新的土壤微生物、从所述土壤微生物分离的新氧化还原酶、编码所述氧化还原酶的基因和使用所述微生物、氧化还原酶和基因产生糖苷配基的方法

摘要

本发明涉及新的根瘤菌GIN611KCTC11708BP或其细胞提取物，显示糖酵解活性的新氧化还原酶，编码所述氧化还原酶的基因，包括重组载体蛋白的重组菌株，或编码重组蛋白的表达载体，以及使用上述物质作为生物催化剂将天然产物糖酵解的方法。本发明还涉及一种使用上述物质从各种天然产物产生糖苷配基的方法。从本发明新的微生物分离的新氧化还原酶不属于葡糖苷酶类，但属于氧化还原酶类，并具有针对天然产物的糖酵解活性。新的氧化还原酶氧化天然产物糖苷配基中的糖，从而产生各种糖苷配基。

说明书

技术领域

本文内容涉及一种从土壤分离的新的微生物，从所述微生物分离的氧 化还原酶，以及利用上述物质将各种植物糖苷去糖基化并产生各种糖苷配 基的方法。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是一种草药，在亚洲国家包括朝鲜、中 国和日本其通常用于多种疾病的治疗和预防。人参皂苷是人参的主要活性 成分，已知具有多种生理活性，包括在中枢神经系统、心血管系统和免疫 系统中的抗衰老活性、抗炎活性、抗氧化活性、抗糖尿病活性和抗肿瘤活 性。

迄今为止，已经分离并鉴定出超过40种人参皂苷。人参皂苷(其是具有 包括糖苷配基的达玛烷结构的糖苷)大致上可以分为原人参萜二醇和原人参 萜三醇。属于原人参萜二醇类的人参皂苷主要是Rb1、Rb2、Rc和Rd，属于 原人参萜三醇类的人参皂苷主要是Re和Rg1(参见图1和图2)。

吸收后，人参皂苷通过肠道微生物代谢，已知代谢产物具有多种生理 活性。例如，典型的基于原人参萜二醇的皂苷Rb1、Rb2和Rc被人肠道微生 物代谢为CK，基于原人参萜三醇的皂苷Re和Rg1被肠道微生物代谢为Rh1 或F1，进而显示多种生理活性。已知CK诱导预防肿瘤侵袭和形成的抗转移 或抗癌功效。并且，据报道与糖附着的对应物Rh2相比，其糖苷配基PPD(S) 具有更高的生理活性。

因此，已经研究将人参皂苷转化为具有更少糖的代谢物。除了酶促法 之外，已经报道了使用弱酸的水解，使用碱的降解等等。但是，因为这些 方法诱导数种副反应诸如差向异构、水合、羟化等等，所以最近研究了使 用酶、肠道微生物等等转化为活性人参皂苷的方法。但是，大部分报道的 微生物是厌氧肠道微生物，在工业应用中存在限制。此外，因为大部分酶 缺乏将人参皂苷转化为糖苷配基的活性并具有它们自己的特异性，它们只 适用于特定人参皂苷的生产。

尽管到目前为止已对通过肠道微生物将人参皂苷Rb1的代谢物生物转 化为CK进行了大量研究，但对其糖苷配基的产生几乎没有研究。并且，据 报道，在皂苷主链上具有一个糖的人参皂苷不再被微生物的酶所降解。已 知糖苷配基形式的人参皂苷更容易被吸收入血流并作为活性化合物起作 用。此外，作为多种人参皂苷骨架的糖苷配基的产生将为所需人参皂苷类 型的特定生产提供基础技术。因此，需要探索参与人参皂苷糖苷配基产生 的酶。

发明内容

技术问题

本文内容涉及提供一种新的微生物，从所述微生物分离的显示去糖基 化活性的一种新的氧化还原酶和一种使用编码所述氧化还原酶的基因和重 组蛋白产生多种人参皂苷糖苷配基、异黄酮糖苷配基或类黄酮糖苷配基的 方法。

技术方案

在一个一般方面，提供新的根瘤菌(Rhizobium sp.)GIN611(KCTC 11708BP)或其细胞提取物。

在另一个一般方面，提供一种使用根瘤菌GIN611或其细胞提取物作为 生物催化剂将天然产物去糖基化的方法。

在另一个一般方面，提供一种使用根瘤菌GIN611或其细胞提取物作为 生物催化剂从多种糖苷产生糖苷配基的方法。

在另一个一般方面，提供具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶 或包括所述氧化还原酶的细胞提取物。

在另一个一般方面，提供编码具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还 原酶的DNA，具有SEQ ID NO2序列的DNA，包括具有SEQ ID NO2序列的 DNA的重组DNA载体，用包括具有SEQ ID NO2序列的DNA的重组DNA载 体转化的宿主细胞或包括用包括具有SEQ ID NO2序列的DNA的重组DNA 载体转化的宿主细胞的细胞提取物。

在另一个一般方面，提供一种与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序 列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶或包括所述氧化还原酶的细胞 提取物。

