难溶性三环衍生物化合物的溶解度得到提高的药学组合物

摘要

本发明涉及一种包含由磷脂质、胆固醇、离子脂质及三环衍生物化合物组成的纳米粒子的、三环衍生物化合物的溶解度得到提高的药学组合物，根据本发明，由于制备脂质纳米粒子，因而在不使用对人体有害的溶解补助剂的情况下，能够使难溶性三环衍生物化合物以高浓度进行溶解，之后，为了作为注射剂来使用即使加水也能够维持所提高的溶解度，长期保管时也呈现稳定性。因此，本发明的脂质纳米粒子能够有用地使用于制备以难溶性三环衍生物化合物作为有效成分的药学制剂。

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种包含磷脂质、胆固醇及离子脂质的脂质混合物； 以及包含由三环衍生物化合物组成的脂质纳米粒子的溶解度得到提高 的药学组合物及上述脂质纳米粒子的制备方法。

【背景技术】

韩国专利授权第10-0667464-0000号中公开了上述化学式1的三 环衍生物化合物。化学式1的化合物作为秋水仙碱的衍生物对癌细胞 株呈现出很强的细胞毒性，在动物毒性试验中比起秋水仙碱或紫杉醇 注射剂其毒性明显下降，并明显减少肿瘤大小及肿瘤重量，在人脐静 脉血管内皮细胞（HUVEC）中起到强有力的血管新生抑制作用，因 此，在临床上能够作为有用的抗癌剂、抗增殖抑制剂及血管新生抑制 剂来使用。但是化学式1的三环衍生物化合物对水相（aqueous phase） 的溶解度低，从而在无菌水、注射用水、去离子水及缓冲溶剂等药品 制备用水相中，体内利用率低或者即使是可溶解的药剂学组合物，但 会发生体内投用之后从体液及组织被析出等现象，因此，开发稳定的 药剂学制剂具有局限性。

为了将以下化学式1的三环衍生物化合物溶解于水相，应使用二 甲亚砜、吐温80、氢化蓖麻油等溶解补助剂，众所周知，这些溶解补 助剂，特别是氢化蓖麻油对人体有副作用，从而出现严重的过敏性反 应。

【化学式1】

公开了用于溶解这些溶解性低的各种各样的技术，即，纳米粒子、 固体分散体及胶束等。

将化合物包装于如脂质体或胶束的脂质凝聚体，使不溶性、水解 性化合物在临床条件下也可以投用。生理学上，脂质体能够相容于广 泛的药物，众所周知，脂质体是具有生物降解性的运送系统。并且， 由于水相中不要求溶剂化，因此，不溶性化合物比单独的游离状态更 为浓缩、容易地被制备，能够以高浓度将药物运送到作用部位。

美国专利第5439686号、第5560933号中介绍了利用白蛋白微粒 子，使紫杉醇分散成稳定形态的制剂的制备技术。但是，与使用以往 的表面活性剂的制剂相比，存在由于紫杉醇的白蛋白粒子吸附血浆内 的蛋白质导致药效降低的问题。

并且，韩国公开专利第1999-006903号中介绍了制备聚交酯、聚 乙醇酸交酯等含有生物降解性及疏水性的高分子，并制备含有聚乙二 醇的两亲嵌段共聚物，从而使二萜类生物碱药物可溶解的技术。虽然 这个技术有效实现药物的可溶解及可溶解的剂型的毒性降低，但是体 内投用时，由于胶束的结构不稳定而导致胶束的核-壳结构容易被破 坏，因而存在致使已封入的药物被析出的缺点。

并且，韩国公开专利第2001-0030599号中介绍了在脂质体包含 经过胶囊化的喜树碱的制剂及其制备方法。制剂内含有包含一个以上 的磷脂质及喜树碱的脂质体，该脂质体制剂比起游离的药物具有改善 的药物动力学性及稳定性。但是，由于封入于每个脂质体的药物量少， 因此，将药物封入于经过胶囊化的脂质体的技术不适合高浓度溶液的 制剂技术。

如上所述，为了开发出溶解度低的化学式1的三环衍生物化合物 以高浓度可溶解于水相的药学性制剂，确切需要三环衍生物化合物稳 定地包含在其结构体内，并且在水溶液中稳定地分散包含化合物的结 构体，最终在水溶液内能够以高浓度可溶解难溶性药物的技术。并且， 通过体内投用时包含于结构体的药物不因体液或蛋白质、盐等体内成 分所容易破坏，因此需要开发体内投用后药物不从可使药物溶解的结 构体中游离或析出等，体内稳定性优秀的用于使三环衍生物化合物可 溶解的纳米结构体。

为此，本发明者利用将脂质混合物导入于难溶性三环衍生物化合 物的脂质纳米粒子，在不使用对人体有害的溶解补助剂的情况下也提 高了三环衍生物化合物的溶解度，之后，确认了为了作为注射剂来使 用，即使加水也能够维持得到提高的溶解度，并且也确认了长期保管 所制备的固体状态的脂质纳米粒子时的稳定性，从而完成了本发明。

