一种中华绒螯蟹三倍体诱导新方法

摘要

本发明涉及一种中华绒螯蟹三倍体诱导新方法，所述方法的步骤如下：亲蟹的海水驯化、亲蟹标记、基于形态学标记的药物诱导起始时刻的确定、KCl诱导最优参数的确定及应用及药物渗透性增加措施。本发明通过限定海水驯化时间、亲蟹标记、基于形态学标记的药物诱导起始时刻的确定及药物渗透性增加措施等步骤，明显提高了中华绒螯蟹三倍体诱导的稳定性和有效性，为中华绒螯蟹三倍体苗种规模化培育提供了技术支持。

说明书

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，具体涉及一种中华绒螯蟹三倍体诱导新方法。

背景技术

中华绒螯蟹（俗称河蟹、大闸蟹）养殖业是我国水产行业的支柱性产业之一，但目前其发展遭遇了商品蟹小型化及性早熟等问题的严重困扰。作为品质改良的重要途径之一，多倍体培育已在多种鱼类、贝类中成功开展，某些种类已经达到商业化生产规模。基于三倍体动物在生长发育方面的优势以及特殊的性腺发育特点，三倍体蟹的苗种培育有望解决目前河蟹性早熟、生长慢、商品蟹规格偏小等难题，从而培育大规格的河蟹，提高养殖产量和效益。国内发明专利“一种中华绒螯蟹三倍体的诱导方法”（授权号CN 1141018C）公开了一种利用细胞松弛素B、热休克及6-DMAP诱导河蟹多倍体的方法，国内实用新型专利“一种稳定提高中华绒螯蟹多倍体诱导效率的便利设施”（申请号201320014475.7）设计了一种利用亲蟹单只隔离提高抱卵量及视频监控确定产卵时间的河蟹多倍体苗种规模化培育便利设施。但是，由于中华绒螯蟹具有的抱卵习性限制了药物的渗透性及产卵时间的准确判断，三倍体的诱导依然存在稳定性差、整体诱导率偏低等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够明显提高三倍体诱导的稳定性和有效性的中华绒螯蟹三倍体诱导新方法。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是，一种中华绒螯蟹三倍体诱导新方法，所述方法具体如下：

（1）亲蟹的海水驯化：将亲蟹生活的盐度从0提高到18‰，并在此盐度驯化后开始交配产卵；

（2）亲蟹标记：将有编码的塑料标签绑缚在雌蟹上，以标记区分亲蟹个体；

（3）基于形态学标记的药物诱导起始时刻的确定：将受精膜举起作为诱导起始时刻的形态学标记；

（4）KCl诱导最优参数的确定及应用：通过实验确定KCl诱导中华绒螯蟹三倍体的有效浓度及处理持续时间并加以应用；

（5）药物渗透性增加措施：增加药物与受精卵接触面积，以利于诱导药物的渗透。

其中，所述步骤（1）的亲蟹的海水驯化过程中，亲蟹培养盐度的提高过程应缓慢有序，在一天时间内分4-5次将盐度从0逐渐提高到18‰并维持。具体方法为通过向亲蟹培育水体（盐度为0）中添加自然海水（盐度30‰左右）实现盐度的逐渐升高，随时用盐度计或比重计测量水体盐度或比重以控制盐度升高进程。

其中，所述咸淡水驯化过程为4~5天。

其中，所述步骤（2）亲蟹的标记方法是将连续编码的塑料标签两端打孔，用细扎带绑缚在雌蟹第3或4步足长节上。塑料标签的长度及宽度应尽可能小，以不妨碍亲蟹活动为宜。塑料标签上的数字编码以烫印印刷为好，可避免磨损等引起的辨认困难。

其中，所述步骤（3）基于形态学标记的药物诱导起始时刻的确定是将受精膜举起作为诱导起始时刻的形态学标记，当观察到80%以上受精卵开始举起受精膜时将亲蟹转移到三倍体诱导药物中，开始中华绒螯蟹三倍体的诱导处理。