在另一个一般方面，提供一种使用生物催化剂将天然产物去糖基化的 方法，所述生物催化剂选自：具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶， 包括具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶的细胞提取物，用包括 DNA(其编码具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶)的重组DNA载 体转化的宿主细胞，包含用包括DNA(其编码具有SEQ ID NO3的氨基酸序 列的氧化还原酶)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，用重组 DNA载体(其包括具有SEQ ID NO2序列的DNA)转化的宿主细胞，用重组 DNA载体(其包括具有SEQ ID NO2序列的DNA)转化的宿主细胞的细胞提 取物，用包括DNA(其编码与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同 性并具有去糖基化活性的蛋白)的重组DNA载体转化的宿主细胞，包括用包 括DNA(其编码与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去 糖基化活性的蛋白)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原 酶，和包括与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基 化活性的氧化还原酶的细胞提取物。

在另一个一般方面，提供一种使用生物催化剂从多种糖苷产生糖苷配 基的方法，所述生物催化剂选自：具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还 原酶，包括具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶的细胞提取物，用 包括DNA(其编码具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶)的重组 DNA载体转化的宿主细胞，包括用包括DNA(其编码具有SEQ ID NO3的氨 基酸序列的氧化还原酶)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，用 重组DNA载体(其包括具有SEQ ID NO2序列的DNA)转化的宿主细胞，用重 组DNA载体(其包括具有SEQ ID NO2序列的DNA)转化的宿主细胞的细胞 提取物，用包括DNA(其编码与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相 同性并具有去糖基化活性的蛋白)的重组DNA载体转化的宿主细胞，包括用 包括DNA(其编码与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有 去糖基化活性的蛋白)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，与 SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧 化还原酶，和包括与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有 去糖基化活性的氧化还原酶的细胞提取物。

在另一个一般情况下，提供一种制备以下物质的方法：根瘤菌GIN611 的细胞提取物，包括具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶的细胞提 取物，包括用包括DNA(其编码具有SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原 酶)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，包括用包括DNA(其具 有SEQ ID NO2的序列)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，或 包括氧化还原酶(其与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具 有去糖基化活性)的细胞提取物，包括通过添加人参皂苷来诱导酶表达。

有益效果

通常，已知人参皂苷去糖基化酶属于葡糖苷酶家族。本发明人发现属 于氧化还原酶家族但不属于葡糖苷酶家族的一种酶对人参皂苷具有去糖基 化活性。这种新的氧化还原酶在序列上完全不同于先前已知的去糖基化酶， 与氧化还原酶家族的酶具有序列相似性，并在天然存在的糖苷中通过氧化 糖来诱导自发的去糖基化。

附图描述

图1显示基于原人参萜二醇(PPD)的人参皂苷。

图2显示基于原人参萜三醇(PPT)的人参皂苷。

图3描述了一种反应，其中通过去糖基化从人参皂苷化合物K(CK)产生 糖苷配基PPD(S)。

图4显示新的氧化还原酶的活性分析结果。星号代表氧化的CK，三角形 代表PPD(S)。色谱图3显示3小时反应的结果，色谱图4显示12小时反应的结 果。底物CK的量随着时间减少，其中间物(氧化的CK)增加然后减少，其终 产物PPD(S)始终随着时间增加。

图5显示图4中分析的氧化CK的质量分析结果。

图6比较在完全培养基和M9/人参皂苷培养基中表达的蛋白的SDS-聚丙 烯酰胺凝胶电泳结果。

图7显示比较从在完全培养基和M9/人参皂苷培养基中培养的细胞获得 的蛋白反应性的结果。

图8显示利用人参皂苷作为碳源生长的新的土壤微生物根瘤菌GIN611 的16S DNA序列。

图9显示由根瘤菌GIN611产生的氧化还原酶的氨基酸序列及编码其的 基因序列。

图10显示新的氧化还原酶的反应机理。

图11显示新的氧化还原酶对于多种人参皂苷和异黄酮的反应性分析结 果。可以看出所述酶对葡萄糖具有特异反应性。

图12显示测量camelliaside A和camelliaside B混合物的去糖基化活性的 结果。

图13显示测量淫羊藿苷去糖基化活性的结果。

最佳方式

本文内容使用的术语是相关领域常用的那些，可以被本领域技术人员 容易地理解。简单描述其中一些术语。

(1)人参皂苷：人参的活性成分。

(2)化合物K(CK):20-O-β-D-吡喃葡糖基-20(S)-原人参萜二醇。

(3)人参皂苷Rh2:3-O-β-D-吡喃葡糖基-20(S)-原人参萜二醇。

(4)人参皂苷F2:3-O-(β-D-吡喃葡糖基)-20-O-(β-D-吡喃葡糖基)-20(S)原 人参萜二醇。

(5)人参皂苷Rb1:3-O-[(β-D-吡喃葡糖基)(1,2)-β-D-吡喃葡糖 基]-20-O-[(β-D-吡喃葡糖基)(1,6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(S)原人参萜二醇。

(6)人参皂苷Rb2:3-O-[(β-D-吡喃葡糖基)(1,2)-β-D-吡喃葡糖 基]-20-O-[(α-L-吡喃阿拉伯糖基)(1,6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(S)原人参萜二醇。

(7)人参皂苷Rc:3-O-[(β-D-吡喃葡糖基)(1,2)-β-D-吡喃葡糖 基]-20-O-[(α-L-阿拉伯呋喃糖基)(1,6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(S)原人参萜二醇。

(8)人参皂苷Rb3:3-O-[(β-D-吡喃葡糖基)(1,2)-β-D-吡喃葡糖 基]-20-O-[(β-D-吡喃木糖基)(1,6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(S)原人参萜二醇。