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

本发明的目的在于，提供一种包含由难溶性三环衍生物化合物及 脂质混合物组成的脂质纳米粒子的溶解度得到提高的药学组合物。

本发明的另一目的在于，提供一种包含于上述药学组合物的脂质 纳米粒子的制备方法。

【解决课题的技术方案】

为了实现上述目的，本发明提供一种三环衍生物化合物的溶解度 得到提高的药学组合物，该药学组合物包含：脂质混合物，其由选自 包含磷脂质、胆固醇及离子脂质的组中的2种以上组成；以及脂质纳 米粒子，其由以下化学式1表示的难溶性三环衍生物化合物组成。

【化学式1】

并且，本发明提供一种上述药学组合物的制备方法，上述药学组 合物的制备方法包括如下步骤：步骤1，将由选自包含磷脂质、胆固 醇及离子脂质的组中的2种以上组成的脂质混合物溶解于有机溶剂， 来制备脂质混合物溶液；步骤2，将由权利要求1的化学式1表示的 三环衍生物化合物溶解于上述步骤1中所制备的脂质混合物溶液；步 骤3，将包含上述步骤2中所制备的三环衍生物化合物的脂质混合物 溶液与水进行混合，并照射超声波，来制备分散的脂质纳米粒子溶液； 步骤4，对上述步骤3中制备的脂质纳米粒子溶液进行减压蒸馏，来 除去有机溶剂；以及步骤5，对上述步骤4中所制备的脂质纳米粒子 溶液进行冷冻干燥。

【发明效果】

根据本发明具有如下效果：通过将脂质混合物导入于上述化学式 1的难溶性三环衍生物化合物中，并照射超声波来制备脂质纳米粒子， 从而在不使用对人体有害的溶解补助剂的情况下，也能够提高三环衍 生物化合物的溶解度，之后，为了作为注射剂来使用，即使加水也能 够维持所提高的溶解度。并且，所制备的固体状态的脂质纳米粒子在 长期保管时也呈现稳定性。因此，本发明能够普遍适用于使用三环衍 生物化合物的药剂学制剂的制备。

【附图说明】

图1表示为了测定有机溶剂中的三环衍生物化合物的溶解度而执 行高效液相色谱法（HPLC）的标准曲线。

图2是本发明一实施例的利用粒子分析仪来测定脂质纳米粒子大 小的曲线图。

图3是本发明一实施例的脂质纳米粒子的冷冻蚀刻-透射电子显 微镜（Cryo-TEM）图像。

图4是本发明一实施例的不包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子的冷冻蚀刻-透射电子显微镜（Cryo-TEM）图像。

图5是本发明一实施例的不包含离子脂质的脂质纳米粒子的冷冻 蚀刻-透射电子显微镜（Cryo-TEM）图像。

图6是本发明一实施例的从不包含离子脂质的脂质纳米粒子中游 离的三环衍生物化合物的冷冻蚀刻-透射电子显微镜（Cryo-TEM）图 像。

【实施方式】

本说明书中的术语“脂质纳米粒子”是指由磷脂质、胆固醇、离子 脂质及由以下化学式1表示的三环衍生物化合物组成的纳米粒子。

以下，对本发明进行详细的说明。

本发明提供一种三环衍生物化合物的溶解度得到提高的药学组合 物，该药学组合物包含：脂质混合物，其由选自包含磷脂质、胆固醇 及离子脂质的组中的2种以上组成；以及脂质纳米粒子，其由以下化 学式1表示的难溶性三环衍生物化合物组成。

【化学式1】

上述脂质混合物中，作为磷脂质可以使用任意的磷脂质或能够形 成脂质体的磷脂质的组合体，例如，可以在蛋黄、大豆或其他植物源 中获得的天然磷脂质、包含半合成磷脂质或合成磷脂质的磷脂酰胆碱 （HSPC）、脂质链的长度为各种各样的磷脂质、不饱和磷脂质等中 适当地选择使用。具体地，可使用选自二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、 氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC）、大豆磷脂酰胆碱（Soy PC）、蛋黄 磷脂酰胆碱（Egg PC）、氢化蛋黄磷脂酰胆碱（HEPC）、二棕榈酰 磷脂酰胆碱（DPPC）、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）中的某一 种或两种以上的混合物，其中，优选地使用氢化大豆磷脂酰胆碱 （HSPC）。

并且，作为上述脂质混合物的离子脂质可使用阴离子脂质或阳离 子脂质。

上述阴离子脂质可使用选自二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）、 二月桂酰磷脂酰甘油（DLPG）、二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）、二 硬脂酰磷脂酰甘油（DSPG）、二肉豆蔻酰磷脂酸（DMPA）、二硬 脂酰磷脂酸（DSPA）、二月桂酰磷脂酸（DLPA）及二棕榈酰磷脂酸 （DPPA）中的某一种或两种以上的混合物，其中，更优选地使用二 棕榈酰磷脂酸（DPPA）。

上述阳离子脂质可使用选自二油酰三甲胺丙烷（DOTAP）、二甲 基十八烷基铵（DMOA）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、二烷基 二甲基溴化铵（DXDAB）及二烷基三甲基铵丙烷（DXTAP）中的某 一种或两种以上的混合物。

本发明的上述脂质混合物的结构成分的特征在于，磷脂质形成上 述脂质纳米粒子的结构，胆固醇使所形成的上述脂质纳米粒子结构稳 定化，而离子脂质则防止所形成的上述脂质纳米粒子之间互相凝聚在 一起。

