、40％细胞培养液和10％二甲基亚砜，其中细 胞培养液更优选为未成熟树突状细胞培养液。 

在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。它们在培养基中的添加量不受特殊限制，如大于0容量％至20容量％，且可以根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用量，优选为5％(体积比)。例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。另外，作为血清或血浆的来源，可以是自己(意味着与所培养的细胞来源相同)或非自己(意味着与所培养的细胞的来源不同)中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。另外，也可以添加如人血清白蛋白之类经分离纯化的血清成分。 

本发明的大规模培养获取树突状细胞疫苗的制备除了使用血细胞分离单采经纯化获得大量单个核细胞外，使用上述各种成分及培养基来实施。本发明中使用的培养培养条件也没有特殊限制，可以使用通常的细胞培养中使用的条件。例如，可在37℃、5％CO2等条件下培养。还可以实施如下等操作：间隔适当的时间添加新鲜培养基来稀释细胞培养液，或更换培养基，或更换细胞培养用器材等。 

本发明还提供树突状细胞疫苗在临床应用中多次多疗程的抗肿瘤治疗，更好地在生物体内发挥抗肿瘤免疫应答，达到很好的治疗效果。此外，上述树突状细胞还具有如下优点，多次多疗程树突状细胞治疗将更好地激活记忆性T淋巴细胞，产生长期抗肿瘤免疫效应，因此非常利于患者疗效的提高和生存期的延长。 

以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。 

实施例一 

血细胞分离机单采的单个核细胞大规模培养树突细胞疫苗 

胃癌患者，男，35岁，血常规检测结果为4.2×10⁹个白细胞/升，采用血细胞分离机进行单采0.5L外周血，采集白细胞数量为2.1×10⁹(与该患者签署知情同意书)；采集的白细胞用100ml 1×PBS(pH＝7.4)重悬后，加入25ml0.6％羟乙基淀粉的生理盐水，混匀后静置30分钟，尽量吸取白色细胞层；白色细胞层经Ficoll-Hypaque密度梯度离心，得到单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，苔盼兰染色计数为1.44×10⁹。 

外周血单个核细胞用RPMI1640培养基调整到细胞浓度为5×10⁶，加入到2层细胞培养器(康宁公司)中贴壁，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育90min，每隔30分钟左右摇动，孵育后未贴壁细胞洗涤收集下来。贴壁细胞加入完全培养基RPMI1640诱导培养，培养基含有200ng/mL GM-CSF、50ng/mL IL-4和5％的自体血清；于37℃、5％CO₂培养箱中培养；在培养到第三天时1000rpm(转每分钟)离心10分钟收集细胞，半量更换新鲜RPMI1640培养基，该新鲜培养基含200ng/mL GM-CSF、50ng/mL IL-4和体积比5％自体血清；培养到第五天收获未成熟树突状细胞；获得未成熟树突状细胞苔盼兰计数，数量可大于12.8×10⁷，树突状细胞可冻存起来，6×10⁶个未成熟树突状细胞冻存1毫升，冻存管放置程序降温盒中，放入-80℃超低温冰箱过夜，第二天转至液氮冻存。 

每次吸取或复苏6×10⁶个未成熟树突状细胞用RPMI1640培养基(含体积比5％自体血清)稀释到细胞浓度2.5×10⁶/mL，并添加0.1mL的1×10⁶肿瘤全细胞抗原，或50ng/mL肿瘤特异表达抗原多肽，负载于树突状细胞，于37℃、5％CO₂培养箱中孵育2小时；孵育后添加10ng/mL肿瘤坏死因子α、10ug/mL脂多糖，培养到第7天收获树突状细胞疫苗； 

计算培养最后一天的活细胞数。取1mL最后一天培养的培养液，1000rpm、4℃下离心10分钟，细胞用RPMI1640培养基重悬，取20μL细胞液用1×PBS(pH7.4)稀释20倍，稀释液加入1倍体积的苔盼兰溶液，混匀后加入到细胞计数板，于倒置显微镜下观察计数，蓝色染色的为死细胞，不染色的为活细胞，细胞活率达到98％以上。 

取苔盼兰染色计数后的4×10⁶细胞，分四组，第一组分别添加到有20μLFITC标记鼠抗人CD11c单抗、20μL PE标记鼠抗人CD83单抗和20μL PerCP标记鼠抗人HLA-DR单抗；第二组分别添加20μL FITC标记鼠抗人CD11c单抗、20μLPE标记鼠抗人CD86单抗和20μLPerCP标记鼠抗人HLA-DR单抗；第三组分别添加20μL FITC标记鼠抗人CD40单抗、20μLPE标记鼠抗人CD80单抗和20μL PerCP标记鼠抗人HLA-DR单抗；第四组为同型对照，分别添加到有20μL FITC标记鼠IgGl、20μL PE标记鼠IgGl和20μL PerCP标记鼠IgGl(BD公司)。置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液(PBS) 洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。图1结果显示，CD11c+/HLA-DR+细胞为97.9％，CD80+/HLA-DR+细胞为88.7％，CD40+/HLA-DR+细胞为96.8％，CD86+/CD11c细胞为97.8.2％，CD83+/CD11c+细胞为90.6％(高表达)，表明通过本发明技术得到细胞为成熟树突状细胞疫苗，并高表达共刺激分子。 