(9)人参皂苷F1:20-O-β-D-吡喃葡糖基-20(S)-原人参萜二醇。

(10)人参皂苷Re:6-O-[α-L-吡喃鼠李糖基(1,2)-β-D-吡喃葡糖 基]-20-O-(β-D-吡喃葡糖基)-20(S)-原人参萜三醇。

(11)大豆苷:黄苷元7-O-β-D-糖苷。

(12)PPD(S):20(S)-原人参萜二醇。

(13)化合物Y:20-O-[(α-L-吡喃阿拉伯糖基)(1,6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(S) 原人参萜二醇。

(14)化合物Mc:20-O-[(α-L-阿拉伯呋喃糖基)(1,6)-β-D-吡喃葡糖 基]-20(S)原人参萜二醇。

(15)化合物Mx:20-O-[(β-D-吡喃木糖基)(1,6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(S)原 人参萜二醇。

(16)PPT(S):20(S)-原人参萜三醇。

(17)人参皂苷Rg2:6-O-[α-L-吡喃鼠李糖基(1,2)-β-D-吡喃葡糖基]-20(S)- 原人参萜三醇。

(18)黄苷元:7-羟基-3-(4-羟苯基)色烯-4-酮。

(19)淫羊藿苷:3,4',5,7-四羟基-8-异戊烯基黄酮-4'-Me乙醚-3-O-alpha-L- 吡喃鼠李糖苷,7-O-beta-D-吡喃葡糖苷。

(20)Camelliaside A:莰非醇3-O-(2-O-吡喃半乳糖基-6-O-吡喃鼠李糖基) 吡喃葡糖苷。

(21)Camelliaside B:莰非醇3-O-(2-O-吡喃木糖基-6-O-吡喃鼠李糖基) 吡喃葡糖苷。

(22)甘油栓:粘附到糖苷上的糖分子。

(23)全细胞反应：使用全细胞且不破坏细胞或分离酶的反应。

(24)氧化还原酶：催化为生物体提供能量必需的氧化和还原反应的酶。 有机化合物的大部分氧化通过脱氢作用发生。

(25)氧化还原酶提取物：包括通过破坏根瘤菌GIN611的细胞获得的氧 化还原酶或表达所述氧化还原酶的重组蛋白的细胞提取物。

(22)MALDI-TOF质谱：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。

(26)HPLC：高效液相层析。

(27)PCR：聚合酶链式反应；一种特异性扩增DNA区域的技术。

(28)ORF：开放读框；在起始密码子和终止密码子之间的序列。

(29)克隆：一种技术，将DNA片段插入重组DNA克隆载体并使用获得 的重组DNA转化宿主细胞。

(30)bp：碱基对。

本文内容提供新的微生物根瘤菌GIN611或其细胞提取物。本文内容的 发明人已经选择出利用多种人参皂苷的混合物作为碳源生长的微生物并证 实所述微生物具有利用人参皂苷CK作为底物的反应性。

在一个实施方案中，本文内容提供一种使用根瘤菌GIN611或其细胞提 取物作为生物催化剂将天然产物去糖基化的方法。

天然产物可以是人参皂苷糖苷、异黄酮糖苷或类黄酮糖苷，但不限于 此。

在另一个实施方案中，本文内容提供一种使用根瘤菌GIN611或其细胞 提取物作为生物催化剂从糖苷产生各种糖苷配基的方法。

天然产物可以是人参皂苷糖苷、异黄酮糖苷或类黄酮糖苷，但不限于 此。

糖苷配基可以是人参皂苷糖苷配基、异黄酮糖苷配基或类黄酮糖苷配 基，但不限于此。

人参皂苷糖苷不特别限定，但可以选自例如人参皂苷化合物K(CK)、 人参皂苷Rh2、人参皂苷F2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、 人参皂苷Rb3、人参皂苷F1和人参皂苷Re。特别地，其可以是人参皂苷化合 物K(CK)。

人参皂苷糖苷配基不特别限定，但可以选自例如人参皂苷PPD(S)、人 参皂苷化合物Y、人参皂苷Mc、人参皂苷化合物Mx、人参皂苷PPT(S)和人 参皂苷Rg2。特别地，其可以是人参皂苷PPD(S)。

人参皂苷糖苷和人参皂苷糖苷配基概述于表1。

表1

人参皂苷糖苷 人参皂苷糖苷配基 人参皂苷化合物K(CK) 人参皂苷PPD(S) 人参皂苷Rh2 人参皂苷PPD(S) 人参皂苷F2 人参皂苷PPD(S) 人参皂苷Rb1 人参皂苷PPD(S) 人参皂苷Rb2 人参皂苷化合物Y 人参皂苷Rc 人参皂苷Mc 人参皂苷Rb3 人参皂苷化合物Mx 人参皂苷F1 人参皂苷PPT(S)

人参皂苷Re 人参皂苷Rg2

异黄酮糖苷不特别限定，但可以是例如大豆苷。

异黄酮糖苷配基不特别限定，但可以是例如黄苷元。

类黄酮糖苷不特别限定，但可以是例如淫羊藿苷、camelliaside A或 camelliaside B。

通过氧化天然产物糖苷的糖来实现去糖基化。例如，如果所述糖是葡 萄糖，则通过氧化葡萄糖残基的3-羟基(OH)基团自发发生去糖基化。

糖不特别限定，但可以选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木 糖。

在另一个实施方案中，本文内容提供一种包括SEQ ID NO3的氨基酸序 列的氧化还原酶或包括所述氧化还原酶的细胞提取物。特别地，所述氧化 还原酶可以分离自根瘤菌GIN611。