本发明的上述脂质混合物中，磷脂质：胆固醇：离子脂质的重量 份优选为0-100：0-20：0-10，更优选为0-20：0-7：1-3，最优选为7： 3：1。

如果，磷脂质的重量份大于100的情况、胆固醇的重量份大于20 的情况或离子性磷脂质的重量份大于10的情况下，存在粒子大小过于 变大的问题。

并且，本发明的包含磷脂质、胆固醇及离子脂质的脂质混合物与 三环衍生物化合物的重量份优选为1-20：1，更优选为3：1。若对三 环衍生物化合物的脂质混合物的重量份小于1，脂质纳米粒子的大小 则变大，由于产生从脂质纳米粒子中游离的化合物，因此，存在改善 化合物的溶解度的效果甚微的问题，而在上述重量份大于20的情况 下，不仅没有改善粒子大小的效果，而且大大增加了使脂质混合物溶 解的溶剂量，从而发生了工序上的问题，并导致了降低经济性的问题。

并且，本发明的上述脂质纳米粒子的大小优选为1nm-1000nm， 更优选为20nm-200nm。若上述脂质纳米粒子的大小小于1nm，则存 在药物封入率下降的问题，若脂质纳米粒子的大小大于1000nm，则 存在难以作为注射剂来使用的问题。

并且，本发明的药学组合物可添加选自乙二胺四乙酸、异抗坏血 酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯、抗坏血酸、 α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚等通常所使用的抗氧化剂中 的一种或两种以上。

并且，本发明的药学组合物可包含蔗糖、甘露醇及肌酸酐等通常 使用的冷冻保护剂（bulking agent for freeze drying）。这些冷冻保护 剂在以下脂质纳米粒子的制备方法的步骤5中，能够防止当冷冻干燥 时，脂质纳米粒子之间的凝聚，将所制备的固体状态的脂质纳米粒子 添加于注射用水的情况下，不再凝聚，并迅速分散，从而维持初期的 脂质纳米粒子的大小。

并且，本发明提供一种包含上述化学式1的三环衍生物化合物的 脂质纳米粒子的制备方法。

详细地，本发明提供一种脂质纳米粒子的制备方法，该制备方法 包括如下步骤：步骤1，将由选自包含磷脂质、胆固醇及离子脂质的 组中的2种以上组成的脂质混合物溶解于有机溶剂中，来制备脂质混 合物溶液；

步骤2，将由上述化学式1表示的三环衍生物化合物溶解于上述 步骤1中所制备的脂质混合物溶液；

步骤3，将包含上述步骤2中所制备的三环衍生物化合物的脂质 混合物溶液与水进行混合，并照射超声波，来制备分散的脂质纳米粒 子溶液；

步骤4，对上述步骤3中制备的脂质纳米粒子溶液进行减压蒸馏， 来除去有机溶剂；以及

步骤5，对上述步骤4中制备的脂质纳米粒子溶液进行冷冻干燥。

以下，分步骤对本发明进行更为详细的说明。

本发明的上述脂质纳米粒子的制备方法中，上述步骤1是将上述 脂质混合物溶解于有机溶剂中，来制备脂质混合物溶液的步骤。作为 使上述脂质混合物溶解的有机溶剂可使用氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙 醇、丙酮、乙腈、异丙醇及四氢呋喃等。

此时，上述磷脂质、胆固醇及离子脂质的重量份比优选为0-100： 0-20：0-10，更优选为0-20：0-7：1-3，最优选为7：3：1。限定上述 磷脂质、胆固醇及离子脂质的重量份比的理由如上所述。

另一方面，优先地，在上述脂质混合物溶液中，将上述脂质混合 物的浓度调节为20mg/ml-200mg/ml的范围。

本发明的上述脂质纳米粒子的制备方法中，上述步骤2是将三环 衍生物化合物溶解于从上述步骤1中得到的脂质混合物溶液的步骤。

此时，上述脂质混合物、三环衍生物化合物的重量份比可以为 1-20：1，优选为3：1。

另一方面，优先地，上述脂质混合物溶液内，将三环衍生物化合 物的浓度调节为20mg/ml-200mg/ml的范围。

本发明的上述脂质纳米粒子的制备方法中，上述步骤3是从上述 步骤2得到的脂质混合物溶液中获得脂质纳米粒子溶液的步骤。具体 的，步骤3是将包含从上述步骤2中得到的三环衍生物化合物的脂质 混合物溶液与水进行混合，并照射超声波，来制备脂质混合物所分散 的脂质纳米粒子溶液的步骤。

用于获得上述所分散的脂质纳米粒子溶液的方法包括如下步骤： 步骤1），将水添加于包含三环衍生物化合物的脂质混合物溶液，步 骤2），将包含三环衍生物化合物的脂质混合物溶液添加于水中，步 骤3），同时添加包含三环衍生物化合物的脂质混合物溶液及水；本 发明可使用所有步骤，但是，从能够提高所生成的脂质纳米粒子的稳 定性的角度来看，优先地，使用上述步骤1）。

