南方松树丛芽诱导及继代培养方法

摘要

本发明公开了一种南方松树丛芽诱导及继代培养方法，选择带0.5cm长下胚轴无菌苗顶芽为外植体，采用改良MS培养基+6-BA2.5-4.0mg·L

说明书

技术领域

本发明属植物繁殖技术领域，涉及组织培养育苗技术，尤其是一种南方松树丛芽诱导及继代培养方法。

背景技术

作为一种综合利用价值高、推广前景广阔的树种，松树不仅可用来生产三板、造纸及化纤工业制造，还可用来生产松香、松节油等工业原料。近年来，随着人们日益增长的生活需求与木材资源短缺及石油等不可再生资源逐渐枯竭等间矛盾的激化，生态、经济和社会的可持续发展越来越受到社会关注。基于我国生态安生、资源安全与社会安全等问题，松树作为我国主要的工业用材树种和生物质能源树种，大力发展松树人工林很有必要。

我国自从“六五”国家科技攻关以来，在松树良种选育和速生丰产栽培技术等方面取得了较大突破。其中，乡土马尾松（Pinus massonianan）及引进的湿地松（P.Elliottii）、火炬松（P.taedai）、加勒比松（P.caribaea）、湿加松（P.Elliottii×P.caribaea）等为我国南方的主要造林松属树种。现代林业发展讲究速生丰产、优质高效，欲达到预期目标，最有效的途径是实现优良无性系苗木造林。植物组培技术的使用，是实现松树优良无性系苗木快速繁育的有效途径。

目前，松树组织培养较难，诱导产生的芽不易分化伸长，且增殖系数低、继代周期长，规模化生产的继代芽苗活力偏低、质量较差，进而严重影响到后期单芽生根力。

发明内容

本发明的目的是针对现有松树组织培养较难，诱导丛芽不易分化伸长，增殖系数低，继代周期长，继代芽苗活力偏低、质量较差的技术问题，提供一种适于我国南方松树丛芽诱导及继代培养的方法。

本发明是这样实现的：

一种南方松树丛芽诱导及继代培养方法，包括外植体选择与处理、丛生芽诱导、丛生芽伸长、继代芽培养，获得规模化组织培养南方松树继代芽，其操作步骤如下：

（1）外植体选择与处理

将松树种子消毒后，在无菌条件下进行种子萌发，然后截取带0.5 cm长下胚轴的无菌苗顶芽为外植体进行组织培养；

（2）丛生芽诱导

将无菌外植体接种在诱导培养基中进行丛芽诱导，培养周期：20-26 d，培养温度：24±1℃，光照培养时间：0-16 h，光照强度：0-2000 lx，获得丛生芽；

（3）丛生芽伸长

将诱导出的丛生芽在伸长培养基中进行伸长培养，培养周期：14-28 d，培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：1500-2000 lx，获得丛生伸长芽；

（4）继代芽培养

将单个切下伸长芽的顶芽接种到继代增殖培养基中进行增殖，培养周期：14-21 d，培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：1500-2000 lx，获得继代芽Ⅰ；将继代芽Ⅰ重复步骤（3）进行伸长，单个切下伸长的继代芽Ⅰ并分成顶芽和带侧芽芽段，然后在步骤（4）继代增殖培养基中继续增殖获得继代芽Ⅱ，将继代芽Ⅱ再重复步骤（3）和步骤（4），获得新的增殖继代芽；重复循环步骤（3）和（4），从而实现规模化增殖继代组培南方松树继代芽。

以上所述的继代芽Ⅰ是选用单个切下无水渍样、无玻璃化现象、生长活力旺盛的丛生伸长芽的2 cm长顶芽进行增殖而得。

以上所述的继代芽Ⅱ是选用继代增殖芽继代芽Ⅰ进行伸长至3-5 cm，并分成2 cm长顶芽及1 cm长带侧芽芽段进行继代增殖而得。

以上所述的继代芽培养是重复循环继代芽增殖、丛生芽伸长过程，进行N次培养。

以上所述的诱导培养基为：改良MS培养基+6-BA 2.5-4.0 mg·L^-1+NAA 0.05-0.1 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1+水解酪蛋白500 mg·L^-1，pH值为5.6-6.0。

以上所述的伸长培养基为：改良MS培养基+NAA 0.25-0.4 mg·L^-1或活性炭3000-5000 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1，pH值为5.6-6.0。

以上所述的继代增殖培养基为：改良MS培养基+6-BA 1.0-3.0 mg·L^-1+KT 0-1.0 mg·L^-1+NAA 0-0.3 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1，pH值为5.6-6.0。