在另一个实施方案中，本文内容提供编码SEQ ID NO3的氨基酸序列的 DNA序列或编码所述氧化还原酶的DNA序列。特别地，所述序列是SEQ ID  NO2。特别地，所述DNA可以是编码分离自根瘤菌GIN611的氧化还原酶的 DNA。

在另一个实施方案中，本文内容提供编码蛋白的DNA，所述蛋白与SEQ  ID NO3的序列具有至少60%、特别地至少90%、更特别地至少97%、此外 更特别地至少99%的序列相同性并具有针对天然产物的去糖基化活性。被所 述蛋白降解的糖可以选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖。

在另一个实施方案中，本文内容提供一种重组DNA载体，其包括编码 SEQ ID NO3的氨基酸序列的DNA序列，编码包括SEQ ID NO3的氨基酸序 列的氧化还原酶的DNA序列或包括SEQ ID NO2的序列的DNA序列。

在另一个实施方案中，本文内容提供用所述重组DNA载体转化的宿主 细胞和包括所述宿主细胞的细胞提取物。

在另一个实施方案中，本文内容提供氧化还原酶和包括所述氧化还原 酶的细胞提取物，所述氧化还原酶与SEQ ID NO3的序列具有至少60%、特 别地至少90%、更特别地至少97%、此外更特别地至少99%的序列相同性并 具有针对天然产物的去糖基化活性。

氧化还原酶不特别限定，但可以来源于土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)， 鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)或狭长平胞属(Stenotrophomonas sp)。

在另一个实施方案中，本文内容提供一种使用生物催化剂将天然产物 去糖基化的方法，所述生物催化剂选自：包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的 氧化还原酶，包含氧化还原酶（其包括SEQ ID NO3的氨基酸序列）的细胞 提取物，用包括DNA（其编码包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶） 的重组DNA载体转化的宿主细胞，包含用包括DNA（其编码包括SEQ ID NO 3的氨基酸序列的氧化还原酶）的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取 物，用包括DNA（其包括SEQ ID NO2的序列）的重组DNA载体转化的宿 主细胞，用包括DNA（其包括SEQ ID NO2的序列）的重组DNA载体转化 的宿主细胞的细胞提取物，用包括DNA（其编码与SEQ ID NO3的序列具有 至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白）的重组DNA载体转化 的宿主细胞，包含用包括DNA（其编码与SEQ ID NO3的序列具有至少60% 的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白）的重组DNA载体转化的宿主细 胞的细胞提取物，与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具有 去糖基化活性的氧化还原酶，以及包括与SEQ ID NO3的序列具有至少60% 的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶的细胞提取物。

在另一个实施方案中，本文内容提供一种使用生物催化剂产生天然产 物的各种糖苷配基的方法，所述生物催化剂选自：包括SEQ ID NO3的氨基 酸序列的氧化还原酶，包含包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶的 细胞提取物，用包括DNA（其编码包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还 原酶）的重组DNA载体转化的宿主细胞，包含用包括DNA（其编码包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原酶）的重组DNA载体转化的宿主细胞的细 胞提取物，用包括DNA（其包括SEQ ID NO2的序列）的重组DNA载体转 化的宿主细胞，用包括DNA（其包括SEQ ID NO2的序列）的重组DNA载 体转化的宿主细胞的细胞提取物，用包括DNA（其编码与SEQ ID NO3的序 列具有至少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白）的重组DNA载 体转化的宿主细胞，包含用包括DNA（其编码与SEQ ID NO3的序列具有至 少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的蛋白）的重组DNA载体转化的 宿主细胞的细胞提取物，与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性 并具有去糖基化活性的氧化还原酶，以及包含与SEQ ID NO3的序列具有至 少60%的序列相同性并具有去糖基化活性的氧化还原酶的细胞提取物。特别 地，所述方法是利用生物催化剂从各种糖苷产生糖苷配基的方法，更特别 地是从人参皂苷糖苷、异黄酮糖苷或类黄酮糖苷产生人参皂苷糖苷配基、 异黄酮糖苷配基或类黄酮糖苷配基的方法。

在另一个实施方案中，本文内容提供一种制备以下物质的方法：根瘤 菌GIN611的细胞提取物，包含包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的氧化还原 酶的细胞提取物，包含用包括DNA(其编码包括SEQ ID NO3的氨基酸序列 的氧化还原酶)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞提取物，包含用包括 DNA(其包括SEQ ID NO2的序列)的重组DNA载体转化的宿主细胞的细胞 提取物，包含用包括DNA(其编码与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序 列相同性并具有去糖基化活性的蛋白)的重组DNA载体转化的宿主细胞的 细胞提取物，或包括与SEQ ID NO3的序列具有至少60%的序列相同性并具 有去糖基化活性的氧化还原酶的细胞提取物，包括通过添加人参皂苷来诱 导酶表达。

选择包括对人参皂苷具有去糖基化活性的酶的微生物

本文内容的发明人已经使用包括人参皂苷混合物作为碳源的基本培养 基，从土壤中选择出包括酶(具有针对人参皂苷CK的活性)的土壤微生物， 如表2所述。表2显示包括人参皂苷混合物作为碳源的基本培养基的组成。