另一方面，上述超声波照射装置没有特别的限制，但是，优先地， 使用尖端超声波仪。

本发明的上述脂质纳米粒子的制备方法中，上述步骤4是对从上 述步骤3获得的脂质纳米粒子溶液进行减压蒸馏的步骤。具体地，对 从上述步骤3获得的所分散的脂质纳米粒子溶液进行减压蒸馏，并除 去有机溶剂获得脂质纳米粒子溶液的步骤。

上述步骤4中，根据需要能够利用气孔（pore）大小为0.1μm-0.5μm 的薄膜，并且追加执行过滤灭菌，优选地，利用气孔大小为0.2μm的 薄膜。若上述薄膜的气孔大小小于0.1μm，脂质纳米粒子则无法通过， 相反，上述薄膜的气孔大小大于0.5μm，则存在包含不适于注射剂的 大小的粒子的问题。

另外，上述步骤4中，根据需要能够添加减压蒸馏之后乙二胺四 乙酸、异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、没食子酸丙 酯、抗坏血酸、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚等通常使用 的抗氧化剂或蔗糖、甘露醇、肌酸酐等通常使用的冷冻保护剂。

本发明的上述脂质纳米粒子的制备方法中，上述步骤5是对从上 述步骤4中获得的脂质纳米粒子溶液进行冷冻干燥，从而得到作为对 象物质的固体状态脂质纳米粒子的步骤。

另一方面，本发明的固体状态的脂质纳米粒子不使用对人体有害 的溶解补助剂，也提高了三环衍生物化合物的溶解度，之后，为了作 为注射剂来使用即使加水也呈现维持所提高的溶解度的效果。

并且，长期保管时，也呈现所制备的固体状态的脂质纳米粒子维 持形状及纯度的稳定性，因此，能够有用于以三环衍生物化合物为有 效成分的药学性制剂的制备。

本发明的包含上述脂质纳米粒子的溶解度得到提高的药学组合 物，在药剂学上也可以用如下各种各样的口服或非口服用药形态来进 行剂型化。

口服用药剂型的例子为片剂、丸剂、硬胶囊剂/软胶囊剂、液剂、 糖浆剂、颗粒剂及酏剂（elixirs）等，这些剂型除了上述有效成分之 外可以使用通常使用的填充剂、增量剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、 结合剂及表面活化剂等的稀释剂或赋形剂中的一种以上。

作为崩解剂可以使用琼脂、淀粉、藻酸或其钙盐及无水磷酸一氢 钙盐等，作为润滑剂可以使用二氧化硅、滑石、硬脂酸或其镁盐或钙 盐及聚乙二醇等，作为结合剂可以使用硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄 芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮及低取代度羟 丙基纤维素等。

此外，能够将乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素及 甘氨酸等作为稀释剂来使用，根据情况能够与一般所知道的沸腾混合 物、吸收剂、着色剂、香味剂及甜味剂等同时使用。

并且，本发明的上述药学组合物可以进行非口服，非口服包括注 入皮下注射剂、静脉注射剂、肌肉注射剂或胸部注射剂的方法或利用 经皮吸收剂进行经皮投用的方法。

此时，为了利用注射剂来制剂化，在水中混合上述化学式1的衍 生物或药学上许可的该衍生物的盐与稳定剂或缓冲剂后制备成溶液或 悬浊液，并且能够将这些制备成安瓿或小瓶的单位投用型。

并且，为了利用经皮吸收剂来制剂化，能够储存于由药物保护层、 药物储存层、排出速度调节膜及粘着剂等形成的补片型的药物储存层， 并使其制剂化。

上述组合物可包含灭菌或防腐剂、稳定剂或用于渗透压调节的盐、 缓冲剂等的补助剂以及其他治疗上有用的物质，可以根据作为普通方 法的混合、颗粒化或涂敷方法来实现制剂化。必要的情况下，本发明 的上述组合物也能够与其他药剂，例如，与其他癌症治疗剂一起投用。

将本发明的上述组合物剂型化为单位用量形态的情况下，优选地， 有效成分包含约0.1mg-1500mg的单位容量的化学式1的衍生物或药 学上许可的该衍生物的盐。用药量根据例如患者的体重、年龄及疾病 的特殊性质及严重性等因素遵照医生的处方。但是，治疗成人时所需 要的投用量根据投用频度及强度通常一天为约1mg-500mg范围。给成 人进行肌肉内投用或静脉内投用时，分为一次投用量，并且一天通常 约5mg-300mg的全部投用量才能够充分，但是部分患者的情况，可以 优选为更高的每日投用量。

【具体实施方式】

以下，对本发明的实施例进行更为详细的说明。以下实施例只是 本发明的示例，本发明的内容并不局限于此。

【实施例】

【实施例1：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子1】

使氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC）4.582g、胆固醇1.964g、二棕榈 酰磷脂酸（DPPA）0.655g及α-生育酚14.4mg（磷脂质：胆固醇：离 子脂质的重量份为7：3：1）溶解于甲醇60ml及二氯甲烷40ml的有 机溶剂，并在制备出的脂质混合物溶液中添加化学式1的三环衍生物 化合物2.4g并使溶解（脂质混合物：三环衍生物化合物的重量份为3： 1）。