以上所述的改良MS培养基的基本组成为：KNO₃ 1650 mg·L^-1；NH₄NO₃ 600 mg·L^-1；CaCl₂·2H₂O 260 mg·L^-1；MgSO₄·7H₂O 370 mg·L^-1；Ca(NO₃)₂·4H₂O 400 mg·L^-1；KH₂PO₄ 170 mg·L^-1；MnSO₄·H₂O 22.3 mg·L^-1；ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg·L^-1；CuSO₄·5H₂O 0.025 mg·L^-1；H₃BO₃  6.2 mg·L^-1；Na₂MoO₄·2H₂O 0.025 mg·L^-1；KI 0.83 mg·L^-1；CoCl₂·6H₂O 0.025 mg·L^-1；维生素B₁ 1.0 mg·L^-1；维生素B₆ 0.5 mg·L^-1；烟酸 0.5 mg·L^-1；甘氨酸 2.0 mg·L^-1；肌醇 200 mg·L^-1。

本发明相对于现有的技术具有以下优点：

1、本发明采用优化不同配比培养基及培养方式，丛芽诱导率达97%以上，芽苗伸长快、活力旺盛。

2、本发明的继代培养是通过伸长和增殖两段重复继代培养方式，进行N次培养，继代芽产量大幅度提高，增殖系数达到6.8以上，为松属树种速生丰产、优质高效造林提供优良无性系苗木，具有较好的经济效益和社会效益。

具体实施方式

    下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

1、实验材料

以马尾松当年成熟球果种子萌发无菌苗顶芽为外植体，球果采自广西忻城古蓬优良种源营建的马尾松种子园。

2、实验方法

（1）无菌外植体选择与无菌处理

将新采收的球果先在太阳光下晾晒，待球果鳞片张开后轻轻抖落出种子，用塑料袋将种子装好置于4℃冰箱冷藏备用。将冷藏一周的种子从冰箱取出，用0.5%高锰酸钾溶液浸泡15 min，然后经流水冲洗5 min，去离子水浸泡12 h后，0.1%升汞消毒40 min，无菌水冲洗5次，直接播于经高温高压灭菌处理的沙子基质中进行种子萌发。选取生长健壮萌发种子苗顶芽（保留1 cm长下胚轴）接种到0激素的改良MS培养基，进行无菌外植体筛选。

所述的改良MS培养基的基本组成为：KNO₃ 1650 mg·L^-1；NH₄NO₃ 600 mg·L^-1；CaCl₂·2H₂O 260 mg·L^-1；MgSO₄·7H₂O 370 mg·L^-1；Ca(NO₃)₂·4H₂O 400 mg·L^-1；KH₂PO₄ 170 mg·L^-1；MnSO₄·H₂O 22.3 mg·L^-1；ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg·L^-1；CuSO₄·5H₂O 0.025 mg·L^-1；H₃BO₃  6.2 mg·L^-1；Na₂MoO₄·2H₂O 0.025 mg·L^-1；KI 0.83 mg·L^-1；CoCl₂·6H₂O 0.025 mg·L^-1；维生素B₁ 1.0 mg·L^-1；维生素B₆ 0.5 mg·L^-1；烟酸 0.5 mg·L^-1；甘氨酸 2.0 mg·L^-1；肌醇 200 mg·L^-1。

（2）丛生芽诱导

将无菌外植体从0激素改良MS基本培养基中移出，切掉其下胚轴基部直至约0.5 cm长，然后接种到改良MS+6-BA 3.0 mg·L^-1+NAA 0.05 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1的培养基上进行诱导培养。培养条件为24±1℃，光照0-2000 lx（第一周为暗培养），每天光照16 h，pH值为5.8。培养18 d后，平均丛芽诱导率达97.4%。

（3）丛生芽伸长

将诱导出的丛生小芽转接到改良MS++NAA 0.25 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1伸长培养基上，以促进培养物的伸长生长。培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：2000 lx，pH值为5.8。伸长培养22 d，丛芽高3-5 cm。

（4）继代芽培养

将丛生芽中株高2-3 cm的单芽剪下，接种到改良MS培养基+6-BA 1.5 mg·L^-1+KT 0.8 mg·L^-1+NAA 0.2 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1上进行继代芽增殖。培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：2000 lx，pH值为5.8，继代增殖周期16-21 d。

将继代增殖芽放到步骤（3）伸长培养基上，以促进继代增殖芽伸长。培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：2000 lx，pH值为5.8。伸长培养24-28 d，继代增殖芽高3-5 cm。将伸长继代芽分成2 cm长顶芽及1 cm长带侧芽芽段后，重复步骤（4）继代增殖和步骤（3）丛芽伸长。继代培养5次，平均增殖系数6.8。