表2

利用基本培养基选择微生物的方法是基于生长速率的简单方法。在培 养期间，具有低去糖基化活性的微生物被自发去除，只剩余包括高活性酶 的微生物。

因此选择的微生物是新的。本发明人基于编码16S rRNA序列的特征性 DNA序列鉴定出其属于根瘤菌属，将其命名为根瘤菌GIN611。在2010年6 月4日将所述微生物(KCTC11708BP)保藏于韩国典型菌种保藏中心 (KCTC)。

使用从选择的根瘤菌GIN611分离出的去糖基化酶的底物特异性研究显 示所述微生物显示对人参皂苷CK的高活性并对其他各种人参皂苷具有去糖 基化活性。本文内容的发明人破坏和离心微生物，从上清产生包括所述活 性酶的细胞提取物。

利用去糖基化酶提取物作为生物催化剂产生人参皂苷糖苷配基

从包括微生物或去糖基化酶提取物和人参皂苷CK的反应溶液产生糖苷 配基PPD(S)。通过向反应溶液中添加所述微生物或酶提取物作为生物催化 剂来起始相关反应。

除了人参皂苷CK之外，基于PPD的人参皂苷如人参皂苷Rb1、人参皂苷 Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷F2和人参皂苷Rh2 可以用作底物。作为基于PPT的人参皂苷，可以使用人参皂苷Re或人参皂苷 F1。此外，可以使用异黄酮大豆苷和类黄酮淫羊藿苷、camelliaside A或 camelliaside B。

下文中，通过实施例进一步详细描述本文内容。实施例只用于说明目 的。本领域普通技术人员将理解其不是试图限制本文内容的范围。

实施例1)根瘤菌GIN611的选择

将土样(10g)添加到磷酸盐缓冲盐水(PBS;50mL)并在室温下搅拌2小 时。将获得的混浊混合物通过滤纸以去除悬浮物。将过滤的微生物溶液(0.2 mL)添加到表2描述的基本培养基(10mL)并在30℃温育3天。在重复该过程3 次后，将培养液(0.2mL)转移到由液体基本培养基和1.5%琼脂组成的固体基 本培养基并在30℃温育24小时。在将各3mL的微生物在液体基本培养基中分 别温育和反应后，对人参皂苷CK显示高活性的菌落被鉴定为根瘤菌属。

实施例2)去糖基化酶提取物的制备

将在培养基(下文中，完全培养基)(由酵母提取物(5g/L)，蛋白胨(10g/L) 和氯化钠(10g/L)组成)中培养的细胞用PBS缓冲液(pH7.0)洗涤3次，去除细 胞以外的培养基组分。将回收的细胞悬浮于5细胞体积等量的缓冲液(下文 中，裂解缓冲液)，所述缓冲液由5细胞体积等量的20mM磷酸盐缓冲液、1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和1mM二硫苏糖醇 (DTT)组成。在使用超声匀浆器破坏细胞、然后在13,000rpm离心30分钟后， 回收上清液，获得去糖基化酶提取物。

实施例3)通过添加人参皂苷诱导去糖基化酶表达

将使用表2所述液体基本培养基(下文中，M9/人参皂苷培养基)培养的细 胞用PBS缓冲液洗涤3次，去除细胞以外的培养基组分。将回收的细胞悬浮 于裂解缓冲液。在使用超声匀浆器破坏细胞、然后在13,000rpm离心30分钟 后，回收上清液，获得包括去糖基化酶(其在基本培养基中被诱导表达)的细 胞提取物。

实施例4)在完全培养基和M9/人参皂苷培养基中制备的蛋白的反应性和表达水平的比较

将实施例2和实施例3中制备的细胞提取物的蛋白定量后，使用相同量 的蛋白比较对于人参皂苷CK的反应性。结果显示，实施例3制备的细胞提取 物比实施例2制备的细胞提取物显示更高的反应性(见图7)。使用相同量的蛋 白反应后，根据每单位蛋白量比较活性。尽管当使用500或更多的蛋白时从 完全培养基培养的细胞获得的蛋白(实施例2)造成人参皂苷CK到PPD(S)的 完全转化，但是当使用100或更多的蛋白时，从M9/人参皂苷培养基培养的 细胞获得的蛋白造成人参皂苷CK到PPD(S)的转化。此外，通过十二烷基硫 酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)比较两种提取物中蛋白的表达水平。 结果显示于图6。在图6中，箭头指示在实施例2和实施例3的酶提取物中其 表达水平不同的蛋白。

实施例5)去糖基化酶的分离和纯化

为了从新的根瘤菌GIN611分离催化图3所示反应的酶，在添加人参皂苷 (10L)后在表2所述的液体基本培养基中培养微生物。然后，按照实施例2所 述的相同方式从培养的微生物制备酶提取物。将制备的酶提取物用于 60-70%饱和硫酸铵分级分离。然后使用数根柱通过快速蛋白液相层析(FPLC) 将获得的蛋白进行分离和纯化。通过天然凝胶电泳研究纯化蛋白的反应性。