将包含上述三环衍生物化合物的脂质混合物溶液冷却为0℃后， 以25ml/min的速度添加蒸馏水200ml，并利用尖端超声波仪（VCX750, 声能学：Sonics）照射超声波来使脂质纳米粒子分散，接着，执行减 压蒸馏来除去有机溶剂，并利用0.2μm薄膜进行过滤并灭菌。

在上述制备出的脂质纳米粒子溶液添加蔗糖28.8g，并执行冷冻干 燥过程，从而制备包含三环衍生物化合物的固体状态的脂质纳米粒子。

在经过灭菌的脂质纳米粒子中添加蔗糖28.8g，并执行冷冻干燥过 程，从而制备包含三环衍生物化合物的固体状态的脂质纳米粒子。

【实施例2：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子2】

实施例1中，通过调换将蒸馏水添加于包含三环衍生物化合物的 脂质混合物溶液中，进行混合的顺序，除了将包含三环衍生物化合物 的脂质混合物溶液添加于蒸馏水200ml中之外，利用与实施例1相同 的方法来制备包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子。

【实施例3：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子3】

除了同时添加包含三环衍生物化合物的脂质混合物溶液与蒸馏水 200ml之外，利用与实施例1相同的方法来制备包含三环衍生物化合 物的脂质纳米粒子。

【实施例4：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子4】

除了使用氢化大豆磷脂酰胆碱3.055g、胆固醇1.309g及二棕榈酰 磷脂酸（DPPA）0.436g（磷脂质：胆固醇：离子脂质的重量份为7： 3：1）之外，利用与实施例1相同的方法来制备包含三环衍生物化合 物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍生物化合物的重量份=2： 1）。

【实施例5：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子5】

除了使用氢化大豆磷脂酰胆碱1.527g、胆固醇0.655g及二棕榈酰 磷脂酸0.218g（磷脂质：胆固醇：离子脂质的重量份为7：3：1）之 外，利用与实施例1相同的方法来制备包含三环衍生物化合物的脂质 纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍生物化合物的重量份=1：1）。

【实施例6：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子6】

使用化学式1的三环衍生物化合物180mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 458mg、胆固醇196mg及二棕榈酰磷脂酸65mg（磷脂质：胆固醇： 离子脂质的重量份为7：3：1），并利用与实施例1相同的方法来制 备包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍 生物化合物的重量份=4：1）。

【实施例7：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子7】

使用化学式1的三环衍生物化合物120mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 458mg、胆固醇196mg及二棕榈酰磷脂酸65mg（磷脂质：胆固醇： 离子脂质的重量份为7：3：1），并利用与实施例1相同的方法来制 备包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍 生物化合物的重量份=6：1）。

【实施例8：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子8】

使用化学式1的三环衍生物化合物72mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 458mg、胆固醇196mg及二棕榈酰磷脂酸65mg（磷脂质：胆固醇： 离子脂质的重量份为7：3：1），并利用与实施例1相同的方法来制 备包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍 生物化合物的重量份为10：1）。

【实施例9：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子9】

使用化学式1的三环衍生物化合物36mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 458mg、胆固醇196mg及二棕榈酰磷脂酸65mg（磷脂质：胆固醇： 离子脂质的重量份为7：3：1），并利用与实施例1相同的方法来制 备包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍 生物化合物的重量份为20：1）。

【实施例10：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子10】

使用化学式1的三环衍生物化合物240mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 504mg及胆固醇216mg（磷脂质：胆固醇：离子脂质的重量份为7： 3：0），并利用与实施例1相同的方法来制备包含三环衍生物化合物 的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍生物化合物的重量份为3： 1）。

【实施例11：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子11】

使用化学式1的三环衍生物化合物72mg、胆固醇162mg及二棕 榈酰磷脂酸54mg（磷脂质：胆固醇：离子脂质的重量份为0：3：1）， 并利用与实施例1相同的方法来制备包含三环衍生物化合物的脂质纳 米粒子（脂质混合物溶液：三环衍生物化合物的重量份为3：1）。

【实施例12：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子12】

使用化学式1的三环衍生物化合物168mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 441mg及二棕榈酰磷脂酸63mg（磷脂质：胆固醇：离子脂质的重量 份为7：0：1），并利用与实施例1相同的方法来制备包含三环衍生 物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍生物化合物的重 量份为3：1）。

【实施例13：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子13】

使用化学式1的三环衍生物化合物80mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 129mg、胆固醇55mg及二棕榈酰磷脂酸55mg（磷脂质：胆固醇：离 子脂质的重量份为7：3：3），并利用与实施例1相同的方法来制备 包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍生 物化合物的重量份为3：1）。

【实施例14：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子14】

使用化学式1的三环衍生物化合物48mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 67mg、胆固醇29mg及二棕榈酰磷脂酸48mg（磷脂质：胆固醇：离 子脂质的重量份为7：3：5），并利用与实施例1相同的方法来制备 包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍生 物化合物的重量份为3：1）。

【实施例15：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子15】

使用化学式1的三环衍生物化合物41mg，氢化大豆磷脂酰胆碱 43mg、胆固醇18mg及二棕榈酰磷脂酸61mg（磷脂质：胆固醇：离 子脂质的重量份为7：3：10），并利用与实施例1相同的方法来制备 包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍生 物化合物的重量份为3：1）。