其中，所述步骤（4）KCl诱导最优参数的确定及应用是通过一系列的对比实验确定KCl诱导中华绒螯蟹三倍体的有效浓度及处理持续时间并加以应用；其中KCl诱导的适宜浓度为0.6%，处理持续时间为4h，处理温度为15-16℃，KCl处理液用18‰的咸淡水配制。

其中，所述步骤（5）药物渗透性增加措施是通过模拟自然状态下亲蟹摆动腹甲为胚胎保持供氧的方式增加药物与受精卵接触面积和药物渗透性，以晾衣夹撑开抱卵蟹腹甲以增大受精卵与药物接触面，并每隔10-20min用手撑开亲蟹腹甲在诱导液中轻轻摆动以利于诱导药物的渗透。

本发明针对中华绒螯蟹苗种人工培育过程中的盐度转变、亲蟹抱卵的特殊繁殖生物学特性以及批量诱导过程中亲蟹的区分困难等问题，对于影响KCl诱导中华绒螯蟹三倍体诱导稳定性和总体诱导率的限制性因素做了相应的应对处理。海水驯化是亲蟹从淡水到半咸水的适应过程；亲蟹标记是利用数字编码的塑料标签来标记区分亲蟹个体；基于形态学标记的药物诱导起始时刻的确定是利用受精膜举起作为诱导处理起始时刻的形态学标记；KCl诱导最优参数的确定及应用是基于对比实验结果的三倍体诱导处理强度及持续时间的确定和应用；药物渗透性增加措施是通过模拟自然状态下亲蟹摆动腹甲为胚胎保持供氧的方式增加药物与受精卵接触面积。

亲蟹的咸淡水驯化过程以4~5天为宜，过短或过长的驯化时间不利于中华绒螯蟹三倍体的诱导，这是因为亲蟹对KCl的最高耐受浓度及三倍体诱导有效浓度均随驯化时间延长而提高，但最高耐受浓度在0.6%~0.7%，而最低诱导浓度也为0.6%左右，驯化4~5天时会取得一个较好的平衡，既能保证诱导效率还不会导致亲蟹死亡；驯化时间过短或过长均会导致三倍体诱导所需KCl有效浓度高于亲蟹耐受范围，从而导致亲蟹死亡。

现有的蟹类标记方法如阳澄湖大闸蟹的蟹戒指只能实现一类个体的标记，而无专门的个体标记方法，对亲蟹个体单只进行标记可便于以后的跟踪检测，本标记方法具有简单易行、价格低廉、且标记保存完整率高，主要是连续数字编码的标记可以实现对大量个体的标记，在需要个体标记的场合，如本实验或育种过程中的亲本标记等就十分必要。

本发明的主要特点有：

1、对亲蟹驯化时间的限定较好地解决了三倍体诱导有效浓度与亲蟹对诱导药物耐受力之间的矛盾；

2、亲蟹标记用塑料标签制作简单，连续编码的塑料标签可满足大批量标记的需求，单足标记的保存完整率超过95%，回收标记可辨认率为100%；本发明所用的标记方法可满足其它成蟹类或其它方面单独标记成蟹的应用需求，而且该标记方法也是本发明所独有的；

3、以受精膜的举起作为三倍体诱导起始时刻的形态学标记具有简单易操作的优点，可以避免因抱卵习性、受精卵发育温度、盐度或遗传背景不同导致的三倍体诱导起始时刻难以把握的问题。现有技术主要靠经验值或预实验确定，比如通常是在某一温度范围下产卵多少小时作为起始时刻，但水产动物的胚胎发育速度与水温、盐度及遗传背景等关系密切，其可操作性不强，本发明则能够准确地确定三倍体诱导起始时刻，从而大大增加诱导的成功率和有效性；

4、诱导药物KCl具有高效、无毒，是绿色环保的诱导剂，且价格低廉便于推广。现有的诱导所用药物通常对环境及生物有较强的生物毒性，可对人体致癌，且均为进口药物，价格较贵，其所用的热休克方法对亲蟹成活率影响较大，不适于大规模推广。本发明采用新的诱导药物KCl，对生物及环境无害，是绿色环保的诱导药物，且价格低廉，便于推广使用；