实施例6)纯化酶对人参皂苷CK的活性

研究了实施例5中纯化的酶对人参皂苷CK的活性。使用约100μg酶溶 液、0.1mM CK和50mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)并添加与该溶液相同体积的醋 酸乙酯进行反应。在反应完成后，通过使用80%乙腈(ACN)的等度洗脱进行 HPLC分析。结果显示于图4。在图中，三角形指示的峰是PPD(S)的，星号 指示的峰是氧化的CK的。可以看到氧化的CK的量增加，然后随时间减少， 而PPD(S)的量始终增加。这表明通过人参皂苷CK的氧化，新的酶降解糖。 反应机理显示于图10。

实施例7)新的酶的N端和内部肽序列的确定

在进行12%SDS-PAGE电泳、将片段转移到PVDF膜(Bio-Rad)后，利用 Edman分析技术，使用Procise491测序仪(Applied Biosystems,CA)通过 Edman测序确定实施例5中纯化的氧化还原酶的N端氨基酸序列。使用 LTQ-Orbitrap质谱分析仪在分析经用于测序的胰蛋白酶(Promega)处理获得 的肽片段的序列后，使用PEAKS软件确定内部肽的序列。

实施例8)从根瘤菌GIN611分离总DNA

将在完全培养基中培养的细胞在4℃和4,000rpm离心10分钟并沉淀。在 去除上清液后，将剩余细胞在10mL裂解缓冲液(15%蔗糖，25mM EDTA， 25mM Tris缓冲液)中裂解并在添加1.2mL EDTA(0.5M)和0.13mL Pronase后 在37℃静置10分钟。然后，在添加10%SDS(1mL)后，将混合物在70℃放 置10分钟，然后在冰水中放置10分钟。随后，在添加5M醋酸钾(2.5mL)后 在冰水中进行反应15分钟。向反应溶液添加相同体积的苯酚/氯仿混合物(50: 50)并混合30分钟后，在4℃和4,000rpm进行离心10分钟，获得上清液。向 所得溶液添加0.5体积等量的氯仿并缓慢混合后，在4℃和4,000rpm进行离心 10分钟并获得上清液。然后，用直至50/mL的RNase处理、继之以37℃温育1 小时后，添加0.8体积等量的异丙醇，然后添加2.5体积等量的80%乙醇。在 温和振荡后，使用Pasteur移液管收集总DNA，转移到1.5mL微管，干燥，然 后溶于无菌水用于进一步使用。

实施例9)通过PCR对去糖基化酶的基因测序

使用实施例7确定的N端氨基酸序列和内部序列制备引物后，使用实施 例8获得的基因组DNA作为模板获得氧化还原酶的DNA片段。制备与所获 DNA片段特异性结合的引物并通过反向PCR确定剩余序列。利用Hind III限 制性酶通过切割基因组DNA片段然后用连接酶处理获得的自连接DNA被用 作反向PCR的模板。

实施例10)转化的大肠杆菌中的重组表达载体和表达

利用BamHI/SalI限制性酶将所获氧化还原酶的DNA序列消化，将得到 的片段连接入pETDuet-1(Novagen)以制备重组质粒，然后其被转化大肠杆 菌以表达(Rosetta-gami2;DE3)。在含氨苄青霉素的培养基中培养转化的大肠 杆菌。当光密度达到0.3-0.7时，添加IPTG，通过在20℃进一步温育15小时 诱导酶的表达。

实施例11)与SEQ ID NO3的新酶具有至少65%序列相似性的3种酶对源于天然产物的人参皂苷和糖苷的去糖基化反应性

将来源于土壤杆菌属、鞘氨醇杆菌属或狭长平胞属并与SEQ ID NO3具 有至少60%氨基酸序列相似性的酶克隆，研究它们对人参皂苷的葡萄糖的去 糖基化反应性。来源于所述微生物的酶被证实通过氧化降解人参皂苷的葡 萄糖残基。

实施例12)使用表达诱导的酶测量糖苷配基产生活性

在按照实施例2描述的方法制备酶(其表达在实施例11中被诱导)后，使 用人参皂苷CK作为底物测量糖苷配基产生活性。

实施例13)使用各种人参皂苷和异黄酮作为底物测量活性

在使用人参皂苷Rh2、人参皂苷F2、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人 参皂苷Rc、人参皂苷Rb3、人参皂苷F1、人参皂苷Re或异黄酮大豆苷作为 底物进行反应、然后通过添加相同体积的醋酸乙酯进行提取后，干燥醋酸 乙酯层，然后再次溶于乙醇，其被用于通过MALDI质谱的活性测量。

实施例14)测量对不同糖苷配基结构的去糖基化活性和对甘油栓底物的特异性

来源于根瘤菌GIN611的氧化还原酶(其表达被诱导)以如上述方式与作 为底物的类黄酮淫羊藿苷、camelliaside A或camelliaside B反应并通过 MALDI质谱来测量活性。鉴定附着到camelliaside A的半乳糖的氧化及其去 糖基化活性。还鉴定附着到camelliaside B的木糖的氧化及其去糖基化活性。 即，证实酶显示对附着到基于类黄酮的糖苷配基的糖的去糖基化活性并且 通过氧化它们不仅能够降解葡萄糖而且能够降解半乳糖和木糖(参见图12和 13)。

实施例15)对甘油栓结合的底物特异性

利用4-硝基苯基α-D-吡喃葡糖苷、4-硝基苯基β-D-吡喃葡糖苷、4-硝 基苯基α-D-吡喃半乳糖苷和p-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷研究了酶对α-键 合和β-键合的特异性。酶显示针对α-键合和β-键合二者的活性(参见表3)。