实施例二 

血细胞分离机单采患者的单个核细胞获取树突细胞的大规模培养 

患者一：肺癌患者，男，43岁，血常规检测结果为2.8×10⁹个白细胞/升，采用血细胞分离机进行单采1L外周血，采集白细胞数量为2.18×10⁹。 

患者二：乳腺癌患者，女，51岁，血常规检测结果为3.2×10⁹个白细胞/升，采用血细胞分离机进行单采0.75L外周血，采集白细胞数量为2.4×10⁹。 

患者三：食管癌患者，男，31岁，血常规检测结果为7.0×10⁹个白细胞/升，采用血细胞分离机进行单采0.5L外周血，采集白细胞数量为3.5×10⁹。 

现有技术直接采集患者外周血进行树突状细胞的培养 

患者四：卵巢癌患者，女，45岁，血常规检测结果为6.6×10⁹个白细胞/升，直接静脉采血为200ml，外周血经0.6％羟乙基淀粉沉淀红细胞并用Ficoll-Hypaque密度梯度离心获得单个核细胞，苔盼兰染色计数为2.35×10⁸，用于诱导树突状细胞。 

患者五：前列腺癌患者，男，59岁，血常规检测结果为3.8×10⁹个白细胞/升，直接静脉采血为200ml，外周血经0.6％羟乙基淀粉沉淀红细胞并用Ficoll-Hypaque密度梯度离心获得单个核细胞，苔盼兰染色计数为1.41×10⁸，用于诱导树突状细胞。 

与患者均签署知情同意书。 

采集的白细胞经Ficoll-Hypaque密度梯度离心，得到单个核细胞。按照实施例一的方法大规模培养树突状细胞。 

采用苔盼兰染色计算培养最后一天的树突状细胞数和细胞活率，以及树突状细胞通过流式抗体染色和流式细胞仪检测，分析细胞表型。 

表一 

  患者   树突状细   活率   CD11c+/   CD83+/   CD86+/   CD80+/   CD40+/

[0049] 

   胞数    HLA-DR+   CD11c+   CD11c+   HLA-DR+   HLA-DR+   患者一   13.1×10⁷  98.7％   95.8％   90.6％   91.9％   91.4％   89.1％   患者二   15.6×10⁷  99.1％   91.7％   88.5％   90.2％   90.7％   85.8％   患者三   14.3×10⁷  99.4％   92.9％   87.9％   91.4％   89.0％   70.1％   患者四   3.2×10⁷  98.6％   89.3％   85.6％   88.5％   89.1％   68.7％   患者五   2.87×10⁷  99.1％   90.3％   84.8％   89.1％   85.4％   73.0％

实施例三 

本发明大规模培养获得树突状细胞疫苗的临床实验 

应用本发明中实施例二制备获得的树突状细胞疫苗进行临床实验。 

本发明大规模培养获得的患者树突状细胞疫苗和直接外周血单个核细胞培养获得的患者树突状细胞疫苗对患者进行临床应用(与患者均签署知情同意书)。患者一个疗程接受四次树突状细胞疫苗治疗，每隔1周治疗一次，每次树突状细胞为5×10⁶，腹部沟淋巴结部位皮内注射。其中大规模培养获得树突状细胞疫苗可进行多疗程，每隔两个月进行下个疗程治疗，共2.5到3个疗程；而直接采集外周血的患者需要在第三次树突状细胞治疗前再次采血，完成这一个疗程治疗。 

进行树突状细胞临床实验的患者在细胞治疗前1天、每次治疗完1个疗程后一周进行细胞因子分泌检测，以及整个治疗完成后影像学检测肿瘤大小等指标。 

细胞因子(白介素2和白介素12)通过酶联反应试剂盒检测血清中的含量，干扰素γ通过斑点酶联反应试剂盒检测白细胞的分泌含量。白介素2、白介素12和干扰素γ的分泌提高表明患者机体免疫力提高，对肿瘤细胞的抵抗增强，有助于患者疗效提高和生存期延长。图2中发现白介素2、白介素12和干扰素γ在树突状细胞治疗后都明显提高，而且经过本发明大规模培养的树突状细胞疫苗多疗程治疗后的患者细胞因子提高更多，远大于一个疗程治疗的患者。 

同时患者细胞治疗完成之后通过CT影像学检测，患者二手术后余下的微 小肿瘤消失，并得到有效的控制，患者一和三肿瘤大小明显缩小。