实施例2

1、实验材料

以马尾松当年成熟球果种子萌发无菌苗顶芽为外植体，球果采自广西宁明桐棉等优良种源营建的马尾松种子园。

2、实验方法

（1）无菌外植体选择与无菌处理

将新采收的球果先在太阳光下晾晒，待球果鳞片张开后轻轻抖落出种子，用塑料袋将种子装好置于4℃冰箱冷藏备用。将冷藏一周的种子从冰箱取出，用0.5%高锰酸钾溶液浸泡15 min，然后经流水冲洗5 min，去离子水浸泡12 h后，0.1%升汞消毒40 min，无菌水冲洗5次，直接播于经高温高压灭菌处理的沙子基质中进行种子萌发。选取生长健壮萌发种子苗顶芽（保留1 cm长下胚轴）接种到0激素的改良MS培养基，进行无菌外植体筛选。所述的改良MS培养基的基本组成同实施例1。

（2）丛生芽诱导

将无菌外植体从0激素改良MS基本培养基中移出，切掉其下胚轴基部直至约0.5 cm长，然后接种到改良MS+6-BA 4.0 mg·L^-1+NAA 0.1 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1的培养基上进行诱导培养。培养条件为24±1℃，光照0-2000 lx（第一周为暗培养），每天光照16 h，pH值为5.8。培养25 d后，平均丛芽诱导率达98.1%。

（3）丛生芽伸长

将诱导出的丛生小芽转接到改良MS++NAA 0.35 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1伸长培养基上，以促进培养物的伸长生长。培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：2000 lx，pH值为5.8。伸长培养25 d，丛芽高3-5 cm。

（4）继代芽培养

将丛生芽中株高2-3 cm的单芽剪下，接种到改良MS培养基+6-BA 3.0 mg·L^-1+KT 1.0 mg·L^-1+NAA 0.3 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1上进行继代芽增殖。培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：2000 lx，pH值为5.8，继代增殖周期20 d。

将继代增殖芽放到步骤（3）伸长培养基上，以促进继代增殖芽伸长。培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：2000 lx，pH值为5.8。伸长培养26 d，继代增殖芽高3-5 cm。将伸长继代芽分成2 cm长顶芽及1 cm长带侧芽芽段后，重复步骤（4）继代增殖和步骤（3）丛芽伸长。继代培养4次，平均增殖系数7.2。

实施例3

1、实验材料

以湿地松当年成熟球果种子萌发无菌苗顶芽为外植体，球果采自广西区博白县国有博白林场优良家系博白1号、博白2号。

2、实验方法

（1）无菌外植体选择与无菌处理

将新采收的球果先在太阳光下晾晒，待球果鳞片张开后轻轻抖落出种子，用塑料袋将种子装好置于4℃冰箱冷藏备用。将冷藏一周的种子从冰箱取出，用0.5%高锰酸钾溶液浸泡15 min，然后经流水冲洗5 min，去离子水浸泡12 h后，0.1%升汞消毒40 min，无菌水冲洗5次，直接播于经高温高压灭菌处理的沙子基质中进行种子萌发。选取生长健壮萌发种子苗顶芽（保留1 cm长下胚轴）接种到0激素的改良MS培养基，进行无菌外植体筛选。所述的改良MS培养基的基本组成同实施例1。

2）丛生芽诱导

将无菌外植体从0激素改良MS基本培养基中移出，切掉其下胚轴基部直至约0.5 cm长，然后接种到改良MS+6-BA 2.0-3.5 mg·L^-1+NAA 0.05-0.08 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1的培养基上进行诱导培养。培养条件为24±1℃，光照2000 lx，每天光照16 h，pH值为5.6。培养24-26 d后，平均丛芽诱导率达97.0%。

3）丛生芽伸长

将诱导出的丛生小芽转接到改良MS+NAA 0.3-0.4 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1伸长培养基上，以促进培养物的伸长生长。培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：2000 lx，pH值为5.6。伸长培养24-28 d，丛芽高3-5 cm。

4）继代芽培养

将丛生芽中株高2-3 cm的单芽剪下，接种到改良MS培养基+6-BA 2.0-3.0 mg·L^-1+KT 0.6-1.0 mg·L^-1+NAA 0.15-0.25 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1上进行继代芽增殖。培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：2000 lx，pH值为5.6，继代增殖周期15-20 d。

将继代增殖芽放到步骤（3）伸长培养基上，以促进继代增殖芽伸长。培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：2000 lx，pH值为5.8。伸长培养23-28 d，继代增殖芽高3-5 cm。将伸长继代芽分成2 cm长顶芽及1 cm长带侧芽芽段后，重复步骤（4）继代增殖和步骤（3）丛芽伸长。继代培养4次，平均增殖系数7.5。