表3

底物 相对活性(%) p-硝基苯基α-D-吡喃葡糖苷 103 p-硝基苯基β-D-吡喃葡糖苷 100 p-硝基苯基α-D-吡喃半乳糖苷 201 p-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷 400

[登录号]

KCTC11708BP

国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约

国际表格

原始保藏的接受

按照细则7.1

致：KIM,Byung-Gee

Seoul National University

599Gwanak-ko，Gwanak-gu，Seoul151-742

Republic of Korea

表格BP/4b（KCTC表格17）

新的土壤微生物、从所述土壤微生物分离的新氧化还原酶、编码所述氧化还原酶的基因 和使用所述微生物、氧化还原酶和基因产生糖苷配基的方法

<130>OF11P234/PCT

<150>KR10/055988

<151>2010-06-14

<150>KR10/066307

<151>2010-07-09

<160>3

<170>KopatentIn1.71

<210>1

<211>971

<212>DNA

<213>根瘤菌GIN611

<400>1

gaatgcgagc ttaccatgca gtcgagcgcc ccgcaagggg agcggcagac gggtgagtaa60

cgcgtgggaa tctaccgagc cctgcggaat agctccggga aactggaatt aataccgcat120

acgccctacg ggggaaagat ttatcggggt ttgatgagcc cgcgttggat tagctagttg180

gtggggtaaa ggcctaccaa ggcgacgatc catagctggt ctgagaggat gatcagccac240

attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa300

tgggcgcaag cctgatccag ccatgccgcg tgagtgatga aggccctagg gttgtaaagc360

tctttcaacg gtgaagataa tgacggtaac cgtagaagaa gccccggcta acttcgtgcc420

agcagccgcg gtaatacgaa gggggctagc gttgttcgga attactgggc gtaaagcgca480

cgtaggcgga tatttaagtc aggggtgaaa tcccggggct caacctcgga actgcctttg540

atactgggta tcttgagtat ggaagaggta agtggaattg cgagtgtaga ggtgaaattc600

gtagatattc gcaggaacac cagtggcgaa ggcggcttac tggtccatta ctgacgctga660

ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga720

tgaatgttag ccgtcgggca gtatactgtt cggtggcgca gctaacgcat taaacattcc780

gcctggggag tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc840

ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgcagaacc ttaccagctc ttgacattcg900

gggtatgggc agtggagaca ttgtccttca gttaggctgg ccccagaaca ggtgctgcat960

ggctgtcgtc a971

<210>2

<211>1686

<212>DNA

<213>根瘤菌GIN611

<400>2

atggcgaata atcattacga cgcgattgtt gtcggttcgg ggatcagcgg aggctgggcc60

gcaaaagaac tcacacaaaa gggtctaaaa gttcttcttc ttgaacgtgg cagaaacatt120

gaacacatca ccgattacca gaatgcagac aaggaagcgt gggactaccc tcaccgcaat180

cgtgccacgc aggaaatgaa ggcaaagtat ccggttctga gccgcgatta tctgttggaa240

gaagccacac tcggcatgtg ggctgacgaa caagaaacgc cttacgtcga agaaaaacgt300

ttcgattggt tccgtgggta ccacgtgggt ggtcgttctc tcctttgggg ccgtcaaacc360

tatcgatggt cacagaccga ttttgaggcc aatgcaaaag aaggcatcgc tgttgattgg420

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tccggcagca aagaagggct cgatatcctt cctgatggtg aattccttcc accaatccct540

ttgaactgcg tagaagaaga tgtggcgcgt cgtctgaagg acaggttcaa gggcacgcgt600

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cgctgtcagt tcagaaacaa gtgtcggttg ggctgtccgt tcggcggtta cttcagcaca720

caatcatcaa ccctgcctgc ggccgtcgcg accggcaatc tcaccctgcg gccgttctca780

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gatgccgaaa ccaacatgac ctatgaatat accgcagaca ttatcttcct gaatgcctca900