5、通过模拟自然状态下亲蟹扇动腹甲为胚胎保持供氧的方式增加药物与受精卵接触面积和药物渗透性，可以尽最大程度地减小外加助渗剂对胚胎或亲蟹的潜在危害，同时该方法简单易行便于推广；

6、通过以上几个步骤，KCl诱导中华绒螯蟹三倍体的稳定性及总体诱导率可达到70%和50%以上。

综上所述，本发明是一种能够明显提高三倍体诱导的稳定性和有效性的中华绒螯蟹三倍体诱导方法，为中华绒螯蟹三倍体苗种规模化培育提供了技术支持。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

实施例1，中华绒螯蟹三倍体批量诱导

本实施例按照以下步骤进行：

（1）亲蟹暂养：2012年11月3日，购进附肢齐全、活力旺盛、性腺发育良好的雌、雄蟹各200只，雌雄分开放养于2个盛有淡水且底部铺沙的水泥池（10.5×3.5×1.2m）中暂养7d，每天投喂新鲜蛤肉，视水质情况适当换水；

（2）分批驯化：每次挑选雌、雄蟹各50只，雌雄分开放养于2个底部铺沙的室内水泥池（3.5×1.5×1.2m）中，在1天时间内分4次将盐度从0升高到18‰，并保持此盐度3~4天，每天投喂新鲜蛤肉，视水质情况适当换水；

（3）亲蟹标记及交配：亲蟹驯化第5d时，将雌雄蟹捞出，在雌蟹第3或4步足基部长节上用细扎带绑缚带数字编码的塑料标签，放入已经被授予专利权的申请号为201320014475.7的“一种稳定提高中华绒螯蟹多倍体诱导效率的便利设施”中并启动该设施，每个交配产卵小室放雌雄蟹各1只，待自然交配完成、雌雄蟹分开后及时移走雄蟹，留下雌蟹待产；

（4）亲蟹产卵及三倍体诱导：在发现某只亲蟹产卵后回放视频录像以确定大概的产卵时间，15℃下产卵1.5h左右剪取少量受精卵在显微镜下进行形态学观察，一旦发现超过80%以上卵的受精膜开始举起则开始三倍体的诱导，用晾衣夹（竹夹子）撑开抱卵蟹腹甲并移到0.6%的KCl诱导液（用18‰海水配制）中，用手撑开抱卵蟹腹甲中并轻轻摆动，以后每隔10-20min撑开抱卵蟹腹甲并轻轻摆动一次，以增加KCl与受精卵的接触面积以及KCl对受精卵的渗透，15℃~16℃下处理4h后取出，再次用手撑开抱卵蟹腹甲中并在不含诱导液的育苗水（盐度18‰）中轻轻摆动以尽快解除KCl的作用；

（5）亲蟹越冬：处理完毕的亲蟹放到正常育苗水中集中暂养，等积累较多的处理亲蟹时记录各亲蟹标签上的数字编号并将其转移到室外土池低温越冬，水温高于5℃时每天投喂适量新鲜蛤肉，当水温低于5℃时停止投喂，实验共处理抱卵蟹150只，除2只在暂养期间死亡外其余148只均移到室外土池越冬；

（6）亲蟹回捕：2013年3月25日，排干越冬土池的水，共回捕带标记亲蟹139只，标记丢失（第3或4步足缺失）亲蟹3只，失踪亲蟹6只，标记完好率为97.89%，标记可分辨率为100%；

（7）胚胎三倍体率检测：剪取少量胚胎带回实验室用流式细胞仪检测胚胎的倍性组成，三倍体率最高为77.6%，最低为0%，总体诱导率为53.46%。

（8）受精卵孵化：选取诱导率最高的抱卵蟹进行单独孵化，Ⅰ期溞状幼体的三倍体率为73.3%。

本发明通过限定海水驯化时间、亲蟹标记、基于形态学标记的药物诱导起始时刻的确定及药物渗透性增加措施等步骤，明显提高了中华绒螯蟹三倍体诱导的稳定性和有效性，为中华绒螯蟹三倍体苗种规模化培育提供了技术支持。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。