【实施例16：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子16】

使用化学式1的三环衍生物化合物96mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 58mg、胆固醇173mg及二棕榈酰磷脂酸58mg（磷脂质：胆固醇：离 子脂质的重量份为1：3：1），并利用与实施例1相同的方法来制备 包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍生 物化合物的重量份为3：1）。

【实施例17：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子17】

使用化学式1的三环衍生物化合物144mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 185mg、胆固醇185mg及二棕榈酰磷脂酸62mg（磷脂质：胆固醇： 离子脂质的重量份为3：3：1），并利用与实施例1相同的方法来制 备包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍 生物化合物的重量份为3：1）。

【实施例18：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子18】

使用化学式1的三环衍生物化合物312mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 669mg、胆固醇200mg及二棕榈酰磷脂酸67mg（磷脂质：胆固醇： 离子脂质的重量份为10：3：1），并利用与实施例1相同的方法来制 备包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍 生物化合物的重量份为3：1）。

【实施例19：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子19】

使用化学式1的三环衍生物化合物184mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 460mg、胆固醇69mg及二棕榈酰磷脂酸23mg（磷脂质：胆固醇：离 子脂质的重量份为20：3：1），并利用与实施例1相同的方法来制备 包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍生 物化合物的重量份为3：1）。

【实施例20：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子20】

使用化学式1的三环衍生物化合物176mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 466mg、胆固醇46mg及二棕榈酰磷脂酸16mg（磷脂质：胆固醇：离 子脂质的重量份为30：3：1），并利用与实施例1相同的方法来制备 包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍生 物化合物的重量份为3：1）。

【实施例21：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子21】

使用化学式1的三环衍生物化合物182mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 505mg、胆固醇30mg及二棕榈酰磷脂酸10mg（磷脂质：胆固醇：离 子脂质的重量份为50：3：1），并利用与实施例1相同的方法来制备 包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍生 物化合物的重量份为3：1）。

【实施例22：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子22】

使用化学式1的三环衍生物化合物165mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 475mg、胆固醇14mg及二棕榈酰磷脂酸5mg（磷脂质：胆固醇：离 子脂质的重量份为100：3：1），并利用与实施例1相同的方法来制 备包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍 生物化合物的重量份为3：1）。

【实施例23：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子23】

使用化学式1的三环衍生物化合物192mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 448mg、胆固醇64mg及二棕榈酰磷脂酸64mg（磷脂质：胆固醇：离 子脂质的重量份为7：1：1），并利用与实施例1相同的方法来制备 包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍生 物化合物的重量份为3：1）。

【实施例24：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子24】

使用化学式1的三环衍生物化合物288mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 465mg、胆固醇332mg及二棕榈酰磷脂酸66mg（磷脂质：胆固醇： 离子脂质的重量份为7：5：1），并利用与实施例1相同的方法来制 备包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍 生物化合物的重量份为3：1）。

【实施例25：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子25】

使用化学式1的三环衍生物化合物336mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 470mg、胆固醇470mg、二棕榈酰磷脂酸67mg（磷脂质：胆固醇：离 子脂质的重量份为7：7：1），并利用与实施例1相同的方法来制备 包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子。（脂质混合物溶液：三环衍 生物化合物的重量份为3：1）

【实施例26：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子26】

使用化学式1的三环衍生物化合物136mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 159mg、胆固醇227mg及二棕榈酰磷脂酸23mg（磷脂质：胆固醇： 离子脂质的重量份为7：10：1），并利用与实施例1相同的方法来制 备包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍 生物化合物的重量份为3：1）。

【实施例27：制备本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒 子27】

使用化学式1的三环衍生物化合物118mg、氢化大豆磷脂酰胆碱 88mg、胆固醇253mg及二棕榈酰磷脂酸13mg（磷脂质：胆固醇：离 子脂质的重量份为7：20：1），并利用与实施例1相同的方法来制备 包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子（脂质混合物溶液：三环衍生 物化合物的重量份为3：1）。

【比较例1：制备不包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子】

在实施例1中除了不添加三环衍生物化合物的之外，利用与实施 例1相同的方法来制备脂质纳米粒子。

【参照例1：测定三环衍生物化合物对水的溶解度】

化学式1的三环衍生物化合物对水的溶解度测定如下。

首先，将上述三环衍生物化合物1.42mg溶解于乙腈，并制备了 100μg/ml溶液之后依次进行稀释，制备了50μg/ml、20μg/ml及10μg/ml 的标准溶液。在该标准溶液添加了3-乙氧基硫代秋水仙碱 （3-ethoxythio colchicine）作为内部标准物质，并在表1中以标准曲 线来表示了利用高效液相色谱法（HPLC）分析的三环衍生物化合物 的面积比。

然后，将三环衍生物化合物1g添加于蒸馏水10ml中，并制备混 浊液之后，在常温下进行24小时搅拌来充分溶解后，利用0.2μm薄 膜过滤不溶物质，将3-乙氧基硫代秋水仙碱（3-ethoxythiocol chicine） 作为内部标准物质添加于剩下的滤液中，并比较利用高效液相色谱法 （HPLC）分析的三环衍生物化合物的面积比与图1中表示的标准曲 线的面积，从而计算出溶解于水的三环衍生物化合物的浓度。