acgctgaatt cgacctgggt cctgatgaac tcagccaccg acgtgtggga agggggattg960

ggaagcagtt ccggcgaact cggccacaat gtcatggacc atcatttccg catgggtgcg1020

acgggtgagg tcgaaggatt tgacgagttc tatttcaagg gacgccgccc ggcaggtttc1080

tacattcctc gcttccgcaa catcggcgat gaaaagcgta aatatctgcg tggttttggt1140

tatcagggtt cggcaagccg ctcccgctgg gagcgcgaaa tcgccgagat gaatattgga1200

gcagattata aagacgcgtt gaccgaacca ggcggctgga caatcggcat gacagccttt1260

ggcgagatgc tgccctacca cgaaaatcgc gtgaagcttg accaaaacaa aaaggacaaa1320

tgggggttgc cggtcctttc aatgaatgtc gagttgaaac aaaacgaact cgatatgcgt1380

gaagacatgg tgaatgacgc tgtcgaaatg tttgaggccg tcggcatcaa gaacgtcaaa1440

ccgacccgag gcagctacgc acccggtatg ggtattcacg aaatgggaac ggcgcgcatg1500

ggccgcgatc caaagtcttc ggttctaaat ggcaacaacc aggtgtggga tgcccctaac1560

gtgttcgtga cggatggtgc ctgcatgacg tctgctgcct gtgtaaatcc gtctctcacc1620

tacatggcac tgacggcacg tgccgccgat tttgccgtgt cagagctcaa gaagggaaat1680

ctgtaa1686

<210>3

<211>561

<212>PRT

<213>根瘤菌GIN611

<400>3

Met Ala Asn Asn His Tyr Asp Ala Ile Val Val Gly Ser Gly Ile Ser Gly Gly

1                5                  10                   15

Trp Ala Ala Lys Glu Leu Thr Gln Lys Gly Leu Lys Val Leu Leu Leu Glu Arg

     20                  25                  30                  35

Gly Arg Asn Ile Glu His Ile Thr Asp Tyr Gln Asn Ala Asp Lys Glu Ala Trp

             40                  45                  50

Asp Tyr Pro His Arg Asn Arg Ala Thr Gln Glu Met Lys Ala Lys Tyr Pro Val

55                   60                  65                  70

Leu Ser Arg Asp Tyr Leu Leu Glu Glu Ala Thr Leu Gly Met Trp Ala Asp Glu

         75                  80                  85                  90

Gln Glu Thr Pro Tyr Val Glu Glu Lys Arg Phe Asp Trp Phe Arg Gly Tyr His

                 95                 100                 105

Val Gly Gly Arg Ser Leu Leu Trp Gly Arg Gln Thr Tyr Arg Trp Ser Gln Thr

     110                 115                 120                 125

Asp Phe Glu Ala Asn Ala Lys Glu Gly Ile Ala Val Asp Trp Pro Ile Arg Tyr

             130                 135                 140

Gln Asp Val Ala Pro Trp Tyr Asp Tyr Val Glu Arg Phe Ala Gly Ile Ser Gly

145                  150                 155                 160

Ser Lys Glu Gly Leu Asp Ile Leu Pro Asp Gly Glu Phe Leu Pro Pro Ile Pro

        165                 170                 175                 180

Leu Asn Cys Val Glu Glu Asp Val Ala Arg Arg Leu Lys Asp Arg Phe Lys Gly

                185                 190                 195

Thr Arg His Leu Ile Asn Ser Arg Cys Ala Asn Ile Thr Gln Glu Leu Pro Asp

    200                 205                 210                 215

Gln Asp Arg Thr Arg Cys Gln Phe Arg Asn Lys Cys Arg Leu Gly Cys Pro Phe

            220                 225                 230

Gly Gly Tyr Phe Ser Thr Gln Ser Ser Thr Leu Pro Ala Ala Val Ala Thr Gly

235                 240                 245                 250

Asn Leu Thr Leu Arg Pro Phe Ser Ile Val Lys Glu Ile Leu Tyr Asp Lys Asp

        255                 260                 265                 270

Lys Lys Lys Ala Arg Gly Val Glu Ile Ile Asp Ala Glu Thr Asn Met Thr Tyr

                275                 280                 285

Glu Tyr Thr Ala Asp Ile Ile Phe Leu Asn Ala Ser Thr Leu Asn Ser Thr Trp

    290                 295                 300                 305

Val Leu Met Asn Ser Ala Thr Asp Val Trp Glu Gly Gly Leu Gly Ser Ser Ser

            310                 315                 320

Gly Glu Leu Gly His Asn Val Met Asp His His Phe Arg Met Gly Ala Thr Gly

325                 330                 335                 340

Glu Val Glu Gly Phe Asp Glu Phe Tyr Phe Lys Gly Arg Arg Pro Ala Gly Phe

        345                 350                 355                 360

Tyr Ile Pro Arg Phe Arg Asn Ile Gly Asp Glu Lys Arg Lys Tyr Leu Arg Gly

                365                 370                 375

Phe Gly Tyr Gln Gly Ser Ala Ser Arg Ser Arg Trp Glu Arg Glu Ile Ala Glu

    380                 385                 390                 395

Met Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Lys Asp Ala Leu Thr Glu Pro Gly Gly Trp Thr

            400                 405                 410

Ile Gly Met Thr Ala Phe Gly Glu Met Leu Pro Tyr His Glu Asn Arg Val Lys

415                 420                 425                 430

Leu Asp Gln Asn Lys Lys Asp Lys Trp Gly Leu Pro Val Leu Ser Met Asn Val

        435                 440                 445                 450

Glu Leu Lys Gln Asn Glu Leu Asp Met Arg Glu Asp Met Val Asn Asp Ala Val

                455                 460                 465

Glu Met Phe Glu Ala Val Gly Ile Lys Asn Val Lys Pro Thr Arg Gly Ser Tyr

    470                 475                 480                 485

Ala Pro Gly Met Gly Ile His Glu Met Gly Thr Ala Arg Met Gly Arg Asp Pro

            490                 495                 500

Lys Ser Ser Val Leu Asn Gly Asn Asn Gln Val Trp Asp Ala Pro Asn Val Phe

505                 510                 515                 520

Val Thr Asp Gly Ala Cys Met Thr Ser Ala Ala Cys Val Asn Pro Ser Leu Thr

        525                 530                 535                 540

Tyr Met Ala Leu Thr Ala Arg Ala Ala Asp Phe Ala Val Ser Glu Leu Lys Lys

                545                 550                 555

Gly Asn Leu

    560