实施例4

1、实验材料

以湿加松当年成熟球果种子萌发无菌苗顶芽为外植体，种子是从澳大利亚直接引进优良种质资源。

2、实验方法

（1）无菌外植体选择与无菌处理

将置于4℃冰箱冷藏备用一周的种子从冰箱取出，用0.5%高锰酸钾溶液浸泡15 min，然后经流水冲洗5 min，去离子水浸泡12 h后，0.1%升汞消毒40 min，无菌水冲洗5次，直接播于经高温高压灭菌处理的沙子基质中进行种子萌发。选取生长健壮萌发种子苗顶芽（保留1 cm长下胚轴）接种到0激素的改良MS培养基，进行无菌外植体筛选。所述的改良MS培养基的基本组成同实施例1。

（2）丛生芽诱导

将无菌外植体从0激素改良MS基本培养基中移出，切掉其下胚轴基部直至约0.5 cm长，然后接种到改良MS+6-BA 2.5 mg·L^-1+NAA 0.065 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1的培养基上进行诱导培养。培养条件为24±1℃，光照1500-2000 lx，每天光照16 h，pH值为6.0。培养24 d后，平均丛芽诱导率达98.1%。

（3）丛生芽伸长

将诱导出的丛生小芽转接到改良MS+活性炭3000 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1伸长培养基上，以促进培养物的伸长生长。培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：1500-2000 lx，pH值为6.0。伸长培养26 d，丛芽高3-5 cm。

（4）继代芽培养

将丛生芽中株高2-3 cm的单芽剪下，接种到改良MS培养基+6-BA 1.5 mg·L^-1+NAA 0.1 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1上进行继代芽增殖。培养温度：24±1℃，光照培养时间：18 h，光照强度：1500-2000 lx，pH值为6.0，继代增殖周期20 d。

将继代增殖芽放到步骤（3）伸长培养基上，以促进继代增殖芽伸长。培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：1500-2000 lx，pH值为6.0。伸长培养28 d，继代增殖芽高3-5 cm。将伸长继代芽分成2 cm长顶芽及1 cm长带侧芽芽段后，重复步骤（4）继代增殖和步骤（3）丛芽伸长。继代培养8次，平均增殖系数8.2。

实施例5

1、实验材料

以湿加松当年成熟球果种子萌发无菌苗顶芽为外植体，种子是从澳大利亚直接引进优良种质资源。

2、实验方法

（1）无菌外植体选择与无菌处理

将置于4℃冰箱冷藏备用一周的种子从冰箱取出，用0.5%高锰酸钾溶液浸泡15 min，然后经流水冲洗5 min，去离子水浸泡12 h后，0.1%升汞消毒40 min，无菌水冲洗5次，直接播于经高温高压灭菌处理的沙子基质中进行种子萌发。选取生长健壮萌发种子苗顶芽（保留1 cm长下胚轴）接种到0激素的改良MS培养基，进行无菌外植体筛选。所述的改良MS培养基的基本组成同实施例1。

（2）丛生芽诱导

将无菌外植体从0激素改良MS基本培养基中移出，切掉其下胚轴基部直至约0.5 cm长，然后接种到改良MS+6-BA 3.0 mg·L^-1+NAA 0. 08 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1的培养基上进行诱导培养。培养条件为24±1℃，光照1500-2000 lx，每天光照16 h，pH值为6.0。培养26 d后，平均丛芽诱导率达98.7%。

（3）丛生芽伸长

将诱导出的丛生小芽转接到改良MS+活性炭5000 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1伸长培养基上，以促进培养物的伸长生长。培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：1500-2000 lx，pH值为6.0。伸长培养27 d，丛芽高3-5 cm。

（4）继代芽培养

将丛生芽中株高2-3 cm的单芽剪下，接种到改良MS培养基+6-BA 2.0 mg·L^-1+NAA 0.2 mg·L^-1+蔗糖30000 mg·L^-1+琼脂3500 mg·L^-1上进行继代芽增殖。培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：1500-2000 lx，pH值为6.0，继代增殖周期19 d。

将继代增殖芽放到步骤（3）伸长培养基上，以促进继代增殖芽伸长。培养温度：24±1℃，光照培养时间：16 h，光照强度：1500-2000 lx，pH值为6.0。伸长培养27 d，继代增殖芽高3-5 cm。将伸长继代芽分成2 cm长顶芽及1 cm长带侧芽芽段后，重复步骤（4）继代增殖和步骤（3）丛芽伸长。继代培养8次，平均增殖系数8.6。