实验结果，三环衍生物化合物对水的溶解度显示为0.00μm/ml， 从而可知该三环衍生物化合物对于水相具有难溶性。

【参照例2：测定三环衍生物化合物对溶解补助剂的溶解度】

如下测定化学式1的三环衍生物化合物对溶解补助剂的溶解度。

利用上述比较实验例1中使用的方法来测定使用用于注射剂的一 般的各种各样的溶解补助剂的情况时的三环衍生物化合物的溶解度的 结果如下表1所示。

表1

  溶剂   电容率  溶解度（mg/ml）   水   78.5  未检出   5%盐酸水溶液   -  未检出   5%碳酸氢钠水溶液   -  未检出   5%氧化钠水溶液   -  未检出   丙三醇   40.1  0.0048   N，N-二甲基乙酰胺   37.8  >218   丙二醇   32.01  2.3   乙醇   24.3  0.035   聚乙二醇400（PEG400）   12.5  52.04   苯甲醇   -  >103

如表1所示，使三环衍生物化合物溶解于水性溶液的情况下，可 知即使改变了pH，也没有改善溶解度的效果，当使用有机溶剂中的 丙三醇、丙二醇及乙醇等的情况下，也可知几乎没有改善溶解度的效 果。

使三环衍生物化合物溶解于N，N-二甲基乙酰胺、聚乙二醇400、 苯甲醇等的有机溶剂的情况下，具有改善溶解度的效果，但是，为了 作为注射剂来使用，混合水后确认了三环衍生物化合物的溶解度急剧 降低。其结果如下表2所示。

表2

  溶剂比率PEG400：水  溶解度（mg/ml）   0∶100  未检出   10∶90  0.00021   20∶80  0.00294   30∶70  0.001238   40∶60  0.05395   50∶50  0.18881   100∶0  52.04

如表1及表2所示，即使将对溶解度具有改善效果的溶剂作为溶 解补助剂来使用，为了使三环衍生物化合物溶解而需要过度使用对人 体有害的溶解补助剂，因此可知不优选使用溶解补助剂。

【实验例1：测定包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子的溶解 度】

为了测定实施例1中制备的脂质纳米粒子的溶解度，进行如下的 实验。

实施例1中制备的包含三环衍生物化合物的固体状态的脂质纳米 粒子660mg中添加蒸馏水4.0ml后使溶解。之后，利用与上述比较实 验例1相同的方法来测定以后溶解于溶液中的三环衍生物的浓度的结 果显示为10.80mg/ml。

与比较实验例1中所测定的三环衍生物化合物对水的溶解度为 0.00mg/ml相比，确认了溶解度得到提高。

并且，在比较实验例2中使用溶解补助剂使三环衍生物化合物溶 解后追加地添加水的情况下，呈现溶解度急剧下降，相反，如实验例1 中所示，可知本发明的包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子的溶解 度维持所改善的效果。

【实验例2：根据包含三环衍生物化合物的脂质混合物溶液的分 散方法来测定脂质纳米粒子的大小】

利用粒子分析仪（型号名称：ZETA SIZER-3000，制造商：墨尔 本）来测定使用与包含三环衍生物化合物的脂质混合物溶液的分散方 法不同的方法来制备的实施例1至实施例3的脂质纳米粒子的大小的 结果如下表3所示，并且利用上述粒子分析仪测定实施例1的脂质纳 米粒子的大小的曲线图如图2所示。

表3

  分散方法 粒子大小（nm）  实验例1   将水添加于脂质混合物溶液来使分散 103.7  实验例2   将脂质混合物溶液添加于水来使分散 123.2  实验例3   同时添加脂质混合物溶液与水来使分散 107.6

如表3所示，根据包含三环衍生物化合物的脂质混合物溶液的分 散方法的差异来产生的脂质纳米粒子的大小之差为20nm以上，因此， 可知根据上述分散方法能够调节脂质纳米粒子的大小。

【实验例3：测定脂质混合物溶液内根据脂质混合物与三环衍生 物化合物重量份的粒子大小】

为了了解根据脂质混合物溶液内脂质混合物与三环衍生物化合物 的重量份的变化的脂质纳米粒子的大小之差，利用实验例2中使用的 粒子分析仪来测定实施例1及实施例4至实施例9中所制备的脂质纳 米粒子的大小的结果如下表4所示。

表4

 脂质混合物∶化学式1的化合物 粒子大小（nm）  实施例1  3∶1 103.7  实施例4  2∶1 125.4  实施例5  1∶1 142.1  实施例6  4∶1 101.1

 实施例7   6∶1   94.0  实施例8   10∶1   101.1  实施例9   20∶1   93.4

如表4所示，脂质混合物溶液内的脂质纳米粒子的大小为约 90nm-150nm，可知根据上述脂质混合物与三环衍生物化合物的重量 份能够调节脂质纳米粒子的大小。并且，当脂质混合物与化学式1的 化合物的比率小于3：1时，粒子大小则变大，而由于自脂质混合物与 化学式1的化合物的比率大于3：1开始，粒子大小没有任何变化，因 此，可知脂质混合物与化学式1的化合物的最佳比率为3：1。

【实验例4：测定根据脂质混合物溶液内离子脂质的重量份的粒 子大小】

为了了解根据脂质混合物溶液内离子脂质的重量份的变化的脂质 纳米粒子大小之差，利用实验例2中使用的粒子分析仪来测定实施例 1、10、13、14及15中所制备的脂质纳米粒子的大小，其结果如下表 5所示。

表5

  磷脂质∶胆固醇∶离子脂质 粒子大小（nm）   实施例1   7∶3∶1 103.7   实施例10   7∶3∶0 355.5   实施例13   7∶3∶3 159.3   实施例14   7∶3∶5 285.1   实施例15   7∶3∶10 273.9

如表5所示，可知根据脂质混合物溶液内离子脂质的重量份能够 调节脂质纳米粒子的大小。此时，不包含离子脂质的情况下，可知所 测定的粒子大小最大为355.5nm，认为这是由于离子脂质的部件所形 成的脂质纳米粒子之间的再凝聚。并且，包含1重量份-10重量份的 离子脂质时，可知形成103.7nm-273.9nm大小的脂质纳米粒子。

【实验例5：测定根据脂质混合物溶液内的磷脂质重量份的粒子 大小】

为了了解根据脂质混合物溶液内磷脂质的重量份变化的脂质纳米 粒子的大小之差，利用实验例2使用的粒子分析仪来测定了实施例1、 实施例11及实施例16至实施例22中所制备的脂质纳米粒子的大小， 其结果如下表6所示。

表6

  磷脂质∶胆固醇∶离子脂质 粒子大小（nm）   实施例1   7∶3∶1 103.7   实施例11   0∶3∶1 130.6   实施例16   1∶3∶1 123.3   实施例17   3∶3∶1 123.8   实施例18   10∶3∶1 108.9   实施例19   20∶3∶1 127.0   实施例20   30∶3∶1 149.3   实施例21   50∶3∶1 170.9   实施例22   100∶3∶1 220.7

如表6所示，可知根据脂质混合物溶液内磷脂质的重量份能够调 节脂质纳米粒子的大小。此时，不包含磷脂质的情况下，能够确认脂 质纳米粒子由130.6nm的粒子大小形成，当包含1重量份-100重量份 的磷脂质时，形成103.7nm-220.7nm大小的脂质纳米粒子。

【实验例6：测定根据脂质混合物溶液内的胆固醇重量份的粒子 大小】

为了了解根据脂质混合物溶液内的胆固醇的重量份变化的脂质纳 米粒子的大小之差，利用实验例2中使用的粒子分析仪测定了在实施 例1、实施例12及实施例23至实施例27中所制备的脂质纳米粒子的 大小，其结果如下表7所示。

表7

  磷脂质∶胆固醇∶离子脂质 粒子大小（nm）   实施例1   7∶3∶1 103.7   实施例12   7∶0∶1 169.0   实施例23   7∶1∶1 103.8   实施例24   7∶5∶1 118.1

  实施例25   7∶7∶1   133.6   实施例26   7∶10∶1   227.8   实施例27   7∶20∶1   232.1

如表7所示，可知根据脂质混合物溶液内的胆固醇的重量份能够 调节脂质纳米粒子的大小。此时，不包含胆固醇的情况下，可知脂质 纳米粒子由169nm的粒子大小形成，包含1重量份-20重量份的胆固 醇时，可知形成约103.7nm-232.1nm大小的脂质纳米粒子。

由上述实验例4至实施例6的结果可知，磷脂质：胆固醇：离子 脂质的最佳重量份为7：3：1。

【实验例7：评价脂质纳米粒子的稳定性】

冷藏保管上述实施例1中所制备的脂质纳米粒子，并评价稳定性 的结果如下表8所示。

表8

如表8所示，可知24个月冷藏保管固体状态的脂质纳米粒子后， 该脂质纳米粒子呈现维持形状及纯度的稳定性。

【实验例8：确认脂质纳米粒子的结构】

为了确认根据本发明的实施例所制备的脂质纳米粒子的结构，利 用了冷冻蚀刻-透射电子显微镜（Cryo-TEM）。

具体地，图3表示了利用冷冻蚀刻-透射电子显微镜Cryo-TEM(型 号名称：Cryo Tecnai F20G2、制造商：FEI COMPANY）所确认的实 施例1中所制备的脂质纳米粒子的结构的结果；图4表示了比较例1 中制备的不包含三环衍生物化合物的脂质纳米粒子的结构；图5表示 了实施例10中制备的不包含离子脂质的脂质纳米粒子的结构；图6 表示了从实施例10中制备的脂质纳米粒子中游离的三环衍生物化合 物。

如图3至图6所示，对实施例1与比较例1进行比较，确认了不 管有无三环衍生物化合物，脂质纳米粒子的结构均相同。这表示了本 发明的脂质纳米粒子能够稳定地包含三环衍生物化合物。并且，实施 例10中制备的不包含离子脂质的脂质纳米粒子的情况下，稳定性下 降，从而呈现了再凝聚的结构，并且再凝聚的过程中能够确认从脂质 纳米粒子中游离的三环衍生物化合物。